Name: Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-Dimensional cultura de células de Glioblastoma derivado de paciente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a cultivar células de glioblastoma derivadas de paciente em hidrogel de ácido hialurônico para modelagem 3D. Este método modular preserva características tumorais in vivo e permite estudar resistência a tratamentos.

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Este trabalho foi financiado com recursos do NIH (R21NS093199) e prêmio do UCLA ARC 3R. Nossos sinceros agradecimentos vão para o laboratório do Dr. Harley Kornblum para fornecimento das linhas celulares HK301 e HK157. Agradecemos também núcleo de patologia laboratório de UCLA tecido (TPCL) para cryosectioning, instalação de núcleo de microscopia de luz avançado/espectroscopia (ALMS) em Califórnia nanosistemas Institute (CNSI) na UCLA para uso do microscópio confocal, UCLA Crump Instituto para Imagem molecular para o uso de sistema de imagem IVIS, UCLA Molecular instrumentação Center (MIC) para fornecer a espectroscopia de ressonância magnética e fluxo Cytometry núcleo em Jonsson abrangente Cancer Center (JCCC) na UCLA para fornecimento de instrumentação para o fluxo de citometria.

Todas as etapas de coleta de tecido humano foram realizadas sob protocolos aprovados institucionalmente.
1. Thiolation de ácido hialurônico
Nota: Rácios Molar são demonstrados em relação ao número total de grupos carboxilato, a menos que especificado de outra forma.
<ol><li>Dissolva 500 mg de hialuronato de sódio (HA, 500-750 kDa) 10 mg/ml em água destilada, deionizada (DiH2O) em uma autoclave esterilizada, Erlenmeyer de 250 mL. Agite a solução (~ 200 rpm) à temperatura ambiente por 2 horas para dissolver totalmente HA. Use uma barra de agitação e placa de agitação magnética para manter a reação mexendo durante procedimento de thiolation.</li>
	<li>Usando 0.1 M ácido clorídrico (HCl), ajustar o pH da solução a 5,5 HA. Pese 69,6 mg (0,25 x razão molar) de 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC). Nota: Embora não dissolvido EDC pode ser adicionado diretamente para a solução HA, é normalmente mais fácil dissolver EDC primeiro em 1 mL de DiH2O e em seguida, adicione rapidamente a solução EDC para a solução HA. Pré-dissolução em 1 mL de DiH2O também pode ser feito com a N-Hidroxisuccinimida (NHS) e cystamine dihydrocholoride antes de adicionar a reação em etapas 1.3 e 1.4.</li>
	<li>Adicione 17,9 mg (0,125 x razão molar) de NHS para a reação. Ajustar o pH da solução de reação de 5.5 usando 0.1 M HCl e incubar a reação à temperatura ambiente durante 45 minutos.</li>
	<li>Adicione 70,0 mg (0,25 x razão molar) de dicloridrato de cystamine para a solução de reação. Use 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH) para ajustar o pH a 6.25. Incube a reação na temperatura de quarto durante a noite, agitando.</li>
	<li>No dia seguinte, use 1 M de NaOH para ajustar o pH da solução de reação de cerca de 8. Adicione 192 mg (4 x razão molar) de ditiotreitol (DTT) para a reação. Ajustar o pH volta a 8 após a adição da TDT e deixar a agitação por 1-2 horas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Use 1 M de HCl para ajustar o pH para 4. Transfira a mistura de reação inteira em membrana de diálise previamente embebido (corte de peso molecular em torno de 13 kDa) e urinar contra DiH2O pré-ajustada a pH 4. Nota: O volume de DiH2O para diálise deve ser pelo menos 40 vezes o volume da solução de HA (por exemplo, amostra de 50 mL em 2 L de DiH2O, pH 4) reagiram.</li>
	<li>Substitua a solução de diálise (DiH2O, pH 4) duas vezes diariamente por 3 dias à temperatura ambiente.</li>
	<li>Filtre a solução dializada através de uma membrana de 0,22 µm, filtro controlado por vácuo. Flash congelar a solução de thiolated HA em nitrogênio líquido. Use um Liofilizador para congelar amostras secas durante 2 dias. Thiolated HA no formulário seco pode ser armazenado em um dessecador selado a-20 ° C durante pelo menos 6 meses.</li>
	<li>Para determinar o grau de thiolation, use o teste do Ellman e/ou proton NMR espectroscopia30,31.</li>
</ol>2. preparação de materiais de reticulação
<ol><li>Dissolva thiolated HA na concentração desejada (no exemplo, 13,3 mg/mL) em solução salina tampão HEPES (20 mM HEPES buffer de solução salina sal equilibrado (HBSS) do Hank, ajustado para cair dentro de um pH de 8-9) em um frasco âmbar para minimizar a exposição à luz ambiente. Conservar a solução, agitando constantemente. Nota: A formação de ligações dissulfureto entre tióis conjugados a HA pode ocorrer se o pH estiver acima de 8, a concentração da solução é muito alta, ou a solução é deixada mexendo por muito tempo antes da gelificação. Para evitar esse problema, use abaixo de 15 mg/mL de thiolated HA e dissolver thiolated HA dentro de 2 horas de formação de hidrogel.</li>
	<li>Dissolva 4-braço-PEG-maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) e 4-braço-PEG-tiol (PEG-tiol, 20 kDa) em salina tamponada fosfato (PBS), pH 7,4, para preparar a 50 mg/mL PEG-Mal e PEG-tiol soluções estoque. Nota: Demora pelo menos 1 hora para dissolver totalmente PEG reagentes.</li>
	<li>Se adicionando peptídeos derivados de ECM, dissolva cisteína contendo peptídeos em PBS para preparar uma solução de reserva. Nota: Utilize uma concentração das ações de 2-4 mM.</li>
	<li>Borracha de silicone de imersão moldes em etanol pelo menos 20 min para limpa-los e, em seguida, autoclave-los para a esterilização.</li>
</ol>3. hidrogel reticulação e encapsulamento da célula
Nota: como exemplo aqui, o encapsulamento de quatro indivíduos, 80 µ l hidrogel com 0,5% (p/v) HA e módulo de elasticidade à compressão de 1 kPa é descrito3. Por favor, consulte a tabela 1 para receitas de exemplo que rendem hidrogel com propriedades diferentes: dois hidrogel incorporando a integrina-ligação peptídica RGD e dois hidrogel incorporando tampões de cisteína como um controle negativo para a atividade de peptídeo. Concentração de células GBM paciente-derivado de semeadura é 500.000 células/mL.
