Name: Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a produzir triterpenos em escala preparativa usando expressão transiente em folhas de Nicotiana benthamiana. Este método rápido e escalável permite a co-infiltração de múltiplas cepas de Agrobacterium para biosíntese de compostos de alto valor farmacêutico.

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Este trabalho foi apoiado por um Norwich Research Park Studentship (JR), a engenharia conjunta e Conselho de pesquisa de ciências físicas/biotecnológico e financiados pelo Biological Sciences Research Council BBSRC OpenPlant sintético biologia centro de investigação concedem (BB / L014130/1) (FIBROCIMENTOS, ENTRE OUTROS); uma troca de conhecimento do John Innes Centre e comercialização concedem (BB/KEC1740/1) (APA); e a concessão de programa estratégico do Instituto BBSRC 'Moléculas de natureza' (BB/P012523/1) e o John Innes Foundation (A.O.). Gostaríamos de agradecer a George Lomonossoff para fornecer os pEAQ vetores e Andrew Davis para a fotografia.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Coloque-através de-alto vácuo infiltração permite que este protocolo a ser usado rotineiramente em nosso laboratório para a produção preparativa triterpeno compostos de interesse para várias aplicações a jusante. O aparelho de vácuo infiltração descrito aqui é facilmente replicado. Adição do reservatório de vácuo é aconselhável diminuir o tempo necessário para puxar o vácuo necessário, no entanto, é possível simplesmente adaptar um forno de vácuo sem modificações como a câmara de infiltração. Proteger a bomba de vácuo através da adição de um condensador apropriado é teoricamente sensato, mas em nosso laboratório, encontrámos este é desnecessário.
Cobertura de infiltração é comprometida se as folhas não são totalmente imersa na suspensão de infiltração. Este problema é minimizado, garantindo que o nível da suspensão atinge a superfície superior do titular da planta, e que o titular de planta tem um ajuste apertado para o banho de infiltração. Observação da Figura 2 que a superfície superior do titular da planta é embutida para o banho de infiltração quando estava no lugar. Isto é conseguido através de painéis nas bordas médios do titular que formam o ponto de ancoragem com a parte superior do banho de infiltração. A suspensão de infiltração exigirá adições periódicas para manter o nível de suspensão. Isto é melhor conseguido pela adição de suspensão de infiltração em excesso para evitar a redução gradual do OD600 ao longo de uma grande infiltração batch-wise. No entanto, em nossas mãos, substituição por água não parece ter um efeito perceptível sobre rendimentos esperados em escala preparativa, embora isso não tenha sido quantitativamente investigada. Como muitas plantas podem estar infiltradas de um lote de suspensão de infiltração é ainda uma questão em aberto. Nós rotineiramente se infiltrar entre 100 e 200 plantas com um único lote de suspensão de infiltração. Além disso, é normal para um solo lixiviar para a suspensão de infiltração ao longo do processo de infiltração. Isto não foi encontrado para ter um efeito perceptível sobre a eficácia da infiltração.
Durante a colheita, é aconselhável (mas não críticos) para colher somente as folhas que foram infiltradas (algumas folhas terá crescido pós-infiltração). Colheita seletiva impede a diluição com tecido improdutiva, que caso contrário iria aumentar a proporção de impurezas endógenas relativo para o composto de interesse. Isto tem um impacto nominal sobre a facilidade de purificação a jusante e aumenta a escala destes processos. Ao usar o tHMGR para aumentar o fornecimento de precursor, um fenótipo necrosado é frequentemente observado a desenvolver ao longo do período de crescimento pós-infiltração. Isto é normal e realmente auxilia a colheita seletiva e o processo de secagem a jusante. O pó de folhas secas geralmente pode ser armazenado em um recipiente fechado em local fresco, seco e escuro, mas idealmente em um dessecador, sob vácuo. Isso depende da estabilidade do composto do interessado. Tenha cuidado se optar por armazenar em um freezer-80 ° C. Garantir que as secas folhas são em um recipiente impermeável e à saída do armazém, permitir que este recipiente para aquecer a temperatura ambiente antes da abertura. Para fazê-lo resultará em rewetting das folhas, dificultando o processamento de jusante.
