Name: Oclusão de artéria Cerebral média, permitindo a reperfusão através de reparação de artéria carótida comum em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprenda a técnica de reparação da artéria carótida comum em ratos para modelos experimentais de AVC, permitindo reperfusão na artéria cerebral média. Este método reduz variabilidade e melhora a reprodutibilidade dos resultados.

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Este trabalho foi financiado pelo centro nacional para a substituição, refinamento e redução de animais na pesquisa (NC3Rs; NC/M000117/1 de CG). Os autores agradecer o pessoal da divisão de serviços biomédicos, Universidade de Leicester, para seus cuidados dos animais experimentais e Maria Viskaduraki para seu Conselho de estatístico. Os resultados representativos são adaptados com a permissão de doença modelos & mecanismos11.

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<li>Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Brain+Edema+on+Infarct+Volume+in+a+Focal+Cerebral-Ischemia+Model+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Effect of Brain Edema on Infarct Volume in a Focal Cerebral-Ischemia Model in Rats.</a> Stroke. 24 (1), 117-121 (1993).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Indução de filamento de transiente MCAO em roedores é o mais utilizado modelo de curso experimental, pois permite reperfusão na área afetada, imitando a ocorrência de eventos após acidente vascular cerebral isquêmico clínica7. Relatado aqui é uma abordagem cirúrgica alternativa ao método tradicional de induzida por filamento MCAO transitória em ratos. A abordagem alternativa, envolvendo tratamento de analgesia, evasão de ligadura do TCE e reparação de incisão de CCA, resulta em uma reduzida variabilidade de LV quando avaliados usando MRI e métodos de coloração histológica11.
Abordagens tradicionais para induzir MCAO largamente contam sobre a transecção, ou pelo menos a ligadura, do TCE, que mostrou, em ratos, afetam o comportamento de beber e um aumento na perda de peso de corpo seguindo o MCAO14. O protocolo definido aqui, em ratos, com a vacância de ligadura da ECA e adição de analgesia, sugeriu uma redução na perda de peso de corpo seguindo a MCAO com nenhum efeito sobre o volume da lesão. O uso de analgesia é evitado, ou pelo menos não relatado, na maioria dos estudos experimentais de AVC, devido a possíveis efeitos de confusão sobre os resultados experimentais. No entanto, evitar completamente a analgesia não é sempre justificada e há uma necessidade de equilíbrio entre as necessidades de bem-estar dos animais, com a realização dos objectivos científicos.
Diferenças no tamanho do animal, estirpe e anatomia cerebrovascular, além das variações de tamanho e tipo de filamento, todos são sugeridas para influenciar o curso resultados23,24. A abordagem alternativa descrita aqui evita a dependência da vaca durante a reperfusão, reduzindo assim, pelo menos em parte, a variabilidade entre animais no volume da lesão. Anatomia de vaca é altamente variável em camundongos, em particular no C57BL /6 tensão, que é frequentemente utilizada em estudos experimentais de AVC. 90% dos camundongos C57BL/6 têm uma vaca incompleta devido a uma variado posterior comunicação artéria (PcomA) permeabilidade, que pode ter um efeito sobre o volume de danos isquêmicos devido a perfusão insuficiente de estruturas fora do território da MCA,13, 25. reparar o CCA em camundongos, como mostrado aqui, resultados no restabelecimento do sangue fluem através do CCA para a área isquêmica, conforme descrita em ratos15. Os dados representativos aqui mostram que a reparação do CCA aumenta reperfusão, embora o fluxo de sangue no CCA não foi medido diretamente. No entanto, é possível que o cirurgião Visualizar o CCA reperfusão com sangue após a reparação do navio, como ele retorna para um estado de completo e pulsante ao longo do tronco, proximal e distal para o local de reparação. Esta confirmação visual, juntamente com as leituras de flowmetry Doppler laser da área isquêmica, pode ser usada para confirmar o reparo bem sucedido do navio. O tempo entre a aplicação de almofada de tecido e a remoção do clipe de navio desde o CCA pode ter um impacto sobre a patência resultante do CCA, como reduzir o tempo entre a aplicação de almofada de tecido e a remoção do grampo impedirá a almofada de tecido de aderir ao o lado oposto do CCA. Embora tecnicamente desafiador, o procedimento MCAO alternativo explicado aqui não requer nenhumas habilidades adicionais do que aqueles necessários para realizar a indução cirúrgica de MCAO em camundongos.
Tradicionalmente associado com uma alta variabilidade em medidas de resultados, estudos experimentais de AVC podem ter uma tendência a ser de fraca potência. Requisitos éticos e de bem-estar em combinação com preocupações económicas e práticas podem contribuir para estudos, sendo de fraca potência. Reduzindo a variabilidade no resultado e, portanto, produzindo resultados mais consistentes de lesão do outro lado um grupo experimental, cálculos de energia mais eficazes podem ser executados com o objectivo último de estudos devidamente alimentada.
Em conclusão, este procedimento alternativo de reparação do CCA, em ratos, resulta em menor variabilidade de volume de lesão após acidente vascular cerebral experimental e cálculos de energia permite que pequenos grupos experimentais devem ser exigidas para um efeito de tratamento, quando for o caso de teste são usados.

