Name: Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Aprenda um ensaio de cálcio de alta produtividade para estudar receptores NMDA usando células HEK 293 transduzidas com subunidades NR1 e NR2A. Este método permite analisar a modulação por pequenas moléculas para aplicações terapêuticas em doenças neurológicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores gostaria de agradecer o Post Bacharelado Scholars Program Office e Novartis institutos para investigação biomédica como um todo para o financiamento deste estudo.

1. preparação das células
Nota: Este protocolo, incluindo a geração de dados, usa HEK293 células transfectadas com um baculovirus codificação NR1 e NR2A células.
<ol><li>O número adequado de células HEK293 de sementes e adicionar o vírus NR1 e/ou NR2A nas concentrações finais apropriadas (1,00 µ l cada). Para uma placa de 384, use 10.000 células/poço em um volume final de 30 µ l.</li>
	<li>Alternativamente, as sementes células HEK293-NR1-NR2A o número de célula apropriada e volume (por um prato de 384-bem, uso 10.000 células/poço em um volume final de 30 µ l). Adicionar tetraciclina na concentração de 2 µ g/mL para induzir a expressão NR2A e adicionar a proteção composta (100 µM MDL105, 519 ou 5 µM CGP07066724).</li>
	<li>Nota: O baculovirus codificação NR1 e NR2 devem ter um título aproximado entre 5 x 109 - 10 x 109 unidade infecciosa por mililitro24.</li>
</ol>2. medida da atividade do receptor NMDA
<ol><li>Prepare uma placa de 384 com células HEK293 transfectadas com células NR1/NR2 ou HEK293-NR1-NR2A na presença de compostos de qualquer proteção. Use um fundo transparente, moldura preta, placa revestida de poli-D-lisina. Nota: Proteção com 100 µM MDL105, 519 é usado para conferir a sensibilidade a glicina, enquanto 5 µM CGP070667 é usado para conferir a sensibilidade ao glutamato.</li>
	<li>Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO2 por 16 horas (durante a noite).</li>
	<li>Retirar a placa da incubadora e suavemente, descartar a mídia celular por abrandar capotar um recipiente de resíduos biológicos compatível com a placa. Bata levemente a placa sobre uma toalha de papel para limpar a mídia fora as bordas da placa e todos os restantes meios de drenagem.</li>
	<li>Prepare o corante calcium6 por solubilizing, um frasco de tintura de calcium6 (1 tamanho da placa) em 10 mL de tampão de incubação (HBSS pH 7,5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, probenecida 1 mM). Incube a placa por 2 horas a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Retirar a placa da incubadora e deixar que as células ajustar a temperatura ambiente por 10 minutos.</li>
	<li>Despeje delicadamente o corante calcium6, conforme descrito na etapa 2.3 e adicione 30 µ l de tampão do ensaio (HBSS pH 7,5, 20 mM HEPES, 1.8 mM CaCl2, probenecida 1 mM).</li>
	<li>Repita a etapa 2.6 duas vezes para um total de 3 lavagens. Deixe 30 µ l de buffer de ensaio sobre as células após a última lavagem.</li>
	<li>Deixe que as células descansar por 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare a placa de ligante, fazendo um 4-fold estoque de 400 µM de glicina e o glutamato 400 µM (concentração final de 100 µM; concentração ideal de ligantes para ser determinada conforme descrito abaixo). Transferi um mínimo de 25 µ l de estoque de ligante para uma placa de 384 V-fundo.</li>
	<li>Carrega o ligante e chapa de célula para o FDSS (sistema de rastreio de drogas funcional).</li>