As etapas pós-colheita no presente protocolo são fornecidas para fins ilustrativos, e para ajudar os pesquisadores que podem ter limitado a química prática experimentam. Eles podem ser substituídos por muitas outras técnicas de extração/purificação de produtos naturais. Conforme detalhado na introdução, PSE tem muitas vantagens, no entanto, o capital custo do aparelho comercialmente disponível do PSE pode ser proibitivo e não é essencial. Tratamento de resina de troca iônica básica é um método muito conveniente para substituir o tradicional saponificação seguida de particionamento de líquido/líquido. No entanto, não é apropriado para produtos contendo grupos carboxila ou grupos funcionais que iria ser hidrolisados sob condições básicas, tais como ésteres. Estes produtos se esperaria ser retidos na resina aniões. No entanto, há potencial para explorar isto para uma captação e liberação de procedimento (não documentado). Onde saponificação tradicional seria adequada, tratamento de resina de troca iônica básica serve como uma alternativa conveniente. O método de cromatografia descrito na etapa 9, foi encontrado para ser generalizados para os compostos descritos na Figura 3. No entanto, compostos de polaridade aumentada podem exigir um longo período de eluição de acetato de etila de 100%. Com referência a passo 9.2, purificação bem a jusante é inteiramente composto específico e também é dependente da escala. Repetidas rodadas de cromatografia flash de menor escala com gradientes otimizados, é geralmente suficiente para atingir um grau de pureza adequado para análise de NMR. Em escalas maiores, a cristalização é muitas vezes uma alternativa conveniente. Em casos difíceis, preparativa ou semipreparativa alta cromatografia líquida (HPLC) pode ser empregada dependendo da quantidade desejada de composto isolado. Exemplos de processos de purificação a jusante para uma gama de compostos representativos podem ser encontrados em outro lugar8.
O protocolo atual, tal como apresentado aqui, é usado rotineiramente em nosso laboratório e tem provado a utilidade. No entanto, há ainda ampla margem para mais otimização da plataforma de expressão. Trabalho está em andamento em nosso laboratório para investigar como mais engenharia de via e controle diferencial de níveis de expressão da proteína poderia melhorar a produção de triterpeno ainda mais, enquanto mediando toxicidade às células hospedeiras. Há também potencial para investigar a manipulação de sistemas de transporte intracelular20,21e a direção de enzimas para diferentes compartimentos celulares22,23, avenidas que poderiam melhorar a eficiência de vários eventos de oxidação. Benefícios potenciais para modificar a morfologia subjacente de organelas chaves também podem ser explorados. Por exemplo, a superexpressão do domínio de membrana de Arabidopsis thaliana HMGR tem sido observado para induzir a hipertrofia do retículo endoplasmático em plantas24; um site fundamental para atividade CYP450. Este protocolo é ideal para a produção de miligrama de grama-escala as quantidades de produtos triterpeno e pode ser empregado em um ambiente de pesquisa para acessar compostos para estudo a jusante (por exemplo, a exploração sistemática de estrutura-atividade relacionamentos e investigações preliminares em que as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de chumbo compostos de interesse clínico). No entanto, a plataforma é linearmente e confiantemente escalável simplesmente aumentando o número de plantas usadas e o sentido prático da expressão transiente através de agroinfiltration foi demonstrada em escala industrial para a produção de proteínas farmacêuticas 14, portanto há potencial para esta plataforma a ser estendido para a produção comercial de triterpenos de alto valor. Como alternativa, também é possível vislumbrar a produção de transformants estável, carregando o desejo finalizado multigene biossintético, permitindo o cultivo em massa e continuou 'agricultura' de transgénicos N. benthamiana cepas produção de diferentes compostos de valor comercial.

Os triterpenos são uma das maiores e mais estruturalmente diversas famílias de produtos naturais. Apesar de sua imensa diversidade, todos os produtos naturais do triterpeno são acreditados para ser derivado do mesmo precursor linear 2,3-oxidosqualene, um produto da via do mevalonato em plantas. Ciclização de 2,3-oxidosqualene é iniciada e controlada por uma família de enzimas denominadas oxidosqualene cyclases (OSCs). Esta etapa de ciclização representa o primeiro nível de diversificação, com centenas de andaimes triterpeno diferentes tendo sido reportados de natureza1. Estes andaimes são ainda mais diversificados ajustando enzimas, incluindo, mas não limitado a, citocromo p450s (CYP450s)1,2. Tais vias biossintéticas podem levar a imensa complexidade, às vezes resultando em produtos finais que são quase irreconhecível de triterpeno o pai. Por exemplo, a estrutura complexa do potente inseticida e antialimentar limonoide azadiractina é acredita para derivar de um triterpeno fosfatase do tirucallane tipo3.