<ol><li>Dilua o PEG-Mal solução (50 mg/mL, da etapa 2.2) a 12,5 mg/mL, adicionando 40 µ l da solução-mãe de 120 µ l PBS. Dividi a solução diluída em dois tubos de 1,5 mL microcentrifuga para que cada tubo tem 80 µ l.</li>
	<li>Adicione 16 µ l de solução RGD (2,8 mM, da etapa 2.3) para um tubo de estoque e 16 µ l da solução estoque de cisteína (2,8 mM, da etapa 2.3) para o segundo tubo. Vórtice de misturar. Coloque as soluções PEG-Mal-RGD ou PEG-Mal-CYS no gelo até o uso na etapa 3,9. Nota: O procedimento conforme descrito aqui rendimentos hidrogel com ~ 140 µM de peptídeo. Isso é equivalente a aproximadamente 1 em cada 8 braços de PEG disponíveis, sendo ocupada com um peptídeo. Isto pode ser variado, alterando a relação molar de peptídeos cisteína-terminada a grupos de maleimide disponível. Em geral, uma concentração máxima de 280 µM de peptídeo pode ser conseguida ao mesmo tempo deixando um número suficiente de maleimide grupos disponíveis para reticulação de hidrogel.</li>
	<li>Dilua a solução-mãe PEG-tiol (50 mg/mL, da etapa 2.2) a 5 mg/mL misturando 4 µ l de 50 mg/mL solução estoque com 36 µ l de PBS. Adicione 120 µ l de dissolvido, thiolated HA da etapa 2.1 à mistura. Nota: Soluções de HMW HA são muito viscosas. Assim, recomendamos o uso de ponta de todo o orifício micropipeta para transferir soluções. Pipeta lentamente para evitar solução aderindo às paredes da ponta da micropipeta e para melhorar a precisão de medição.</li>
	<li>Coloque os moldes limpos e secos (preparados na etapa 2.4) em cada poço de uma cultura de não-tecidos Tratado 12 placa. Usando a extremidade romba, limpa de uma ponta da pipeta, pressione o molde de gel e faça uma verificação dupla vedação entre moldes e inferior da placa bem. Nota: Verifique o selo novamente antes do encapsulamento para evitar fugas.</li>
	<li>Passagem de culturas de células de GBM, dissociar a células únicas e determinar a concentração de células como descrito anteriormente3. Nota: Algumas linhas GBM não podem ser dissociadas de células únicas. Neste caso, toda gliomaspheres pode ser encapsulado. No entanto, prepare células únicas dissociadas depois de célula precisa contar melhorar a reprodutibilidade. O protocolo para gliomasphere passagem varia entre diferentes laboratórios, e muitos destes são provavelmente compatível com encapsulamento de hidrogel.<ol>
<li>(Recomendado) Centrífuga gliomaspheres a 500 x g, durante 5 min. Retire o sobrenadante e adicionar 1 mL de enzima de dissociação de célula para o centrifugado. Em seguida, incube durante 5 min, batendo suavemente o tubo para agitar.</li>
		<li>Adicione 4 mL de meio de cultura completo (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µ g/mL heparina, suplemento G21 e 1% penicilina/estreptomicina em DMEM/F12) para as células.</li>
		<li>Centrifugar novamente a 500 x g durante 5 min e retirar o sobrenadante. Finalmente, Ressuspender as células em 1 mL do meio de completa e passar a suspensão de células através de um filtro de célula de 70 µm. Lavagem (recomendada) o filtro com um adicional 4 mL do meio de completa para maximizar o número de células se recuperou.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estime a concentração de células na suspensão usando um hemocytometer. Dividi a suspensão de eritrócitos em 2 tubos de centrífuga, onde cada tubo contém células ~ 80.000. Centrifugar a 500 x g por 5 min; Geralmente, 80.000 células compõem 2 80 µ l hidrogel.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender uma pelota em 80 µ l de solução de PEG-MAL-RGD e uma segunda pelota em 80 µ l de solução de PEG-MAL-CYS (preparada no passo 3.1).</li>
	<li>Usando um 200 µ l, ponta da micropipeta largo-orifício, dispense a 40 µ l de solução HA (de etapa 3.3 acima) em cada molde de silicone de borracha (como preparado no passo 3.4).</li>
	<li>Usando um 200 µ l, ponta da micropipeta largo-orifício, misture a 40 µ l de solução de célula PEG-MAL-RGD com a solução HA no molde ou PEG-MAL-CYS. Pipete sobem e descem rapidamente não mais que 10 vezes. Repita para cada cultura gel sendo preparada. Nota: Este passo requer prática, como a gelificação inicial ocorre rapidamente (dentro de 30 s). Pipete acima e para baixo enquanto se move a ponta para diferentes locais em moldes para garantir mistura mesmo. Mantenha sempre a ponta abaixo do nível líquido para evitar a formação de bolhas de ar. Não misture a solução muitas vezes como gel pode se formam no interior da micropipeta dica de fazer. PEG-MAL-CYS e PEG-MAL-RGD podem ser combinados em proporções diferentes para atingir a concentração desejada de peptídeos RGD.</li>
	<li>Coloque a placa bem-contendo células gel encapsulado em uma incubadora de cultura de célula de 37 ° C por 5-10 minutos garantir a conclusão da reação.</li>
	<li>Adicione 2-2,5 mL de meio de cultura para cada poço com géis formados. Use um estéril, a ponta da pipeta 2 µ l ou microespátula, para separar com cuidado o molde e o gel. Use fórceps pré-esterilizados para remover o molde da placa de bem. Coloque a placa bem voltar à incubadora de célula (37 ° C e 5% CO2) para a cultura e as experiências futuras. Nota: Puxe o molde verticalmente para cima para evitar prejudicar as culturas de gel. Em geral, médio em gel de culturas deve ser substituído a cada 3-4 dias. Tome cuidado para não aspirar hidrogel ao remover médio. Se isto for um problema, recomendamos que usando uma pipeta de transferência plástica. Se bioluminescência imaging para rastrear o número do celular é planejada, células GBM devem ser transfectadas com lentivirus constitutivamente codificação expressão luciferase antes de encapsulamento, como descrito anteriormente3. Para a imagem latente de bioluminescência, adicione 1 mM de D-Luciferina de meio de cultura 1h antes da imagem latente de luminescência.</li>
</ol>4. lisada preparação para a mancha ocidental
<ol><li>Fica frio tubos de 1,5 mL microcentrifuga no gelo (1 por gel de amostras). Legal centrifugar a 4 ° C.</li>
