Quantificação de proteínas solúveis vegetais e carboidratos digeríveis conteúdo, usando o milho (Zea mays) como um Exemplar

Este método permite que pesquisadores no campo das ciências vegetais e ecologia nutricional meçam com precisão as concentrações de proteínas solúveis e carboidratos digeríveis no tecido vegetal. A principal vantagem dessas técnicas é que elas oferecem um método rápido e fácil para quantificar esses dois macronutrientes incrivelmente importantes com alta precisão. Essas técnicas têm fortes implicações para o campo da ecologia porque as proteínas vegetais e os carboidratos constituem a base das teias alimentares terrestres.

Geralmente, indivíduos novos nessa técnica podem ter dificuldades porque existem várias etapas e algumas técnicas que não são comumente realizadas em um laboratório de uso geral. Para começar, pese amostras replicadas de cada tecido em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulados. Em seguida, registre a massa precisa de cada amostra.

Usando um micropipetador, adicione 500 microlitros de hidróxido de sódio 0,1 molar a cada tubo. Feche bem as tampas e aqueça os tubos por 30 minutos. Em seguida, coloque os tubos em banho-maria pré-aquecido por 15 minutos.

Em seguida, centrifugue os tubos a 15 000 G durante 10 minutos. Pipete o sobrenadante em novos tubos de microcentrífuga rotulados, usando uma nova ponta de pipeta para cada amostra. Adicione 300 microlitros de hidróxido de sódio 0,1 molar ao pellet e repita a centrifugação por 10 minutos.

Em seguida, retirar o sobrenadante e transferi-lo para os tubos que contêm o sobrenadante da primeira centrifugação. Para neutralizar o pH do sobrenadante, adicione 11 microlitros de ácido clorídrico 5,8 molar. Use papel de tornassol para confirmar que o pH é aproximadamente sete.

Em seguida, adicione 90 microlitros de ácido tricloroacético a 100% a cada tubo. Em seguida, incube os tubos no gelo por 30 minutos. Centrifugar as amostras a 13 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Use cuidadosamente uma linha de vácuo e uma ponta de micropipeta de vidro para remover o ácido tricloroacético. Tenha muito cuidado para não perturbar o pellet com a ponta de sucção. Em seguida, lave o pellet com 100 microlitros de acetona resfriada a 20 graus Celsius e, em seguida, deixe a acetona evaporar em uma capela de exaustão.

Dissolva o pellet de proteína com um mililitro de hidróxido de sódio. Rodadas adicionais de aquecimento, vórtice e aquecimento sônico podem ser necessárias. Adicione 160 microlitros de cada solução padrão IGG a uma placa de 96 poços em triplicata, começando com a posição A1 Em seguida, em um novo tubo de 1,5 mililitro, adicione 50 microlitros de cada solução de amostra a 950 microlitros de água destilada.

Em seguida, adicione 60 microlitros de cada amostra diluída à placa do poço em triplicata, começando com a posição H1. Adicione 100 microlitros de água destilada a todos os poços de amostra em branco e desconhecidos. Usando uma pipeta multicanal, adicione 40 microlitros de corante proteico Coomassie Brilliant Blue G-250 a cada poço da placa.

Usando uma agulha, estoure todas as bolhas presentes nos poços. Depois disso, deixe a placa incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, use um espectrofotômetro de microplacas para registrar os valores de absorbância para cada poço em 595 nanômetros.

Primeiro, pese as réplicas de cada amostra de tecido em tubos de vidro de 15 mililitros. Rotule os tubos e registre a massa exata de cada amostra. Em seguida, adicione um mililitro de ácido sulfúrico 0,1 molar a cada tubo e feche bem as tampas.

Em seguida, coloque os tubos em banho-maria fervente por uma hora. Transfira os tubos para um banho-maria morno para esfriar. Em seguida, despeje o conteúdo dos tubos em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulados.

Após esta centrífuga tubos a 15.000 G por 10 minutos. Use uma micropipeta para transferir o sobrenadante para novos tubos rotulados de 1,5 mililitro. Usando uma pipeta, transfira 15 microlitros de cada amostra desconhecida para seu próprio tubo de ensaio.

Em seguida, adicione 385 microlitros de água destilada a cada tubo. Em uma capela de exaustão, adicione 400 microlitros de 5% de fenol a cada tubo de ensaio de amostra padrão e desconhecido. Imediatamente depois, adicione dois mililitros de ácido sulfúrico a cada tubo.

Certifique-se de adicionar o ácido sulfúrico à superfície da solução. Depois de incubar os tubos por 10 minutos, vórtice os tubos. Em seguida, incube o tubo por mais 30 minutos.

Transfira 800 microlitros de cada tubo de amostra para três semimicrocuvetes de poliestireno de 1,5 mililitro. Em seguida, ajuste o espectrofotômetro para ler em 490 nanômetros e calibre com uma cubeta em branco. Por fim, passar cada cubeta pelo espectrofotómetro e registar a absorvência.

Utilizando este protocolo, foram analisados os teores de proteína solúvel e carboidratos digestíveis de quatro diferentes tecidos de milho doce e de campo de três regiões geográficas. Diferenças significativas no teor de proteína solúvel foram observadas entre as regiões, necessitando de análises separadas para cada região. Entre as regiões, houve várias diferenças no teor de proteína solúvel e carboidratos digestíveis entre os tecidos.

Em Minnesota, os tecidos variavam apenas em teor de proteína solúvel, enquanto os tecidos da Carolina do Norte variavam em proteína solúvel e carboidratos digeríveis. A variabilidade no conteúdo de macronutrientes do tecido no Texas dependia da variedade. Essa técnica permitirá que pesquisadores no campo das ciências vegetais e ecologia nutricional meçam com precisão a proteína vegetal solúvel e os carboidratos digeríveis, em vez de extrapolar a partir de medidas elementares.

Não se esqueça de que trabalhar com nitrogênio líquido, ácidos e bases concentrados pode ser extremamente perigoso. Portanto, sempre use precauções como luvas, óculos de segurança, aventais e sapatos fechados sempre que trabalhar com esses produtos químicos.