Muitos derivados triterpeno produtos naturais, mesmo aqueles com andaimes pai relativamente inalterado, demonstraram possuir atividade biológica medicinalmente relevantes4,5,6,7. No entanto, até agora este potencial não traduziu em uma infinidade de drogas derivadas do triterpene na clínica. Este é sem dúvida (pelo menos parcialmente) uma consequência de acesso limitado de sintético prático para essa classe de composto, um problema que pode suprimir a exploração das relações estrutura-atividade e desenvolvimento de levar candidatos pelo tradicional medicinais fluxos de trabalho de química.
Expressão transitória da triterpeno enzimas biossintéticas de outras espécies de plantas, em folhas de s. benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno (Figura 1). Este processo pode ser usado para caracterizar funcionalmente enzimas candidato e reconstruir as vias biossintéticas de metabólitos importantes ocorrem naturalmente. De igual modo, também pode ser explorada em combinatórias abordagens biossintéticas para produzir produtos de romance triterpeno, uma estratégia que pode resultar em bibliotecas de análogos estruturalmente relacionadas, permitindo a exploração sistemática das relações estrutura-atividade de chumbo biologicamente ativo compostos de8,9.
Agroinfiltration é um meio eficiente e simples de alcançar a expressão transiente em folhas de s. benthamiana . O processo envolve a infiltração das folhas com uma suspensão de a. tumefaciens carregando a expressão binário construct(s) de interesse. Isto é conseguido através da aplicação de pressão que força o líquido sobre os estomas, deslocando o ar no espaço intercelular e substituí-lo com a suspensão da . tumefaciens . As bactérias transferem os respectivos DNAs-T para o interior das células vegetais, resultando na expressão de proteínas localizadas e transitória no tecido folha infiltrados.
Enquanto qualquer vetor binário adequado para gerar plantas transgênicas pode ser empregada para expressão transiente, nós utilizamos o feijão-caupi Mosaic Virus CPMV-derivado Hypertranslational (HT) proteína expressão sistema10, 11. neste sistema, o gene de interesse é ladeado por regiões untranslated (UTR) do RNA o CPMV-2. Os 5' UTR contém modificações, resultando em níveis muito elevados de translação de proteína com nenhuma dependência de replicação viral12. Esta técnica foi desenvolvida para a série de vetor binário de Easy-e-rápido (pEAQ) que inclui o site-specific recombinação clonagem compatível com o protocolo construções (pEAQ -HT- DEST)10,11. A maioria dos vetores pEAQ também contêm um tomate bushy stunt virus-derivado P19 silencioso supressor gene13 dentro a parte do T-DNA da fita expressão, que contorna a necessidade de coinfiltrate uma estirpe P19-carregando separada e proporciona muito expressão de proteínas de alto nível no acolhimento da planta célula10,11.
Uso do s. benthamiana , como um host de expressão tem vantagens particulares quando se trabalha com vias biossintéticas de planta. A arquitetura celular suporta intrinsecamente apropriado mRNA e processamento de proteína e compartimentalização adequada, além de possuir o necessárias co enzimas, redutases (para CYP450s) e precursores metabólicos. A fonte de carbono é fotossíntese; assim, as plantas simplesmente podem ser cultivadas em composto de boa qualidade, exigindo apenas água, CO2 (do ar) e luz solar como entradas. A plataforma também é extremamente conveniente para expressão co de diferentes combinações de proteínas, como isso pode ser conseguido facilely a infiltração de co de diferentes cepas de a. tumefaciens, eliminando a necessidade de construir grande expressão multigene fitas. Além disso, o processo pode ser linearmente e confiantemente escalado simplesmente aumentando o número de plantas utilizadas no experimento.