Das principais causas de derrame cerebral é isquemia focal no território da artéria cerebral média. Ativador de plasminogênio tecidual (tPA) é o tratamento farmacológico somente disponível com eficácia comprovada, apesar de numerosos testes clínicos direcionados para acidente vascular cerebral isquêmico1,2. No entanto, devido a preocupações de segurança e uma janela terapêutica estreita (< 4,5 h), apenas ~ 15% de todos os pacientes com AVC são elegíveis para receber o tPA, e as taxas de recanalização podem ser < 50%3,4.
Reprodutíveis e clinicamente relevantes de modelos animais de AVC são considerados essenciais para informar o desenvolvimento de tratamentos terapêuticos de tempos novos e potenciais. No entanto, devido a preocupações sobre a consistência e a variabilidade nos resultados com modelos animais, continua a ser importante refinar os modelos na vivo existente para melhorar a tradução de estudos pré-clínicos para a clínica. A falta de tradução da eficácia pré-clínica experimental de tratamentos potenciais para uso clínico é uma preocupação constante para o curso de pesquisa5. Razões do fracasso da tradução são susceptíveis de ser múltiplo e podem estar relacionadas com, por exemplo, o delineamento experimental, atrasos de tratamento, heterogeneidade clínica de acidente vascular cerebral, e as limitações dos modelos animais utilizados6. Um desafio fundamental para a investigação de acidente vascular cerebral continua a ser o desenvolvimento de tratamentos seguros e eficazes.
Oclusão da artéria cerebral média (MCAO) pela inserção de filamento intraluminal é o mais frequentemente usadas em vivo modelo roedor do curso experimental. Esse modelo permite que a restauração do fluxo sanguíneo após uma indução de isquemia, imitando os eventos que ocorrem no curso humano7. No entanto, em particular nos ratos, volumes de lesão heterogênea com variados desvios-padrão ocorrerem apesar de definidos protocolos cirúrgicos são aplicadas8,9,10. É comum ver uma distribuição bimodal de pequeno striatal e lesão striato-cortical grandes volumes11. Para induzir isquemia, o filamento é normalmente inserido através de uma incisão do CCA ou ECA que então permanecem permanentemente ligados12. A ligadura permanente do CCA impede o restabelecimento do fluxo sanguíneo na artéria carótida interna (ACI) e, posteriormente, o território MCA. Isso faz com que a reperfusão ser dependente do suprimento colateral dentro do círculo de Willis (vaca). A estrutura de vaca tem variabilidade anatômica entre animais individuais, particularmente em C57BL/6 ratos-a cepa normalmente usada na vivo derrame pesquisa13. Um método alternativo, da inserção de filamento através do ECA, que permite a perfusão contínua através do CCA, mas compromissos deste método o suprimento arterial para o território do TCE, que mostrou, em ratos, para ter um efeito prejudicial sobre do animal bem-estar14.
A dependência da vaca para suprimento colateral e reperfusão no modelo MCAO estabelecido, em parte, explica a variabilidade de volume de lesão após a oclusão. Descrevemos um procedimento cirúrgico murino alternativo onde ligadura ECA é evitada e a incisão de CCA é reparada, permitindo assim a reperfusão através do CCA, independente da vaca. O reparo da incisão CCA tem demonstrado anteriormente em ratos para resultar em uma bem sucedida reperfusão através do CCA15. Podemos ter aplicado essa abordagem com êxito em ratos11 e apresente-se aqui o protocolo que resulta em uma variabilidade reduzida no volume da lesão, as principais medidas utilizadas em estudos experimentais de AVC.
Neste protocolo, demonstramos como empreender MCAO através da inserção de filamentos de navio CCA seguida de reparação de embarcação CCA, que envolve uma aplicação de selante e almofada de tecido para permitir a reperfusão.