	<li>Medir a fluorescência de base (Fó) da placa de celular por 30 segundos. Transferi 10 µ l do estoque de ligante para a placa de células usando a função aplicadora FDSS e medida do fluxo de cálcio por fluorescência calcium6-corante para 5 minutos de gravação.</li>
	<li>Calcule a relação de fluorescência máxima dividindo a fluorescência máxima obtida por fluorescência de base (F/f demáximoó).</li>
</ol>3. otimização de níveis de expressão de NMDAR
<ol><li>Para determinar a quantidade ideal de baculovirus para utilizar, execute uma titulação do vírus tanto NR1 e NR2A. Preparar uma placa de 384 com células HEK293 (recomendação de 10.000 células/poço, 30 µ l de mídia) e incluem os compostos de proteção conforme descrito no passo 2.1.</li>
	<li>Adicionar diferentes quantidades do vírus NR1 em linhas diferentes da placa (por exemplo: Adicionar µ l 0, 2 µ l, 1 µ l, 0,5 µ l, 0,25 µ l em linhas A-E, respectivamente). Adicione duplicatas para a precisão dos dados.</li>
	<li>Adicionar diferentes quantidades do vírus NR2A em diferentes colunas da placa (por exemplo: Adicionar µ l 0, 2 µ l, 1 µ l, 0,5 µ l, 0,25 µ l em linhas A-E, respectivamente). Adicione duplicatas para a precisão dos dados.</li>
	<li>Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO2 por 16 horas (durante a noite).</li>
	<li>Determine a melhor relação qualidade e quantidade dos vírus NR1 e NR2A realizando uma medição de fluxo de cálcio sobre o FDSS (veja acima).</li>
</ol>4. ligante titulação
<ol><li>Prepare as células conforme descrito na etapa 2.3.</li>
	<li>Prepare diluições de cada ligante na presença de concentrações (100 µM) para impregnação do outro ligante como 4-fold solução estoque. Por exemplo: para uma concentração de 10 µM teste final de glicina, prepare uma solução stock de 40 µM de glicina, incluindo 400 µM glutamato.</li>
	<li>Prosseguir com a medição de FDSS conforme descrito na etapa 2.11.</li>
</ol>5. compostos de teste
<ol><li>Prepare as células conforme descrito na etapa 1.</li>
	<li>Prepare a placa de ligante com um 5-fold estoque de concentração final de ligante no buffer de ensaio.</li>
	<li>Prepare a placa de compostos com o 4-fold estoque de concentração final desejada de compostos no buffer de ensaio. Para uma concentração final de composto de 10 µM no buffer de ensaio, prepare uma solução stock de 40 µM.<ol>
<li>Manter a concentração do dimetilsulfóxido (DMSO) constante em todas as amostras através da elaboração de uma pré-diluição do composto em DMSO antes mais diluição para o buffer de ensaio.</li>
		<li>Para uma resposta de dose do composto no ensaio final variando entre 3 e 30 µM, prepare uma diluição prévia do composto em DMSO, variando de 1 a 10 mM. Dilua os no buffer de ensaio para a concentração das ações 4-fold. A concentração final do DMSO não deve exceder 0,5%. Nota: É recomendável testar cada amostra em triplica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carrega o ligante, composto e placa de células no FDSS.</li>
	<li>Medir a fluorescência de base por 30 segundos.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de estoque composto e medir a fluorescência por 5 minutos.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de estoque de ligante e medir a fluorescência por 5 minutos.</li>
	<li>Determine a integral da relação de fluorescência, calculando a área sob a curva dos rácios fluorescentes durante os últimos 5 minutos da medição. Nota: Como alternativa, a proporção máxima de fluorescência após adição de ligante pode ser usada para análise.</li>
</ol>