	<li>Retire médio chapas bem. Transferi géis para tubos microcentrifuga prechilled.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de tampão RIPA com inibidores de protease/fosfatase 1 x.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de 1 mL com agulha 20g, acaba com o gel, empurrando a mistura inteira através de agulha de pelo menos 20 vezes.</li>
	<li>Flash girar a amostra usando banco microcentrifuga superior e coloque a amostra de volta no gelo.</li>
	<li>Vórtice amostras brevemente cada 5 min. para um total de 20 min.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 14000 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para tubos microcentrifuga novo, pre-refrigerados e armazenar a-20 ° C (curto prazo) ou e -80 ° C (longo prazo). Realize a eletroforese em gel utilizando procedimentos padrão, como descrito anteriormente3.</li>
</ol>5. extrair células únicas de hidrogel culturas por citometria de fluxo
<ol><li>Retire médio e transferência de cultura de gel (da etapa 3.11) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
	<li>Incube gel com 500 µ l de enzima de dissociação celular (por exemplo, TrypLE Express) a 37 ° C por 5 min, ocasionalmente, passando rapidamente o tubo para agitar.</li>
	<li>Transfira a mistura em um tubo de centrífuga de 50 mL com 5 mL de meio completo. Coloca o tubo no gelo.</li>
	<li>Anexe uma agulha 20g em uma seringa de 10 mL. Puxe delicadamente a suspensão de células acima e para baixo através da agulha 8 vezes.</li>
	<li>Fluxo da mistura através de 70 µm filtro de célula para um novo tubo de centrifugação de 50 mL. Aplica um adicional 5 mL de meio completo através do filtro para coletar as células restantes.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 400 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o precipitado no buffer desejado por citometria de fluxo (usando protocolos padrão3).</li>
</ol>6. criopreservação de hidrogel para seccionamento
<ol><li>Remova o meio de culturas de gel (da etapa 3.11).</li>
	<li>Incube as culturas de gel com 2 mL de paraformaldeído 4% (PFA) a 4 ° C durante a noite. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.</li>
	<li>No dia seguinte, retire o PFA. Adicionar 2 mL de 5% de sacarose em PBS para géis e incube por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Substitua a solução de sacarose 5% com 2 mL de 20% de sacarose em PBS e incube por 30 min.</li>
	<li>Substitua a solução de sacarose com 2 mL de fresco 20% de sacarose em PBS e incubar por um adicional 30 min.</li>
	<li>Pela terceira vez, substitua a solução de sacarose com 2 mL de fresco 20% de sacarose em PBS. Incube a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Prepare-se 20% de sacarose em composto de temperatura de corte ideal (OCT). Nota: Devido à viscosidade do OCT, dissolução de sacarose pode levar algum tempo (até durante a noite). Recomendamos colocar a mistura em um abanador durante dissolução para manter a agitação.</li>
	<li>No dia seguinte, retire a solução de sacarose 20% e delicadamente despeje a 20% de sacarose em solução OCT sobre o gel. Certifique-se de cobrir o gel todo. Incube a 4 ° C por 3 h.</li>
	<li>Transferir o gel para o centro de um molde de encastre usando uma espátula grande e plana; Isso deve ser feito com cuidado para não danificar o gel.</li>
	<li>2-methylbutane legal dentro de uma câmara com um excesso de gelo seco.</li>
	<li>Encha o molde de encastre com OCT pura (sem sacarose). Encha logo abaixo a borda superior do molde.</li>
	<li>Congelar a amostra de hidrogel por imersão em refrigeração 2-methylbutane e prossiga até a corte.</li>
	<li>Seção da amostra usando um criostato; espessura de corte de 10-18 µm e a temperatura de corte de cerca de-26 ° C são recomendados.</li>
	<li>Execute procedimentos de imunocoloração padrão na cultura de gel seccionado, como descrito anteriormente3. Nota: PFA é conhecido irritante e cancerígeno. Por favor Manuseie e elimine PFA-de acordo com os regulamentos e normas aplicáveis localmente.</li>
</ol>7. extração de RNA total de amostras em hidrogel
Nota: Aqui, descrevemos um protocolo utilizando um comercial kit (veja a tabela de materiais) para extrair o RNA total de células cultivada de hidrogel. Os buffers e todo o material estão disponíveis dentro do kit usado.
<ol><li>Remova o meio de cultura. Use uma pipeta de transferência P1000 com ponta larga-furo para transferir a cultura de hidrogel no tubo de 1,5 mL microcentrifuge.</li>
	<li>Adicione 350 µ l de tampão RLT para a cultura de hidrogel.</li>
	<li>Usando uma agulha 20g anexada a uma seringa de 1 mL, Desfie o gel, empurrando a mistura inteira através de agulha de pelo menos 20 vezes.</li>
	<li>Transfira a mistura toda em uma coluna de homogeneizador colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Centrifugar a 13.000 x g por 2 min.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante para um tubo de microcentrifuga limpa 1,5 mL. Tenha cuidado para não perturbar o precipitado de gel na parte inferior.</li>
	<li>Misture a amostra lisada com 350 µ l de etanol 100%. Transferi toda a amostra para um lugar de coluna (do kit) de rotação em um tubo de coleta de 2 mL. Centrífuga para 1 min a 13.000 x g.</li>
	<li>Para as etapas subsequentes para purificação de RNA por PCR, segui o protocolo geral fornecido pelo fabricante do kit. Nota: Uma vez que o RNA é extraído, protocolos padrão para o PCR podem ser usados.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Geração de dados podem ser reproduzidos usando este sistema de cultura 3D requer: 1) consistente para lotes thiolation de HA, 2) prática para atingir eficiente mistura de precursores de hidrogel e manipulação de hidrogel culturas para evitar danos e 3) otimizado de semeadura densidade para cada linha de celular usada.
Quando uma porcentagem de peso específico de HA é desejada no hidrogel, o grau de thiolation de HA determina a densidade de ligação cruzada. Recomendamos usar uma quantidade cons...