Trabalhos anteriores em nosso laboratório demonstrou a utilidade desta plataforma para experiências em escala preparativa. Isto incluiu a preparação de novos triterpenos para uso em ensaios de Bioatividade e escala até atingir quantidades de grama do produto isolado. Além disso, o acúmulo de produtos triterpeno heterogêneo pode ser aumentado vários dobram pela expressão co de uma forma N-terminal-truncada, diferenciação de gabarito de 3-hidroxi, 3-methyglutary-coenzima A redutase (tHMGR), um limitante upstream enzima na via do mevalonato8.
Chave para tais experiências em escala preparativa é a capacidade de convenientemente acima-escala o processo de infiltração. Em um experimento típico, dezenas a centenas de plantas podem ser necessária para alcançar a quantidade de destino do produto isolado. Infiltrando-se folhas individuais manualmente (usando uma seringa desnecessária) é operacionalmente exigentes e muitas vezes exageradamente demorado, tornando este método impraticável para escala-up de rotina. Infiltração de vácuo oferece vantagens sobre a infiltração de mão, pois não é dependente do nível de habilidade do operador e permite a infiltração de uma maior área de superfície da folha. Este procedimento é usado comercialmente para a produção em larga escala de proteínas farmacêutica14. Este protocolo utiliza um aparelho de infiltração facilmente replicável de vácuo, que pode ser construído a partir de peças disponíveis comercialmente. Isto permite a infiltração simultânea de até 4 plantas, proporcionando rápida e prática batch-wise infiltração de centenas de plantas em um curto período de tempo (Figura 2a -2b). O aparelho de vácuo infiltração consiste em um forno a vácuo que forma a câmara de infiltração (Figura 2f). O forno é ligado a uma bomba através de um reservatório de vácuo. Isso reduz muito o tempo necessário para atingir o vácuo desejado na câmara de infiltração. As plantas são fixadas em um suporte sob medido e invertidas em um banho de água de aço inoxidável de 10 L repleto da . tumefaciens suspensão (Figura 2a -2C). Imersão completa das partes aéreas das plantas é importante para a infiltração eficiente. O banho de água é então colocado dentro da câmara de infiltração (Figura 2d -2e) e o vácuo aplicado para desenhar o ar fora dos espaços intersticiais de folha. Uma vez que a pressão foi reduzida em 880 mbar (um processo que leva aproximadamente 1 min) câmara de infiltração é trazida rapidamente à pressão atmosférica 20-30 s, abrindo a válvula de entrada do forno, após infiltração é completa.
Cinco dias após a infiltração do material vegetal está pronto para colheita e subsequente de extração e isolamento do produto desejado. A partir deste ponto o processo é simplesmente um de extração de produtos naturais e purificação do material da folha, um fluxo de trabalho que é familiar para qualquer farmácia de produtos naturais. Muitos métodos diferentes para extração inicial e purificação subsequente existem15. A escolha mais adequada dos métodos e as condições exatas usadas é altamente dependente as propriedades químicas específicas do composto de interesse, além da disponibilidade de habilidades e/ou equipamento. Não é possível incluir no presente protocolo, um método totalmente generalizável, passo a passo para o processamento a jusante de material da folha da planta colhida ao produto isolado que pode ser seguido cegamente para qualquer produto triterpeno de interesse, nem seria apropriado para tentar fazê-lo. No entanto, este protocolo irá fornecer uma visão geral do fluxo de trabalho básico usado em nosso laboratório e alguns métodos para a fase inicial do processo, que, em nossa experiência provou generalizável para produtos de triterpeno aglicona mais oxigenados. Isso inclui duas técnicas relativamente incomuns, ou seja, extração de solvente pressurizado (PSE) e um método conveniente de fase heterogêneas para remoção de clorofila, utilizando uma resina de troca de íon fortemente básico.