<ol><li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li>
<li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional%2C+lifespan+and+systems+vulnerability+view%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li>
<li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li>
<li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+ion+channels%3A+structure%2C+regulation%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li>
<li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li>
<li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li>
<li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li>
<li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+subunit+diversity%3A+impact+on+receptor+properties%2C+synaptic+plasticity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383(2013).</li>
<li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+NMDA+receptor+composition%3A+many+regulators%2C+many+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li>
<li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition%3A+limitations+of+the+pharmacological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li>
<li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors%3A+mechanisms+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li>
<li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPARs+and+synaptic+plasticity%3A+the+last+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li>
<li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li>
<li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li>
<li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+block+by+Mg2%2B+of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li>
<li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li>
<li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li>
<li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases%3A+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li>
<li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li>
<li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li>
<li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A%2C+R1-2B%2C+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li>
<li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+and+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine%2FD-serine%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608(2017).</li>
<li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li>
<li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li>
<li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A%2F2A%2C+rather+than+1A%2F2B+receptor+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li>
<li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors%3A+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li>
<li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesses e nada de divulgar.

O sucesso deste teste depende em grande parte a saúde das células HEK usado. Células em fase de crescimento exponencial e com número baixo de passagem deve ser usado. Este ensaio envolve muitas transferências e adições de soluções, usando então cuidado irão garantir maior precisão em seus resultados. Concentrações de compostos e todos os outros reagentes devem ser também cruzados para minimizar erros. Quando substituir a mídia celular com o buffer de ensaio para o ensaio de fluxo de cálcio, a placa deve ser inclinada sua...

Com os atuais avanços na medicina, a expectativa de vida aumentou significativamente; no entanto, então tem a prevalência de doenças relacionadas com a idade. Doenças do sistema nervoso central (CNS) tais como esquizofrenia, esclerose lateral amiotrófica (ela), doença de Alzheimer e doença de Parkinson, entre outros, não são excepção e tem sido projetadas para aumentar ao longo da próxima década1, 2 , 3. o mau funcionamento dos receptores de glutamato de geleificação conhecido como receptores N-metil-D-aspartato (NMDAR) tem sido associado a doença de Alzheimer, esquizofrenia, traumatismo crânio-encefálico, acidente vascular cerebral, diabetes e glaucoma, entre outros, que garante a precisa estudar sua biologia para o desenvolvimento de terapias eficazes, doença-modificando4,5,6,7.
Os NMDARs são compostos de quatro monômeros ou subunidades4,8,9. A composição estrutural do NMDAR mostra variabilidade regional e de desenvolvimento dentro do cérebro7,10. Os NMDARs estão envolvidos na plasticidade sináptica, cognição e a geração de ritmos para respiração e locomoção11,12,13. Como um canal de voltagem-dependente, é em grande parte não-condutor no potencial de membrana de repouso (-70 mV) e é bloqueado por magnésio para prevenir mais permeação de íons. O canal é activado pela ligação de dois ligantes, glutamato e a glicina/D-serina, e uma despolarização simultânea na membrana sináptica mediada por receptores de GABA, outra subclasse de receptores de glutamato de geleificação. A despolarização remove o bloqueio de magnésio de NMDAR, permitindo o influxo de cátions, particularmente cálcio14,15,16. Mesmo que a ativação do NMDAR é essencial para a sobrevivência da pilha, ativação excessiva pode levar à morte17,18,19 através da excitotoxicidade da pilha. Isso, além da natureza complexa do receptor, torna desafiador para realizar estudos necessários para o desenvolvimento de terapias eficazes.
Diferentes métodos têm sido desenvolvidos para estudar o NMDAR. No entanto, cada um tem que acompanha ressalvas. Por exemplo, uma técnica amplamente utilizada é um ensaio baseado em fluorescência que mede mudanças NMDAR-mediada em cálcio intracelular em uma linha de celular estável sob o controle de um promotor inducible-tetraciclina (Tet-On)20. No entanto, neste sistema, as concentrações de supramaximal de ligantes que são necessários e a exigência de que os inibidores NMDAR estão presentes durante a medição torna quase impossível de detectar atividade da antagonista competitivo. Em outros sistemas similares, a expressão do receptor funcional provoca toxicidade, exigir que os bloqueadores de canais como a cetamina21,22 para preservar as culturas de células. Estes bloqueadores dos canais de sentar-se no núcleo do receptor e são difíceis de lavar, especialmente em um formato baseado em placa, para que eles interfiram com estudos funcionais do receptor. Finalmente, em medidas eletrofisiológicas tais como remendo aperto, há produção limitada, e estudos em grande escala são muito caro23. Não obstante, os sistemas acima são insensíveis à estimulação de glicina; Portanto, estudando a atividade de glicina-dependente do NMDAR torna-se um desafio.
Aqui, descrevemos uma nova abordagem para o estudo NMDAR que supera as limitações discutidas. Nossa técnica capitaliza sobre o sistema de expressão de baculovirus para expressar o receptor em níveis funcionais, com uma óptima relação das subunidades em menos de 16 horas. Além disso, o uso de baculovirus permite uma abordagem simples e combinatória, que fornece uma ampla caracterização dos subtipos distintos de NMDAR recombinantes. Ao contrário de outros ensaios, este protocolo não requer bloqueadores de canal por causa do uso de antagonistas fracos. Mais forte vantagem do método é aquele fracassado depois do antagonista fraco, o receptor é sensível a modulação dos sites individual glicina e o glutamato vinculação - além de modulação dual de glicina/D-serina e glutamato ligand-ligação sites. O ensaio recapitula a farmacologia conhecida do receptor NMDAR e os efeitos de seus conhecidos moduladores positivos e negativos. Finalmente, a geração deste ensaio celular em vitro supera a toxicidade celular causada pelo influxo excessivo de cálcio e permite estudos funcionais do receptor em uma moda de alta produtividade, que pode acelerar as descobertas de moduladores NMDAR Estados de doença.