Sistemas tridimensionais (3D) cultura recapitulate interações entre células e a sua envolvente da matriz extracelular (ECM) em tecidos nativos melhores que seus bidimensional (2D) homólogos1,2. Avanços na engenharia de tecidos têm rendido plataformas sofisticada cultura 3D que permitem investigações controladas em componentes 1) como químicas e físicas da matriz microambiente afetam célula comportamentos e 2) a eficácia de novas terapêuticas estratégias para uma série de doenças, incluindo câncer2. Enquanto modelos em vitro não podem considerar fatores sistêmicos, tais como sinais do sistema endócrino e imunes e, portanto, não podem substituir completamente modelos na vivo , eles fornecem várias vantagens, incluindo a reprodutibilidade, controle experimental, acessibilidade e velocidade. Aqui, descrevemos o uso do cérebro-mimética hidrogel em 3D que culturas de células de tumor de cérebro de paciente-derivado capturar muitos aspectos da fisiologia de tumor, em particular, a dinâmica de aquisição de resistência do tratamento3. Em comparação com outros métodos em vitro , essas culturas melhor representam modelos de tumor na vivo e observações clínicas3.
Glioblastoma (GBM) é o câncer mais frequente e letal, originários do cérebro, com uma sobrevida média de apenas 1-2 anos,4,5. Nos últimos anos, muitos estudos têm incidido sobre a influência do ambiente de matriz de tumor em GBM6,7,8. O único cérebro ECM tem sido relatado para afetar resistência terapêutica6,7,8,9,10,11 , proliferação e migração de células GBM , 12. ácido hialurônico (Ah) é um glicosaminoglicano abundante (GAG) no cérebro, onde ele interage com outros GAGs e proteoglicanos para formar um hidrogel, como malha13. Muitos estudos têm relatado a superexpressão de HA em tumores GBM e seus efeitos subsequentes sobre câncer progressão8,9,13,14,15,16 ,17. Outros componentes de ECM também afetam GBM tumor crescimento e invasão6,7,15,18. Por exemplo, fibronectina e vitronectina, que normalmente são overexpressed em GBM, induzem a heterodimerization de receptores de superfície integrinas celular através da ligação à sequência de "RGD" e iniciar o complexas cascatas de sinalização que promovem a sobrevivência de tumor19 ,20,21. Além de influências bioquímicas, propriedades físicas da matriz de tecido também afetam GBM progressão22,23.
Aquisição contínua de resistência às terapias é um dos principais motores do GBM letalidade4. Mostrando resultados promissores em modelos 2D ou gliomasphere de drogas falharam em estudos subsequentes em animais e casos clínicos3, indicando que os efeitos dos fatores microenvironmental contribuíram significativamente para GBM tumor resposta1. Enquanto modelos animais podem fornecer um 3D, fisiologicamente adequadas microambiente para xenografted células doentes e gerar resultados clinicamente relevantes24,25, a complexidade do cérebro microambiente na vivo torna-se desafiador para determinar quais recursos, incluindo interações célula-matriz, são os resultados-chave para específica biológicos. Identificação de novos alvos terapêuticos beneficiará da utilização de plataformas de cultura simplificado de propriedades bioquímicas e biofísicas definidas.
Ao contrário dos modelos anteriormente relatados biomaterial do GBM tumor microambiente26,27 que não alcançaram o verdadeiro controle ortogonal sobre características físicas e bioquímicas individuais de ECM, a plataforma de biomateriais relatados aqui permite desacoplamento das contribuições dos vários recursos independentes de fenótipo de células GBM. Aqui, apresentamos um sistema de hidrogel HA-based, ortogonalmente ajustáveis, para cultura 3D do paciente-derivado de células de GBM. Hidrogel é formados a partir de dois componentes de polímero: HA 1) biologicamente ativo e 2) biologicamente inerte polietileno glicol (PEG). PEG é um material biocompatível e hidrofílico amplamente utilizado com adsorção de baixa proteína e imunogenicidade mínimo28. Aqui, cerca de 5% de partes de ácido glicurônico HA correntes são acrescida com grupos tiol para habilitar ligando para um comercialmente disponível 4-braço-PEG finalizado com maleimides através da adição de Michael-tipo. Na sua forma mais comum no corpo, HA existe em cadeias de alto peso molecular (HMW). Aqui, um baixo grau de modificação de HMW HA (500-750 kDa) ajuda a preservar interações nativas de HA e seus receptores celulares, incluindo CD4429. Substituindo PEG-tiol para HA-tiol, mantendo uma constante relação molar de tióis totais de maleimides, HA concentração pode ser dissociada da propriedades mecânicas de hidrogel a resultante. Além disso, controles estequiométricos podem ser usados para conjugar terminada em cisteína peptídeos para um número definido de médio de braços maleimide terminada em cada 4-braço-PEG. Incorporação de peptídeos derivados de ECM, adesivos permite interações com integrinas em culturas de células, através do qual os sinais bioquímicos e químicos são transduzidas1. Adição de maleimide-tiol ocorre muito rapidamente em condições fisiológicas, minimizando o tempo necessário para encapsulamento de célula e maximizando a sobrevivência de células derivadas de paciente. Além disso, culturas de hidrogel podem ser tratadas como amostra de tecido típico e são compatíveis com as técnicas de caracterização padrão incluindo mancha ocidental, citometria de fluxo e mancha da imunofluorescência. O protocolo seguinte descreve os procedimentos para a fabricação de hidrogel, estabelecer 3D culturas de células GBM derivado de paciente e técnicas de análise bioquímica.