PSE é uma técnica altamente eficiente para a extração de pequenas moléculas orgânicas de matrizes sólidas. As extrações são realizadas sob pressão (ca. 100-200 bar), a principal vantagem, sendo a capacidade de usar aliviadas temperaturas que excedam a ebulição ponto do solvente de extração. Isto pode significativamente reduzir o tempo e a quantidade de solvente necessária para alcançar uma extração exaustiva, quando comparado a outras técnicas de solventes quentes como refluxo simples ou Soxhlet extrações16. Instrumentos PSE de bancada comerciais estão disponíveis, que utilizam células de extração intercambiáveis e solvente automatizado, manipulação, aquecimento e monitoramento. Isto torna esta técnica extremamente conveniente. Também é indiscutivelmente menos nocivos, particularmente para os operadores com experiência limitada química prática.
Saponificação de extratos de folha crua sob refluxo seguido de particionamento de líquido/líquido é uma técnica comum para a remoção de massa de clorofilas antes da purificação subsequente ou análise. No entanto, isto pode muitas vezes ser operacionalmente exigentes em escalas maiores. Além disso, a deteção da interface, ou perda de produto devido à formação de emulsões pode ser problemática. A utilização de resinas de permuta iónica fortemente básicas para realizar a hidrólise heterogênea fase pode servir como uma alternativa conveniente. A porção pigmentada de clorofila a hidrolisado permanece aderida à resina e pode ser simplesmente removida por filtração. Este protocolo utiliza uma adaptação da escala preparativa de um procedimento analítico anteriormente relatados17 que emprega uma resina de troca iônica básicas disponíveis comercialmente.
Abaixo descrevemos um protocolo detalhado e rápido para a produção em escala preparativa de triterpenos utilizando esta plataforma baseada em vegetais. Este protocolo é usado rotineiramente em nosso laboratório para preparar dezenas a centenas de miligramas de produto triterpeno isolado para aplicações tal uma caracterização estrutural por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), e/ou um estudo mais aprofundado em funcional ensaios.

<table><tbody><tr><td>Instrumento GC-MS</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador adequado para realizar reações de PCR</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese em gel</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas de deslocamento de ar ajustável (Tamanhos: 1000 &micro; L, 200 &micro; L, 100 &micro; L, 20 &micro; L, 10 &micro; L e 2 &micro; L )</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Portador de nitrogênio líquido de topo largo (tamanho: 2 L)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de bancada (Capacidade: 24 x 1,5/2mL, Velocidade máxima: =/> 15000 rpm)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada (Capacidade: 20 x 50 mL, Velocidade máxima: =/> 4000 rpm)</td><td>Qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga grande de chão (Capacidade: 4 x 1L, Velocidade máxima: =/> 4000 rpm)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de pé</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora agitada (Frasco Tamanhos de grampo: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga (1 L)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de infiltração a vácuo</td><td>sob medida</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm vasos de plantas</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de liofilização (=/> capacidade do condensador de 8 litros)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 com células de extracção de 120 mL (instrumento PSE)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho evaporador rotativo</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balões de evaporação (Tamanhos: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>quaisquer</td><td>garrafas n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran (Tamanhos: 1 L, 10 L)</td><td>qualquer</td><td>n/ a</td><td></td></tr><tr><td>Frascos cônicos (Tamanhos 100 mL, 2 L)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Espátulas (tamanhos variados)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica (5 figuras)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balança (2 figuras)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cilindros medidores (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento Biotage Isolera com rack de coleta de 250 mL e frascos (instrumento de cromatografia flash automatizada</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de segurança</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Jaleco</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Consumíveis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de micropipeta (Tamanhos: 1000 &micro; L, 200 &micro; L, 100 &micro; L, 20 &micro; L, 10 &micro; L e 2 &micro; L )</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (Tamanho: 2 mL)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (Tamanhos: 15 mL, 50 mL)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência descartáveis (tamanho 2 mL)</td><td>quaisquer</td><td>placas de Petri n/a</td><td></td></tr><tr><td>(Tamanho: 100 mL)</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg; SNAP KP-SIL cartuchos flash de 100 g</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de HPLC (1 mL), inserções e tampas de frascos</td><td>qualquer</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Luvas descartáveis de nitrilo roxo</td><td>qualquer</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Filtro superior para E-914, celulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Filtro inferior para E-916 / 914, fibra de vidro</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td> Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Areia de quartzo, 0,3 - 0,9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (terra de diatomáceas)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Sílica gel 60 (0,040 -0,0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1,09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfônico</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3' 5'-dimetoxi-4'-acetofenona (acetosiringona)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&reg; &nbsp; 900 hidróxido (resina básica de troca iônica)</td> <td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Fisher</td><td>H / 0406 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etila</td><td>Fisher E</td><td>/ 0900 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher</td><td>D / 1852 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>M / 4056 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etiídio</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q água</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (kit de purificação de plasmídeos).