<table><tbody><tr><td>Sonda flexível de fibra óptica simples de 0,7 mm</td><td>Moor Instruments, UK</td><td>P10d</td><td>Utilização com código de sonda principal: VP10M200ST</td></tr><tr><td>7-0 monofilamento revestido de silicone</td><td>Doccol, EUA</td><td>701956PKRe</td><td>O artigo depende do tamanho e peso do animal - utilize as directrizes do fabricante. O código do produto aqui foi usado para resultados representativos mostrados no artigo.</td></tr><tr><td>Sistema de ressonância magnética pré-clínica 9.4T</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia, EUA</td><td>MY11520101</td><td>Equipado com bobinas de gradiente e RF adequadas para imagens cerebrais</td></tr><tr><td>de camundongos Equipamentos de monitoramento e gating de animais</td><td>SA Instruments, Stony Brook, Nova York, EUA</td><td>22124005</td><td>Monitoramento de temperatura e respiração compatível com ressonância magnética</td></tr><tr><td>Bupivacaína</td><td>National Veterinary Services, Stoke-on-trent, Reino Unido</td><td>512345</td><td>Marcaine</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mice</td><td>Charles River, Oxford, Reino Unido</td><td>B6JSIMA49D</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Norbrook Laboratories</td><td>143658</td><td>Carprieve 5% p/v Solução injetável para pequenos animais</td></tr><tr><td>Solução de limpeza das mãos com clorexidina a 4%</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth, Reino Unido</td><td>MOLN10008780</td><td>HibiScrub Limpador antimicrobiano para as mãos, Molnlycke Health</td></tr><tr><td>Care Cotonetes</td><td>National Veterinary Services, Stoke-on-trent, Reino Unido</td><td>213512</td><td>Qualquer corpo de plástico, ponta de cotonete são adequados uma vez esterilizados por autoclavagem.</td></tr><tr><td>Estereoscópio de dissecação</td><td>Carl Zeiss</td><td>OPMI99</td><td>Equipamento residente. Qualquer estereoscópio de dissecação binocular capaz de ampliação x1-x5 será adequado.</td></tr><tr><td>suturas solúveis 6-0</td><td>National Veterinary Services, Stoke-on-trent, Reino Unido</td><td>9544</td><td>Suturas absorvíveis Vicryl 6/0 revestido com Ethicon (código Eticon: W9981)</td></tr><tr><td>Suporte de sonda Donut</td><td>Moor Instruments, UK</td><td>PHDO</td><td>Suporte de sonda para mouse, necessário para ser usado com sonda de fibra óptica única quando usado com máquina de fluxo doppler a laser.</td></tr><tr><td>fórceps dumont #5</td><td>World Precision Instruments, Hertfordshire, Reino Unido</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Selante de fibrinogênio e trombina</td><td>Baxter, Berkshire, Reino Unido</td><td>1502243</td><td>TISSEEL Soluções prontas para uso para selante 2 mL</td></tr><tr><td>de alimentos em gel</td><td>Grupo Datesand, Manchester, Reino Unido</td><td>72065022</td><td>Recuperação de gel dietético</td></tr><tr><td>Pacote de software de medição e exibição de imagens</td><td>3D</td><td>Slicer https://www.slicer.org/</td><td>Versão 4.0</td></tr><tr><td>Pacote de software de medição e exibição de imagens</td><td>NIH, Maryland, EUA</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td><td>Monitor NIH/ImageJ</td></tr><tr><td>LDF</td><td>Moor Instruments, Reino Unido</td><td>moorVMS-LDF</td><td></td></tr><tr><td>micro vannas scissors</td><td>InterFocus Ltd, Linton, UK</td><td>15000-08</td><td>Outras tesouras de mola microvannas podem ser usadas como alternativa, embora sejam necessárias pontas finas.</td></tr><tr><td>Clipe microvascular</td><td>World Precision Instruments, Hertfordshire, Reino Unido</td><td>15911</td><td>10 G Clipe de vaso</td></tr><tr><td>Suportes de clipe microvascular</td><td>World Precision Instruments, Hertfordshire, Reino Unido</td><td>14189</td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição e análise de ressonância magnética</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia, EUA</td><td>VnmrJ Versão 4.2</td><td>Revisão A</td></tr><tr><td>no. 15 bisturi</td><td>Suprimentos de laboratório científico, Nottingham, Reino Unido</td><td>INS4678</td><td>Bisturi estéril nº 15 - número do fabricante P305. Outros fornecedores estão disponíveis.</td></tr><tr><td>Sutura 6-0 não solúvel</td><td>National Veterinary Services, Stoke-on-trent, Reino Unido</td><td>W529</td><td>Ethicon Mersilk Sutures</td></tr><tr><td>Lubrificante ocular</td><td>National Veterinary Services, Stoke-on-trent, Reino Unido</td><td>847288</td><td>Lacrilube (5100G13)</td></tr><tr><td>Gel de correspondência óptica</td><td>Moor Instruments, Reino Unido</td><td>PMG</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de oximetria de pulso</td><td>Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, EUA</td><td>MouseOx</td><td>MouseOx - rato & oxímetro de pulso do rato & monitor fisiológico Use com sensor de coxa de camundongo.</td></tr><tr><td>Gel de reidratação</td><td>Datesand group, Manchester, Reino Unido</td><td>70015022</td><td>HydroGel</td></tr><tr><td>Máquinas de cortar cabelo pequenas</td><td>vetproductsuk.com</td><td>HS61</td><td>Contura Aparador/aparador sem fio</td></tr><tr><td>Solução estéril de NaCl a 0,9%</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth, Reino Unido</td><td>LOCA3528286</td><td>CLORETO DE SÓDIO 0,9% P/V INFUSÃO INTRAVENOSA BP 500 ML EM ECOFLAC&frac12; Placa</td></tr><tr><td>de Petri estéril</td> PLUS <td>VWR International Ltd, Lutterworth, Reino Unido</td><td>5168021</td><td>placa de Petri estéril de 50 mm. Qualquer marca é adequada. É necessário um diâmetro mínimo de 50 mm.</td></tr><tr><td>Adesivo de tecido tópico</td><td>World Precision Instruments, Hertfordshire, Reino Unido</td><td>503763</td><td>GLUture adesivo de tecido tópico</td></tr><tr><td>supercola à prova d'água</td><td>Loctite</td><td>Loctite Supercola Precision Max</td><td>Disponível na maioria das lojas de ferragens.</td></tr><tr><td>Chip de papel branco</td><td>Datesand group, Manchester, Reino Unido</td><td>CS1BPB</td><td>Pure-O'Cel</td></tr></tbody></table>