<table><tbody><tr><td>Medidor de pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Qualquer medidor de pH que tenha sensibilidade de pH 2-10</td></tr><tr><td>Placa de agitação</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Equipamento geral de laboratório</td></tr><tr><td>Balão Erlenmeyer (125mL)</td>Tubos de diálise <td>Thermo Fisher</td><td>FB-501-125</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher</td><td>21-152-14</td><td></td></tr><tr><td>Copo de polipropileno 2L</td><td>Thermo Fisher</td><td>S01916</td><td></td></tr><tr><td>hialuronano de sódio</td><td></td><td>Lifecore HA700k-5</td><td>500-750 kDa faixa</td></tr><tr><td>1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI-22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>sigma aldrich</td><td>130672-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>Thermo Fisher</td><td>SA48-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Thermo Fisher</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Dicloridrato de cistamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC111770250</td><td></td></tr><tr><td>Dithiolthreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de teste de Ellman (ácido 5-(3-Carboxi-4-nitrofenil)dissulfanil-2-nitrobenzóico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D218200-1G</td><td></td></tr><tr><td>Água deuterada (óxido de deutério)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC166301000</td><td></td></tr><tr><td>0,22&micro; m filtro acionado a vácuo</td><td>CellTreat</td><td>229706</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' salina balanceada (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MT-21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>4-braço-PEG-maleimida</td><td>JenKem Technology</td><td>A7029-1</td><td>peso molecular em torno de 20kDa</td></tr><tr><td>4-arm-PEG-thiol</td><td>JenKem Technology</td><td>A7039-1</td><td>peso molecular em torno de 20kDa</td></tr><tr><td>L-cisteína&nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>C7880-100G</td><td></td></tr><tr><td>RGD ECM peptídeo mimético</td><td>Genscript Biotech</td><td>N/A</td><td>Peptídeo personalizado com sequência "GCGYGRGDSPG", N-terminal deve ser acetilado</td></tr><tr><td>moldes de silicone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GBL664201-25EA</td><td>Use lâmina de barbear para cortar em pedaços únicos</td></tr><tr><td>meio de cultura completo</td><td>Vários</td><td>Vários</td><td>DMEM/F12 (Thermofisher) com suplemento sem soro (G21 da GeminiBio), fator de crescimento epidérmico 50ng/mL (Peprotech), fator de crescimento de fibroblastos 20ng/mL (Pepro Tech) e hepraína 25&micro; g/mL (Sigma Aldrich), meio de cultura varia em diferentes laboratórios</td></tr> célula <tr><td>GBM derivada do paciente</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>agulha 20G</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td>médica</tr><tr><td>seringa de 1mL Seringa</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>10mL</td> BD <td>302995</td><td></td><td>médica</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI-89901</td><td></td></tr><tr><td>protease/ Inibidor de Fosfatase Mini Tablet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de Vórtice</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-814-5Q</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>70&micro; filtro de células m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC416785000</td><td>Dissolver 4% (p/v) em PBS, manter o pH 7,4</td></tr><tr><td>D-sacarose</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura Ótima de Corte (O.C.T.) composto</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9373881</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Qualquer Geral com 5% de CO2 e geladeira</td></tr><tr><td>/freezer</td><td>37C Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Qualquer equipamento de laboratório geral com capacidade de -20C e -80C</td></tr><tr><td>Moldes de incorporação descartáveis</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-20</td><td></td></tr><tr><td>Lyapholizer</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td>Qualquer liofilizador -105C</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Frasco âmbar</td><td>Kimble Chase</td><td>60912D-2</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de orifício largo</td><td>Thermo Fisher</td><td>9405120</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Thermo Fisher</td><td>03551-4</td><td></td></tr><tr><td>Gelo Seco</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-dimensional cultura de células de glioblastoma derivado de paciente