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Fornecedor competente de E. coli</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vetor</td><td>Laboratório Lomonossoff John Innes Center</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE (tm) II ENZYME MIX (protocolo de clonagem de recombinação específico do local)</td> <td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (protocolo de clonagem de recombinação específico do local)</td> <td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION ALTA FIDELIDADE DNA POLIMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III Sistema de Síntese de Primeira Fita</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana sementes de benthamiana</td><td>qualquer fornecedor respeitável</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão transiente em nicotiana benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Os triterpenos são uma das maiores e mais estruturalmente diversas famílias de produtos naturais. Muitos derivados de triterpeno demonstraram possuir atividade biológica medicinalmente relevante. No entanto, até agora este potencial não traduziu em uma infinidade de drogas derivadas do triterpene na clínica. Este é sem dúvida (pelo menos parcialmente) uma consequência de acesso limitado de sintético prático para essa classe de composto, um problema que pode suprimir a exploração das relações estrutura-atividade e desenvolvimento de levar candidatos pelo tradicional medicinais fluxos de trabalho de química. Apesar de sua imensa diversidade, triterpenos são derivados de um precursor único e linear, 2,3-oxidosqualene. Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em s. benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno que não são produzidos naturalmente por esse host. Agro-infiltração é um meio eficiente e simples de alcançar a expressão transiente em s. benthamiana. O processo envolve a infiltração de folhas de plantas com uma suspensão de Agrobacterium tumefaciens , carregando o construct(s) expressão de interesse. Co infiltração de um adicional a. tumefaciens estirpe carregando uma expressão construção codificação uma enzima que aumenta significativamente o fornecimento de precursor aumenta rendimentos. Após um período de cinco dias, o material da folha infiltrados pode ser colhido e processado para extrair e isolar o produto (s) triterpeno resultante. Este é um processo que é linearmente e confiantemente escalável, simplesmente aumentando o número de plantas utilizadas no experimento. Aqui é descrito um protocolo para produção em escala preparativa rápida de triterpenos utilizando esta plataforma baseada em vegetais. O protocolo utiliza um aparelho facilmente replicável infiltração de vácuo, que permite a infiltração simultânea de até quatro plantas, permitindo a infiltração batch-wise de centenas de plantas em um curto período de tempo.

Típicos rendimentos isolados são dependentes da combinação enzima/enzima sob investigação, a estabilidade química do composto alvo, e como foi o desafio do processo de purificação. Informamos anteriormente isolados rendimentos de β-amirina derivados de nossas experiências de biossíntese combinatorial variando de 0,12 a 3,87 mg por grama de seco em pó de folha de s. benthamiana . Estes compostos variaram amplamente no nível de oxidação e incluíram antinaturais combinações de enzimas (Figura 3)8. Este protocolo é usado rotineiramente em nosso laboratório para produzir dezenas ou centenas de miligramas de produto purificado para caracterização estrutural por espectroscopia RMN e ensaios funcionais a jusante. Também demonstrámos o utilitário preparativa desta plataforma, produzindo 0,8 g do triterpeno andaime β-amirina em um grau de pureza superior a 98%. Este experimento 459 plantas usadas e representa um rendimento isolado de 3,3 mg por grama de seco N. benthamiana folha pó8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Figura 1: Resumo esquemático. Representação esquemática do processo de exploração expressão transiente de enzimas biossintéticas na folha de s. benthamiana para desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para produção de novos produtos de alto valor triterpeno preparativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Figura 2: vácuo infiltrador construção e processo. um) Bespoke planta titular uma ala separada. asas da titular da planta b) Bespoke anexadas. c) inversão e submersão das plantas. d) inserção do banho de infiltração. banho e) infiltração no lugar dentro da câmara de infiltração. f) Complete infiltrador de vácuo: bomba de vácuo (1) (2) Conexão da bomba de vácuo, a válvula de isolamento do reservatório de vácuo (3) vácuo reservatório (4) a Conexão entre o reservatório de vácuo e a válvula de admissão de ar (5) medidor de pressão (6) (7) infiltração câmara Reservatório de vácuo de câmara (8) infiltração. g) representante folhas de uma planta, infiltrou-se com uma expressão de construção para a proteína verde fluorescente (GFP), após crescimento de infiltração após cinco dias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Figura 3: anteriormente relatados resultados representativos para a produção preparativa de derivados de β-amirina usando este protocolo8. Esta tabela é ordenada por rendimentos isolados. Colunas são formatadas condicionalmente com indicação de cor de valor relativo. Vermelho = alta, verde = baixa (embora intermediário amarelo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em folhas de Nicotiana benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno. Aqui é descrito um protocolo detalhado para produção em escala preparativa rápida (5 dias) de triterpenos e analogs utilizando esta poderosa plataforma baseada em vegetais.