oclusão de artéria cerebral média, permitindo a reperfusão através de reparação de artéria carótida comum em ratos

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

O acidente vascular cerebral isquêmico é das principais causas de incapacidade a longo prazo adulta e morte em todo o mundo. Os tratamentos atuais disponíveis são limitados, com apenas ativador do plasminogênio tecidual (tPA) como um tratamento de droga aprovada para o alvo Derrames isquêmicos. A pesquisa atual em matéria de acidente vascular cerebral isquêmico centra-se na melhor compreensão da fisiopatologia do curso, para desenvolver e investigar novos alvos farmacêuticos. Modelos de curso experimental confiança são cruciais para a progressão de potenciais tratamentos. O modelo de oclusão (MCAO) da artéria cerebral média é clinicamente relevante e o mais frequentemente usado modelo cirúrgico de acidente vascular cerebral isquêmico em roedores. No entanto, os resultados deste modelo, tais como o volume da lesão, estão associados com altos níveis de variabilidade, particularmente em camundongos. O modelo alternativo de MCAO descrito aqui permite a reperfusão da artéria carótida comum (CCA) e a perfusão aumentada do território da artéria cerebral média (MCA), usando uma almofada de tecido com selante baseado em fibrinogênio para reparar o navio e o melhor bem-estar dos ratos, evitando a ligadura da artéria carótida externa (ECA). Isto reduz a dependência sobre o círculo de Willis, que é conhecido por ser anatomicamente altamente variável em camundongos. Dados representativos mostram que usar esta abordagem alternativa cirúrgica diminui a variabilidade em volumes de lesão entre a abordagem tradicional de MCAO e a abordagem alternativa descrita aqui.