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) é o câncer mais comum, ainda mais letal, do sistema nervoso central. Nos últimos anos, muitos estudos têm focado como a matriz extracelular (ECM) do ambiente exclusivo do cérebro, como o ácido hialurónico (HA), facilita a invasão e a progressão do GBM. No entanto, a maioria em vitro cultura de modelos incluem células GBM fora do contexto de um ECM. Xenografts murino de células GBM são usados geralmente também. No entanto, na vivo modelos dificultam a isolar as contribuições das características individuais do microambiente do tumor complexo comportamento do tumor. Aqui, descrevemos uma plataforma de base de hidrogel, tridimensional (3D) cultura HA que permite que os pesquisadores independentemente alterar a rigidez e a concentração de HA. Alto peso molecular HA e polietileno glicol (PEG) compõem o hidrogel, que são a quitosana através da adição de Michael-tipo na presença de células vivas. Culturas de hidrogel 3D do paciente-derivado viabilidade de exposição de células GBM e proliferação taxas tão bom quanto, ou melhor, quando cultivadas como padrão gliomaspheres. O sistema de hidrogel também permite a incorporação de peptídeos ECM-mimética para isolar os efeitos de interações específicas célula-ECM. Hidrogel é opticamente transparente para que células vivas podem ser fotografadas na cultura 3D. Finalmente, HA hidrogel culturas são compatíveis com as técnicas convencionais para análises moleculares e celulares, incluindo PCR, mancha ocidental e cryosectioning seguido por mancha da imunofluorescência.