<table><tbody><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Linha Celular Receptora Humana NMDA (NR1 / NR2A)</td><td>ChanTest Corporation</td><td>CT6120</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac Vetor de Dupla Expressão</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10712-024</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3844</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Cálcio 6-QF Kit</td><td>de Ensaio Molecular Dispositivos</td><td>R8192</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>D-serina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4250</td><td></td></tr><tr><td>L701,324</td><td>Tocris</td><td>907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Boston Bio Product</td><td>BB-103</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Cloreto de Magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>VWR</td><td>E506</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Probenecida</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, mídia GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>MDL105,519</td><td>NIBR</td><td>Sintetizado internamente</td><td></td></tr><tr><td>NVP-AAM077</td><td>NIBR</td><td>Sintetizado internamente</td><td></td></tr><tr><td>CGP070667</td><td>NIBR</td><td>Sintetizado internamente</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores nmda com sensibilidade de glicina/d-serina e glutamato

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

Receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) (NMDAR) são classificados como receptores de glutamato de geleificação e têm papel crítico na aprendizagem e memória. Mau funcionamento do NMDAR, expressado como qualquer over - ou under - activity causada por mutações, expressão alterada, tráfico ou localização, pode contribuir para inúmeras doenças, especialmente no sistema nervoso central. Portanto, compreender a biologia do receptor, bem como facilitar a descoberta de compostos e moléculas pequenas é crucial nos esforços em curso para combater doenças neurológicas. As abordagens atuais para estudar o receptor têm limitações, incluindo a incapacidade para estudar suas habilidades funcionais devido a necessária presença de bloqueadores de canais para evitar excitotoxicidade mediada por NMDAR, alto custo e baixa taxa de transferência. Além disso, os sistemas existentes de ensaio são sensíveis à estimulação por glutamato apenas e faltam de sensibilidade à estimulação por glicina, o outro ligante co do NMDAR. Aqui, apresentamos o primeiro ensaio baseado em placa de poder elevado-throughput para estudar um receptor NMDA com sensibilidade para ambos os ligantes co, glutamato e D-serina/glicina. Esta abordagem permite o estudo de diferentes composições de subunidade NMDAR e permite estudos funcionais do receptor em modos de glicina e / ou sensíveis ao glutamato. Além disso, o método não requer a presença de inibidores durante as medições. Os efeitos de moduladores alostéricos positivos e negativos podem ser detectados com este ensaio e a farmacologia conhecida de NMDAR foi replicada em nosso sistema. Esta técnica supera as limitações dos métodos existentes e é rentável. Acreditamos que esta nova técnica irá acelerar a descoberta de terapias para patologias NMDAR-mediada.