Um total de 24 camundongos C57BL/6 machos adultos, pesando entre 24 – 31 g no momento da cirurgia, foram utilizados no estudo. Um animal morreu após a oclusão da artéria cerebral média (MCAO) e um foi excluído devido a complicações cirúrgicas. Os dados aqui apresentados são tomados a partir de um trabalho previamente publicado pelos autores. Estes foram usados para ilustrar o efeito da reparação do navio na MCAO resultados11. Todos os dados são expressos como thr média ± desvio-padrão. Os dados foram avaliados estatisticamente para normalidade através do teste de normalidade "omnibus" D'Agostino-Pearson. Os dados paramétricos foram comparados usando o Student t-teste (para duas médias) e One-Way ANOVA com o teste de Sidak (vários meios). Dados não-paramétricos foram comparados através do teste de Mann-Whitney U. A variabilidade dos dados paramétricos foi avaliada por meio de um F-teste, e variabilidade de dados não-paramétricos foi avaliada utilizando o teste de Levene.
Normalmente, em procedimentos MCAO, o filamento de oclusão é inserido o CCA e o TCE é ligado para impedir este filamento transformasse em TCE, ao invés de ICA. Uma evasão de ligadura do TCE e a adição de analgesia mostraram uma tendência de perda de peso reduzido em 48 h post-MCAO, quando comparados com dados de estudos anteriores realizados pelo mesmo cirurgião para a mesma hora MCAO usando ligadura de TCE com nenhuma analgesia, Considerando que o LV apareceu não afetado, veja a Figura 1.
Os ratos foram submetidos a uma isquemia induzida por MCAO 60 min, seguida de reperfusão com reparo de navio CCA ou com a ligadura típica da abordagem CCA. Um esquema do CCA reparado ligado e unligated é mostrado na Figura 2.
Laser Doppler flowmetry foi usado para confirmar a fluxo perfusão sanguínea no território da MCA no MCAO, antes e após o reparo de navio do CCA. A Figura 3 demonstra a 5 min após a remoção do filamento, o fluxo sanguíneo cerebral regional (rCBF) aumentada significativamente na região do cérebro do MCA. A perfusão foi mantida até o conserto do navio, com um aumento da perfusão ao território MCA mostrado após o reparo de navio CCA, sugerindo que a reparação do CCA permitiu uma perfusão sanguínea aumentada ao território isquêmico comparado a confiança na o círculo de Willis sozinho.
T2-weighted MRI foi usada para determinar o total LV e DTI exames foram usados para determinar o núcleo LV, 48 h após o MCAO. A figura 4A não mostra nenhuma diferença significativa no LV total ou núcleo entre os grupos de procedimento ligados e reparação. No entanto, a variabilidade de dados para ambos total e LV, do núcleo como avaliada utilizando o teste do Lavene para não-paramétricos ou o F-teste para dados paramétricos, foi significativamente reduzida no seio do grupo de reparação do CCA. O LV total foi dividido em LV cortical e subcortical, conforme mostrado na Figura 4B. A porção cortical foi significativamente menos variável no grupo de reparação CCA, Considerando que a porção cortical secundário da lesão foi afetada entre os dois grupos processuais.
Uma análise do poder indicou que menos animais por grupo de tratamento seria necessários demonstrar uma redução de 30% no LV MCAO usando CCA reparação contra o procedimento típico de CCA-ligado a seguir, consulte a tabela 1. Uma suposição de energia 1-β = 0,8 e nível de significância α = 0,05 e uma previsão de redução de 30% no LV entre o hipotético controle e teste grupos foram utilizados para a análise do poder. Além disso, supunha-se uma variância igual entre os grupos. A tabela 1 mostra o número de animais necessários para o teste e grupos de controle quando é usado também o método típico CCA-ligado ou o método de reparo CCA atualizado, conforme descrito aqui, é usado. Observe que o grupo de teste refere-se a um hipotético grupo tratado dos animais e grupo controle refere-se a um grupo de controle hipotético; ambos os grupos que passam por MCAO.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig1v2.jpg"> Figura 1: combinado de tratamento de analgesia e a omissão de ligadura do Tribunal de contas sobre os resultados a seguir MCAO. (A) peso de corpo, indicado em percentagem de peso pré-MCAO, diminuiu o primeiro d 2 o MCAO para ambos os grupos a seguir. O grupo de ECA-unligated (analgesia-tratados com nenhuma ligadura de ECA no MCAO) mostrou uma tendência de perda de peso reduzido no segundo dia após a MCAO. (B), este painel mostra o volume de lesão (mm3) medido pelo cloreto de triphenyltetrazolium padrão (TTC) coloração 48 h após o MCAO. Os dados apresentados são o média ± desvio-padrão. ECA ligado: n = 17, ECA unligated: n = 10. Esta figura foi modificada de Trotman-Lucas et al . 