Para cada lote de thiolated HA, o grau de thiolation deve ser verificado usando H1-NMR ou teste de um Ellman. HA modificação usando o procedimento descrito aqui consistentemente gera ~ 5% thiolation (definido como a razão molar de tióis de dissacarídeos HA) (Figura 1).
Configurando esta nova plataforma de cultura vai exigir cada laboratório para realizar testes rigorosos ...

Aqui, apresentamos um protocolo para cultura tridimensional de células de glioblastoma paciente-derivado dentro ortogonalmente sintonizáveis biomateriais projetados para imitar a matriz do cérebro. Essa abordagem fornece uma em vitro, plataforma experimental que mantém muitas características de na vivo glioblastoma células tipicamente perdidas na cultura.

Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-Dimensional cultura de células de Glioblastoma derivado de paciente

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre tumores de glioblastoma e como a matriz extracelular pode facilitar a resistência ao tratamento. Essa técnica permite a construção modular de plataformas de cultura de células 3D adaptáveis que podem ser usadas para cultivar células de glioblastoma derivadas de pacientes em um ambiente que se aproxima melhor do cérebro nativo. Para começar, coloque moldes de borracha de silicone limpos e secos em cada poço de uma placa de 12 poços não tratada com cultura de tecidos e use a extremidade romba limpa de uma ponta de pipeta para aderir os moldes ao fundo da placa.Depois de verificar a vedação entre os moldes e o fundo do poço, coletar as gliomasferas dissociadas de uma cultura de células de glioblastoma por centrifugação e ressuspender o pellet em um mililitro de enzima de dissociação celular. Após cinco minutos à temperatura ambiente, agite o tubo com batidas suaves e interrompa a reação enzimática com quatro mililitros de meio completo. Centrifugue novamente as células e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo fresco antes de coar as células através de um filtro de 70 micrômetros.Lave o filtro com mais quatro mililitros de meio completo e divida a suspensão em duas alíquotas de oito vezes 10 elevado a quarto de células por tubo de centrífuga. Coletar as células por centrifugação e ressuspender um pellet em 80 microlitros de maleimida de polietilenoglicol recém-preparado ou PEG-Mal-RGD e um pellet em 80 microlitros de solução PEG-Mal-CYS recém-preparada por molde. Usando uma ponta de micropipeta de orifício de 200 microlitros de largura, adicione 40 microlitros de solução de ácido hialurônico em cada molde de silicone de borracha, seguido por 40 microlitros da solução de célula PEG-Mal-CYS ou PEG-Mal-RGD.Pipetagem rapidamente para cima e para baixo não mais do que 10 vezes por molde para misturar. Devido ao rápido tempo de gelificação, uma vez que os dois componentes do hidrogel são misturados, é importante usar uma ponta de pipeta de orifício largo para misturar as soluções de forma rápida, mas completa. Esta etapa requer prática.Em seguida, coloque as células encapsuladas em gel em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por cinco a 10 minutos. No final da incubação, adicione dois a dois mililitros e meio de meio de cultura a cada gel e use uma ponta de pipeta estéril de dois microlitros e uma pinça para separar suavemente os géis das laterais dos moldes. Em seguida, use uma pinça esterilizada para remover os moldes dos poços da placa e retorne a placa à incubadora de células.Para extração de célula única, no ponto final experimental apropriado, remova o sobrenadante dos poços e transfira a cultura de gel de cada poço para tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Incube os géis com 500 microlitros de enzima de dissociação celular por cinco minutos a 37 graus Celsius com movimentos ocasionais e transfira as misturas para tubos de centrífuga individuais de 50 mililitros contendo cinco mililitros de meio completo por tubo em gelo. Em seguida, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 20 para aspirar suavemente cada suspensão celular através da ponta da agulha oito vezes e filtrar as misturas através de um filtro de células de 70 micrômetros em novos tubos de centrífuga de 50 mililitros.Ao dissociar as células do hidrogel, certifique-se de pressionar o êmbolo da seringa lentamente para evitar o deslizamento, o que pode comprometer a integridade da membrana celular. Lave os filtros com cinco mililitros de meio fresco e colete as células por centrifugação. Em seguida, suspenda novamente os pellets no tampão de citometria de fluxo apropriado para coloração e classificação de acordo com os protocolos padrão.Para criopreservar os hidrogéis para seccionamento, remova o sobrenadante dos poços da placa e incube as culturas de gel com dois mililitros de paraformaldeído a 4% a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, substitua o fixador por dois mililitros de sacarose a 5% em PBS por uma hora de incubação em temperatura ambiente. No final da incubação, substitua a sacarose a 5% por dois mililitros de sacarose a 20% em PBS por duas incubações de 30 minutos em temperatura ambiente.Após a segunda incubação de 30 minutos, atualize a sacarose a 20% mais uma vez para uma incubação de quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, substitua suavemente a sacarose na solução PBS por 20% de sacarose na temperatura ideal de corte ou meio OCT, tomando cuidado para cobrir cada gel inteiramente e coloque a placa a quatro graus Celsius por mais três horas. No final da incubação, use uma espátula grande e plana para transferir cuidadosamente cada gel para o centro de um molde de incorporação e preencha os moldes de incorporação com OCT puro logo abaixo das bordas superiores dos moldes.Em seguida, congele as amostras de hidrogel em 2-metilbutano resfriado e corte as amostras de hidrogel em um criostato de acordo com os protocolos padrão. Colocar 80 microlitros de hidrogéis em quatro vezes 10 elevado a quatro células por densidade de gel resulta consistentemente em taxas de proliferação comparáveis ou melhores do que as culturas de gliomasfera. Por exemplo, quatro dias após o encapsulamento, as células de glioblastoma em RGD contendo hidrogéis exibem um fenótipo invasivo, enquanto as células cultivadas em hidrogel usando PEG-Mal-CYS demonstram uma morfologia esférica.Essas culturas robustas permitem a avaliação dos efeitos de reagentes como o ciclo-RGD solúvel, que interrompem competitivamente as interações das células com o RGD incorporado aos hidrogéis. Usando imagens de bioluminescência, um número relativo de células viáveis pode ser observado em culturas de hidrogel, por exemplo, durante um tratamento de 12 dias com erlotinibe. A análise de Western blot da poli ADP polimerase clivada indica que o grau relativo de apoptose em células knockdown CD44 tratadas é maior do que o observado em células de glioblastoma de tipo selvagem cultivadas em hidrogéis de ácido hialurônico a 0,5%.Além disso, as criossecções de culturas 3D baseadas em hidrogel preservam a matriz extracelular depositada pelas células cultivadas. Por exemplo, permitindo a análise dos padrões de deposição de mudanças de colágeno tipo quatro após o tratamento com erlotinibe. Ao tentar este procedimento, é importante avaliar o grau de tiolação de cada lote de ácido hialurônico.Também é importante criar novas soluções precursoras para cada vez que você fizer um experimento de encapsulamento celular. O desenvolvimento dessa técnica abriu caminho para os pesquisadores do câncer avaliarem a eficácia de tratamentos novos e existentes e explorarem os mecanismos de resistência ao tratamento e progressão do câncer cerebral, tudo usando um modelo ex vivo.