Antes de testar os efeitos de pequenas moléculas, deve-se determinar os níveis de expressão ideal dos NMDARs, bem como as concentrações de ligante óptima. Conforme descrito, HEK293 células foram semeadas em 10.000 células por poço em uma placa de 384, na presença de 5 µM, CGP060667, então transfectadas com quantidades variadas de NR1 e NR2A vírus. Depois de cálcio durante a noite, induzida pelo ligante de incubação foi medido o fluxo (Figura 1). Os resultados...

O objetivo do presente protocolo é facilitar o estudo dos receptores de NMDA (NMDAR) em uma escala maior e permitir a análise dos efeitos moduladora de pequenas moléculas e suas aplicações terapêuticas.

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Este método pode ajudar na descoberta de moduladores NMDA para tratar doenças neurológicas. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o estudo da fissoma da atividade do receptor NMDA, em resposta a concentrações de defesa ou combinações de ligantes em compostos. Portanto, este método pode fornecer informações sobre a capacidade geral do receptor NMDA.Também pode ser aplicado para estudar subtipos específicos em biologia e uma sensibilidade do receptor NMDA, em resposta a ligantes ou compostos. Para medir a atividade do receptor NMDA, prepare uma placa de 384 poços, com células HEK 293, transduzidas com células NR1, NR2 ou HEK 293, NR1, NR2A na presença de composto protetor. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por 16 horas.No dia seguinte, remova a placa da incubadora e descarte cuidadosamente a mídia celular, virando lentamente a placa sobre um recipiente de biorresíduos compatível. Bata suavemente a placa em uma toalha de papel para limpar a mídia das bordas da placa e drene qualquer mídia restante. Em seguida, prepare o corante de cálcio 6, solubilizando um frasco de corante de cálcio 6, em 10 mililitros de tampão de i

a-high-throughput-calcium-flux-assay-to-study-nmda-receptors-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo fornece um protocolo detalhado para o estudo do perfil farmacológico dos direitos humanos TRPA1 canais usando FlexStation 3. O protocolo abrange detalhes de preparação das células, carregando corante e operação do leitor de microplacas, FlexStation 3.

Baseados em células de Ensaio de cálcio para Médio a High Throughput Screening de Funções TRP usando FlexStation Canal 3

Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores...

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Aqui, descrevemos a configuração, navegação software e análise de dados para um método espacial e temporalmente precisa de medir a tônica e fásica mudanças glutamato extracelulares in vivo utilizando matrizes de microeletrodos ligado a enzima (MEA).

Utilizando biossensores baseados em Enzyme medir Tonic e Phasic glutamato na doença de Alzheimer rato Models

Excitabilidade neuronal pode ser modulada através de um processo dinâmico de endo e exocitose de geleificação excitatório glutamato receptores. Aqui descrito é um ensaio acessível, alto teor para quantificação de receptores de superfície e interno população piscinas.

Um ensaio de alto teor para monitoramento Leandro tráfico de Receptor

Apresentamos um protocolo para avaliar o equilíbrio entre liberação de glutamato e liberação em sinapses glutamatergicas corticostriatais únicas em fatias agudas de camundongos adultos. Este protocolo usa o sensor fluorescente iGluu para detecção de glutamato, uma câmera sCMOS para aquisição de sinal e um dispositivo para iluminação a laser focal.

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Aqui apresentamos um protocolo para medir fluxos in vitro ca2+ em neurônios de cérebro médio e seus efeitos a jusante no caspase-3 usando culturas primárias de cérebro médio do rato. Este modelo pode ser empregado para estudar alterações fisiosiopatológicas relacionadas à atividade anormal do Ca2+ em neurônios do cérebro médio, e para tela de novas terapêuticas para propriedades anti-apoptóticas.

Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Aprenda um ensaio de cálcio de alta produtividade para estudar receptores NMDA usando células HEK 293 transduzidas com subunidades NR1 e NR2A. Este método permite analisar a modulação por pequenas moléculas para aplicações terapêuticas em doenças neurológicas.

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato (Vídeo) | JoVE Journal

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

Explorar mais vídeos