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Este protocolo oferece acesso conveniente em escala preparativa a compostos triterpenos para uso em estudos a jusante, como caracterização estrutural ou expiração de atividade biológica medicinalmente relevante. O protocolo é rápido, escalável e permite que combinações de enzimas sejam utilizadas simplesmente pela co-infiltração de diferentes cepas de Agrobacterium, negando a necessidade de construir grandes vetores multigênicos. Para começar, inocule uma placa de ágar LB seletiva com estrias das cepas desejadas de Agrobacterium tumefaciens de culturas estoque de glicerol.Incube a placa durante a noite a 28 graus Celsius em uma incubadora permanente. No dia seguinte, inocular individualmente 50 mililitros de meio LB seletivo com uma amostra de cada cepa de Agrobacterium tumefaciens. Incube a cultura durante a noite a 28 graus Celsius em uma incubadora agitada a 200 rpm.Transfira individualmente as culturas de 50 mililitros para 1.000 mililitros de meio LB seletivo e incube durante a noite a 28 graus Celsius na incubadora agitada a 200 rpm. No dia seguinte, peletizar individualmente o Agrobacterium tumefaciens das culturas líquidas por centrifugação a 4.000 vezes g. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda individualmente os pellets em 50 mililitros de tampão MMA recém-preparado.Incubar os pellets ressuspensos à temperatura ambiente no escuro durante uma hora. Agora, determine o volume apropriado de cada suspensão de Agrobacterium tumefaciens MMA para produzir um OD 600 final de pelo menos 0,2 em um volume final total de 10 litros. Combine os volumes determinados de cada suspensão.Agora, adicione um buffer MMA adicional às suspensões combinadas até um volume final de um litro, para ser usado imediatamente para infiltração a vácuo. Transfira um litro de suspensão de infiltração e um litro de tampão MMA de força 10x para o banho de infiltração, seguido por mais oito litros de água. Remova as asas destacáveis do suporte de planta sob medida.Insira quatro plantas de cinco semanas que foram cultivadas conforme descrito no protocolo de texto e recoloque as asas. A cobertura de infiltração é comprometida se as folhas não estiverem totalmente submersas na suspensão de infiltração. Esse problema é minimizado garantindo que o nível da suspensão atinja a superfície superior do suporte da planta antes do tratamento a vácuo.Inverta o suporte e coloque-o em cima do banho de infiltração de modo a submergir as folhas na suspensão de infiltração. Transfira o banho de infiltração com plantas submersas para a câmara de infiltração e feche a porta. Certifique-se de que a válvula de entrada de ar esteja fechada no infiltrador.Depois de ligar a bomba de vácuo, abra a válvula de admissão de vácuo na câmara de infiltração. Assim que a pressão na câmara de infiltração for reduzida em 880 milibar, feche a válvula de admissão de vácuo e abra a válvula de admissão de ar. Ao retornar à pressão atmosférica, abra a porta e remova o banho de infiltração.Agora, levante o porta-plantas até que as plantas não fiquem mais submersas na suspensão de infiltração. Em seguida, agite suavemente o suporte para permitir que o excesso de suspensão escorra das folhas e volte para o banho de infiltração. Por fim, retorne o suporte para a posição vertical, remova as asas destacáveis e remova as plantas.Cultive as plantas infiltradas por cinco dias a 25 graus Celsius em 16 horas por dia de luz com rega diária. Após cinco dias de crescimento, colha as folhas e seque-as conforme descrito no protocolo de texto. Moa as folhas secas em um pó grosso por meio de um método conveniente, como usar um processador de alimentos doméstico ou esmagar manualmente as folhas enquanto estiverem contidas em um saco.Misture o pó da folha com areia de quartzo em um recipiente adequado. Isso atua como um dispersante e melhora a eficiência do processo de extração. Agora, prepare quatro