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig1v2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig2.jpg"> Figura 2: diagrama esquemático mostrando o método padrão do CCA e o CCA alternativo reparar método seguindo MCAO. (A) este esquema retrata uma CCA permanentemente ligado usando suturas não-solúvel, aplicadas a cada lado da incisão CCA, originando a ligadura permanente do CCA certo. (B) este esquema retrata o método alternativo de reparação CCA. Uma almofada pequena tecido revestido com fibrinogênio e trombina vedador é usado para cobrir a incisão de CCA, lacrá-lo para permitir que a perfusão completa do direito CCA. Esta figura foi modificada de Trotman-Lucas et al . 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig3.jpg"> Figura 3: parâmetros de fluxo (rCBF) sanguíneo cerebral Regional seguindo MCAO. O rCBF mudou 5 min após a remoção do filamento MCAO para ambos os CCA-ligados e CCA-reparado grupos (post-MCAO), em relação a rCBF medido durante MCAO. Este painel mostra os dados do rCBF imediatamente antes do reparo de navio do CCA (pre-reparação) e 5 min após o reparo do CCA (pós-reparo). Aumento significativo da rCBF é mostrado 5 min após a remoção do filamento (post-MCAO) em ambos os grupos. Aumento do rCBF adicional é mostrado após o reparo do CCA (pós-reparo) no grupo de reparação do CCA. Nenhuma diferença no rCBF é mostrada entre 5 min post-MCAO e pre-reparação. Os dados mostrados são condensados a partir dos dados de tempo-curso analisados relatórios pontos chave tempo, aqui como o média ± desvio-padrão. CCA ligado: n = 10, CCA reparada: n = 10; P &lt; 0,01, * * *P &lt; 0,001, ns: não significativo. Esta figura foi modificada de Trotman-Lucas et al . 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig4.jpg"> Figura 4: análise do volume lesão obtidos por técnicas de MRI. (A) este painel mostra o volume de lesão (LV; mm3) a 48 h após MCAO, o LV total retirado em imagens de T2-weighted MRI (LV Total) e o núcleo LV tiradas do DTI varreduras e análise (núcleo LV). Representante imagens mostram o volume total de lesão de uma imagem de fatia de varredura T2 com a DTI núcleo lesão volume máscara aplicada. A variabilidade dentro dos grupos foi significativamente reduzida para ambos o LV total (P = 0.015, reparação CCA: n = 10, CCA ligado: n = 10, F-teste) e o núcleo LV (P = 0,043, reparação CCA: n = 9, CCA ligado: n = 6, teste do Lavene), avaliada por meio de um F-teste para dados paramétricos ou teste de Levene para dados não-paramétricos. (B) este painel mostra o LV a 48 h após MCAO, tomadas a partir de imagens de T2-weighted MRI e dividido em áreas de lesão cortical e subcortical. A reparação do CCA reduziu significativamente a variabilidade dos dados (P = 0,03, F-test) na porção cortical da lesão, mas nenhum efeito sobre os dados, mostrou-se variabilidade na porção subcortical da lesão. Reparação CCA: n = 10, CCA ligado: n = 10. Os dados apresentados são o média ± desvio-padrão. # P &lt; 0,05 (F-test), xP &lt; 0,05 (teste do Lavene). Esta figura foi modificada de Trotman-Lucas et al . 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Abordagem</td>
			<td>Volume de lesão (LV, mm3; média ± d.p.)</td>
			<td>Poder</td>
			<td>Nível de significância</td>
			<td>Diferença de anticiapted</td>
			<td>Tamanho do grupo exigido</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCA ligados (abordagem tradicional)</td>
			<td>94.08 ± 53.79</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.05</td>
			<td>30%</td>
			<td>
n = 58</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCA reparada (nova abordagem)</td>
			<td>51.73 ± 22,78</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.05</td>
			<td>30%</td>
			<td>
n = 35</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: análise do poder representativo comparando ligadura de CCA tradicional com a alternativa CCA reparar método explicado aqui. Esta tabela mostra a análise de poder realizada para calcular o tamanho de grupo antecipado necessário para detectar uma diferença significativa entre um grupo de controle, (nova) abordagem tradicional ou alternativa e um grupo de teste (previsto) em LV. A tabela mostra o grupo tamanhos como necessário se presume-se uma potência de 0,8, um nível de significância de 0,05 é aplicado, e se o grupo de teste previsto mostra uma diferença de 30% no LV comparados ao grupo controle. A tabela mostra os resultados para ambas as abordagens MCAO (CCA-ligados e o CCA-reparada) para determinar se há uma diferença no número de animais necessários para obter uma diferença de 30% na LV. Para ambos os métodos, presume-se uma variância igual entre o teste e grupo controle. Esta figura foi modificada de Trotman-Lucas et al . 11.