hyaluronic-acid-based-hydrogels-for-3-dimensional-culture-patient

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra uma técnica para estabelecer uma cultura tridimensional de células gliais. As células gliais derivadas do cérebro de rato são encapsuladas em uma matriz polimérica fotoreticulável contendo componentes da matriz extracelular. Ao incubar em um meio de crescimento, as células gliais proliferam dentro da matriz de suporte para criar uma cultura tridimensional.

Estabelecendo uma cultura tridimensional de células gliais derivadas do cérebro de rato

Este vídeo demonstra como as gliomasferas, derivadas de tumores cerebrais, são separadas em células únicas e encapsuladas em um hidrogel à base de ácido hialurônico. Esse processo promove interações célula-célula, formando um modelo de glioblastoma tridimensional estruturado.

Um hidrogel à base de ácido hialurônico para cultura tridimensional de células de glioblastoma

Xenoenxertos derivados de pacientes de glioblastoma multiforme podem ser miniaturizados em microtumores vivos usando o sistema de cultura de biogel humano 3D. Este ensaio tumoral 3D semelhante ao in vivo é adequado para testes de resposta a medicamentos e perfis moleculares, incluindo análise cinômica.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

Neste documento, apresentamos um protocolo para a cultura 3D do rato as células da glia derivado do cérebro, incluindo astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Vamos demonstrar a cultura de células primárias, síntese de hidrogel de ácido hialurônico methacrylated (HAMA), encapsulamento HAMAphoto-polimerização e celular e amostra de processamento de imagem microscópica confocal e varredura de elétrons.

Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.

Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.

Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz

Apresentamos um método para replicar o microambiente tumoral de glioma na frente invasiva que incorpora fluxo de fluido intersticial. Este modelo é um hidrogel de hialuronano-colágeno I em um inserto de cultura de tecidos onde uma cabeça de pressão de fluido pode ser aplicada. A invasão pode ser quantificada e as células podem ser isoladas ou lisadas.

Um modelo fotopolimerizável de ácido hialurônico-colágeno do microambiente de glioma invasivo com fluxo intersticial

Aqui, apresentamos um protocolo demonstrando o uso de hidrogel como uma estrutura de cultura de células tridimensional (3D) para cultura de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) e introduzindo fotobiomodulação (PBM) para aumentar a proliferação de ADSCs dentro do ambiente de cultura 3D.

Cultura Celular Tridimensional de Células-Tronco Derivadas do Tecido Adiposo em Hidrogel com Aumento da Fotobiomodulação

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Aprenda a cultivar células de glioblastoma derivadas de paciente em hidrogel de ácido hialurônico para modelagem 3D. Este método modular preserva características tumorais in vivo e permite estudar resistência a tratamentos.

Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-Dimensional cultura de células de Glioblastoma derivado de paciente

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