células de extração para o preenchimento, invertendo-as primeiro.Em seguida, insira o filtro de fibra de vidro, seguido da frita de metal e do plugue de retenção. Retorne as células de extração para a posição vertical e adicione uma camada de areia de quartzo com um centímetro de profundidade. Encha as células de extração com o pó de folha preparado até a linha de enchimento.Se necessário, comprima suavemente o pó durante este processo para facilitar a adição de uma quantidade maior em cada célula de extração. Agora, adicione uma pequena camada de areia de quartzo na parte superior do pó compactado e insira o filtro de celulose superior. Insira as células de extração embaladas no instrumento de extração de solvente pressurizado e execute o método desejado.Uma vez concluído o método, concentrar o licor de extração combinado até a secura por evaporação rotativa sob vácuo, conforme detalhado no protocolo de texto. Verifique a saída esperada de uma pasta verde escura. Para remover as clorofilas, usando resina básica de troca iônica, primeiro dissolva o extrato bruto em um volume mínimo de etanol.Adicione 50 mililitros de esferas básicas de resina de troca iônica à solução resultante. Em seguida, agite em temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione mais 50 mililitros de esferas básicas de resina de troca iônica a cada 30 minutos até que a reação seja concluída.No início, as esferas básicas de resina de troca iônica são de cor rosa e a fase líquida é verde. À medida que a reação prossegue, os grânulos de resina mudam para verde e a fase líquida para laranja ou marrom escuro, dependendo da escala. Filtrar a mistura de reacção através de uma pequena coluna de terra de diatomáceas através de uma coluna de cromatografia flash de vidro, utilizando foles manuais para aplicar pressão.Enxágue as esferas de resina coletadas com etanol, seguido de etanol um-para-um em hexano e, finalmente, com hexano. Use um volume de enxágue suficiente para ressuspender as contas no topo da coluna de terra de diatomáceas. Finalmente, combinar o filtrado, os enxágues e o concentrado até a secagem por evaporação rotativa sob vácuo.Aqui é mostrada uma imagem das folhas de uma planta infiltrada com uma construção de expressão para a proteína fluorescente GFP após cinco dias de crescimento pós-infiltração. Isso ilustra a extensão da cobertura de infiltração que pode ser esperada. As folhas são dispostas do canto superior esquerdo para o canto inferior direito da imagem em ordem decrescente, em relação à sua altura original na planta.Esta imagem representa 0,8 gramas de beta-amirina produzida usando este protocolo, que é superior a 98% de pureza. O experimento foi conduzido em uma escala de 459 plantas e representa um rendimento isolado de 3,3 miligramas por grama de material foliar seco. Ao tentar este protocolo, é importante lembrar que apenas folhas infiltradas produzirão seu composto de interesse.Portanto, é vantajoso colher seletivamente essas folhas quando possível para evitar a diluição de sua amostra com tecido improdutivo. As etapas pós-colheita deste protocolo são fornecidas para fins ilustrativos. Eles podem ser substituídos por outras técnicas de purificação de extração de produtos naturais, dependendo da disponibilidade de experiência e/ou instalações em sua instituição.Descobrimos que o tratamento básico com resina de troca iônica apresentado neste protocolo é uma alternativa conveniente à saponificação mais tradicional, seguida de partição líquido/líquido para a remoção de clorofilas em escalas maiores. Antes de seguir este protocolo, você deve se familiarizar com os dados de segurança do material para todas as substâncias usadas e tomar as devidas precauções de segurança. A legislação local relativa ao trabalho com material transgênico deve ser verificada e observada, inclusive seguindo os procedimentos de contenção apropriados.

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