Oclusão de filamento intraluminal da artéria cerebral média é o modelo mais frequentemente utilizadas na vivo do acidente vascular cerebral experimental em roedores. Uma abordagem alternativa cirúrgica para permitir a reparação de artéria carótida comum é realizada aqui, que permite a reperfusão da artéria carótida comum e uma reperfusão completa no território da artéria cerebral média.

Oclusão de artéria Cerebral média, permitindo a reperfusão através de reparação de artéria carótida comum em ratos

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo experimental de derrame, como como reduzir as associadas a esses modelos e como melhorar a reprodutibilidade. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a re-perfusão através da artéria carótida comum, e, portanto, não depende do círculo de Willis, que pode variar anatomicamente entre os animais, podendo, portanto, contribuir para a variabilidade vista em medidas experimentais de desfecho. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de reparo da embarcação CCA são difíceis de aprender devido à dificuldade técnica envolvida ao utilizar o selante para garantir que a CCA esteja totalmente patenteada, após o reparo.Para começar, prepare e anestesia o mouse de acordo com o protocolo de teste. Em seguida, use uma lâmina de bisturi número 15 para fazer uma incisão de linha média de 1,5 cm no pescoço ventral exposto. Usando técnicas de dissecção contundente, retraia suavemente as glândulas salivares para o lado, para expor a traqueia.Em seguida, dissecar a artéria carótida comum, ou CCA, livre do tecido circundante e nervo vagal. Depois disso, passe duas pequenas seções de uma sutura 6-0 não dissolável abaixo da CCA, dorsal para a CCA, e ventral para o nervo vagal. Desenhe uma gravata de seda mais perto do cirurgião, e amarre-a vagamente ao redor da CCA.Em seguida, amarre uma segunda gravata de seda em direção à bifurcação das artérias carótidas internas e externas. Em seguida, aplique um clipe microvascular logo acima da gravata distal, garantindo que a bifurcação não seja obstruída. Use uma tesoura micro venosa para fazer um pequeno buraco na CCA.Insira um micro filamento revestido de silicone 7-0 no CCA e avance-o em direção ao clipe microvascular. Em seguida, aperte a gravata distal para fixar o filamento no lugar. E use os suportes de clipe para remover o clipe microvascular.Em seguida, avance o filamento para a artéria carótida interna, ou ICA. Uma vez que a cabeça de filamento passe a gravata distal, puxe a gravata mais firmemente, para evitar a perda de sangue. Usando a gravata de seda distal, levante e puxe a CCA para o lado externo do corpo do rato, e guie o filamento até a curva, passando pela abertura da artéria pterygopalatina, ou PPA.Uma vez que o filamento esteja no lugar, fixe-o apertando ainda mais a gravata de seda distal. No final do período MCAO, retraia o filamento até que a cabeça de filamento branco esteja claramente visível. Em seguida, solte a gravata CCA distal apenas o suficiente para remover a cabeça de filamento a maior parte do caminho, para fora do vaso.Em seguida, remova totalmente a cabeça de filamento da nave. Depois disso, coloque um clipe microvascular na posição horizontal, em direção à bifurcação CCA, e ao lado da gravata distal. Em seguida, coloque outro clipe abaixo da gravata CCA proximal, em direção ao cirurgião.Use cuidadosamente dumont 5 fórceps para remover ambos os laços de seda. E seque a área usando brotos de algodão estéreis. Em seguida, adicione soluções de fibrinogen e selante trombina um e dois, a uma placa de Petri estéril.Utilizando tesoura micro venosa e técnica de dissecção contundente, obtenha uma fina fatia ventral do músculo estenicleidomastoide. Em seguida, usando o Dumont 5 fórceps, pegue o bloco de tecido e misture-o uniformemente através das soluções de fibrinogen e selante thrombin. Aqui é importante garantir que a almofada de tecido seja grande o suficiente para cobrir a incisão CCA.E uma vez misturado entre as duas soluções, deve ser imediatamente colocado sobre a incisão, para evitar a coquelulação excessiva e a má adesão. Uma vez misturado entre as duas soluções, remova a almofada de tecido para a incisão CCA. Coloque a almofada de tecido plana sobre a incisão com pressão média e asseps abertos.Remova rapidamente o clipe microvascular distal, mantendo a almofada de tecido no lugar. Em seguida, alivie lentamente a pressão do bloco de tecidos, permitindo que o sangue flua sob a área de incisão. Agora, solte lentamente e suavemente a pressão do clipe microvascular proximal, em seguida, remova completamente.A remoção do clipe superior permite que uma pequena quantidade de sangue ative o selante. Uma liberação constante do clipe distal permite um aumento gradual de pressão no local da incisão, ativando ainda mais e ajudando a evitar um reparo falho. Finalmente, uma vez que o vaso é selado, suturar a ferida com suturas dissolvíveis 6-0.Neste protocolo, foi realizada oclusão da artéria cerebral média, ou MCAO, em 24 camundongos adultos. A prevenção da ligadura do ECA e a adição de analgesia mostraram tendência de redução da perda de peso em 48 horas após mcao. Cinco minutos após a remoção do filamento, o fluxo sanguíneo cerebral regional aumentou significativamente na região cerebral do MCA.A perfusão foi mantida até o reparo da embarcação, com aumento da perfusão ao território mca, após reparo da embarcação CCA. Isso sugere que o reparo da CCA permitiu o aumento da perfusão de sangue ao território isquêmico, em comparação com a dependência do círculo de Willis sozinho. Uma ressonância magnética ponderada T2 foi usada para determinar o total de LV e DTI scans foram usados para determinar a LV do núcleo em 48 horas após mcao.Não houve diferença significativa entre esses dois grupos. Curiosamente, que uma variabilidade para lv total e núcleo foi significativamente reduzida no grupo de reparação CCA. Nossa análise indicou que menos animais por grupo de tratamento seriam necessários para demonstrar uma redução de 30% na LV, após mcao, utilizando reparo CCA, versus procedimento típico de ligadura CCA.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar para garantir que a embalagem de tecido seja de tamanho suficiente para cobrir a incisão CCA. Além disso, a velocidade é importante, para evitar a sobreagulação do selante, antes de colocar a almofada na CCA.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Filamentosas de oclusão da artéria cerebral média é um modelo comum para o estudo de AVC isquêmico em ratos.

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O intraluminal cerebral média de oclusão da artéria modelo (MCAO) é o modelo mais freqüente dentre os modelos experimentais acidente vascular cerebral isquêmico. Aqui vamos demonstrar todo o modelo em detalhes com o guia de Laser Doppler fluxometria, e os resultados do seu representante.

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O modelo de oclusão intraluminal cerebral média em ratinhos é aqui apresentada. A extensão do enfarte cerebral é avaliada por uma pontuação neurológica e coloração com violeta de cresilo, a coloração de uma alternativa ao TTC, que oferece a grande vantagem de testar em paralelo marcadores de interesse muitos.

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A fim de compreender a patofisiologia de acidente vascular cerebral, é importante o uso de modelos fiáveis. Este documento descreve um dos modelos de AVC mais utilizados em camundongos, denominado o meio modelo de oclusão da artéria cerebral (MCAo) (também denominado o filamento intraluminal ou modelo de sutura) com a reperfusão.

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Descrevemos um modelo de camundongo de AVC induzido pela oclusão da artéria cerebral média usando uma sutura revestida de silicone. O protocolo pode ser aplicado para induzir oclusão permanente ou isquemia temporária, seguida de reperfusão.

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