Name: Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprenda uma plataforma de alto rendimento para rastreamento de Salmonella spp. e Shigella spp. usando PCR em tempo real combinado com cultura guiada. Este método oferece alta especificidade e sensibilidade na detecção de patógenos.

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Este trabalho foi apoiado pela ciência e tecnologia programa de Zhuhai, China (número de concessão de 20171009E030064), a ciência e tecnologia programa de Guangdong, China (número de concessão de 2015A020211004) e da ciência e tecnologia-programa de administração geral Supervisão da qualidade, inspeção e quarentena da República Popular da China (número de concessão de 2016IK302, 2017IK224).

O protocolo segue as orientações definidas pelo Comitê de ética de pesquisa humana de Zhuhai International Travel Healthcare Center. Por favor, use o padrão operação estéril durante o experimento.
1. preparação e composição de meios de cultura
<ol><li>Prepare o caldo de carne nutriente: Dissolver peptona 1%, 0,3% de extrato de carne, 0,5% de cloreto de sódio, 0,1% de glicose em H2O, ajustar o pH a 7,5 e autoclave em 121 ° C por 15 min.</li>
	<li>Prepare o suporte de Selenito cistina: dissolver 0,5% de peptona, Selenito de hidrogênio de sódio 0,4%, 0,4% à lactose, 1% Na2HCO30,001% L-Cistina em H2O, ajustar o pH a 7,0 e ferver por 5 min.</li>
	<li>Preparar a xilose, lisina, placa de ágar (XLD) Deoxycholate: extracto de levedura de dissolver 0,3%, e 0,5% de L-lisina, xilose 0.375%, 0,75% lactose, 0,75% de sacarose, 0,5% de cloreto de sódio, 0,008% de vermelho de fenol, 0,68% de tiossulfato de sódio, citrato férrico de amónio de 0,08%, 0,25% de sódio Deoxycholate do, 1,5% de ágar em H2O e ajustar o pH para 7,4. Em seguida, ferva-a por 5 min e derramá-lo em placas de 90 mm.</li>
	<li>Preparar a placa de ágar cromogênico Salmonella : dissolver o ágar 1,5%, 0,7% de peptona e levedura extrato, reagente seletivo de 1,29% em H2O. Em seguida, ferva-a por 5 min e derramá-lo em placas de 90 mm.</li>
	<li>Preparar a placa de ágar nutriente: dissolver peptona 1%, 0,3% de extrato de carne, cloreto de sódio 0,5% e 1,5% de ágar em H2O e ajustar o pH para 7,3. Então autoclave em 121 ° C durante 15 minutos e despeje-o em placas de 90 mm.</li>
	<li>Preparar a placa de MacConkey agar (MAC): dissolver 2% de peptona, 1% de lactose, cloreto de sódio 0,5%, 0,5% sais biliares de boi 0,0025% vermelho neutro, 1,5% de ágar, violeta de cristal de 0,0001% em H2O e ajustar o pH para 7.2. Então autoclave em 115 ° C por 20 min e derramá-lo em placas de 90 mm.</li>
</ol>2. real-time PCR
<ol><li>Coleta de amostra<ol>
<li>Introduza um swab anal no ânus do paciente 3-5 cm de profundidade e gire-o de 360° ao redor.</li>
		<li>Colocar o swab anal num tubo de colheita estéril. Identificação de amostra de Mark.</li>
		<li>Envie a amostra ao laboratório logo que possível. Nota: Amostras poderiam ser armazenadas a 4 ° C, para não mais de 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pré-enriquecimento<ol>
<li>Adicione 3 mL de caldo nutriente em cada amostra no tubo de coleta.</li>
		<li>Incube a 36 ° C por 6 horas na incubadora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amostra de mistura (opcional)<ol>
<li>Coletar 100 µ l de cada cultura pré-enriquecimento e misturar amostras de 8-10 de 1 amostra em um tubo de 1,5 mL, se houver mais de 10 amostras.</li>
		<li>Marca corretamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extração de DNA<ol>
<li>Centrifugar a cultura pré-enriquecimento a 800 x g por 2 min permitir que partículas grandes de assentar, e transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar a 12.000 x g por 5 min. descartar o sobrenadante por aspiração.</li>
		<li>Adicionar 100 µ l de solução de extração de DNA (0,01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0,01% Nonidet P 40 (NP40)) para a pelota. Vórtice vigorosamente durante 1 minuto.</li>
		<li>Ferva a 100 ° C por 5 min em um banho seco.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g por 5 min. recolher o sobrenadante usando um tubo novo, que será o modelo para a análise PCR em tempo real sucedendo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR em tempo real<ol>
<li>Configurar a mistura de reação como segue: para cada amostra, adicione 12,5 µ l de 2 x mistura reacional, 0,4 µM de cada primer, 0,2 µM de cada sonda (sequências na tabela 1)27, 5 µ l do modelo como preparado na etapa 2.4.4 e usar o ddH2O para adicionar até 25 µ l total volume.</li>
		<li>Configurar o programa ciclismo como segue: 95 ° C por 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C para 34 s. coletamos fluorescente os sinais de canais de Hexachlorofluorescein (HEX) na etapa de alongamento (72 ° C) e 6-carboxy-fluoresceína (FAM) automaticamente pela máquina fluorescente de PCR em tempo real.</li>
		<li>Realize o PCR em tempo real em uma máquina fluorescente de PCR em tempo real, de acordo com as instruções do instrumento.</li>
		<li>Vá para o passo 4 diretamente e emitir relatórios negativos se ocorrer resultados negativos nos canais de FAM/HEX, o que significa que as amostras são negativas para Salmonella spp. /Shigella spp.</li>
		<li>Vá para o passo 3.1 ou 3.2 se positivos resultados ocorrem nos canais de HEX e/ou FAM, que significa que a amostra pode ser positiva para Salmonella spp. e/ou Shigella spp., respectivamente. Nota: Se a mistura da amostra foi realizado na etapa 2.3, então PCR em tempo real em amostras individuais que compo o positivo que deve ser realizado para filtrar a amostra real positiva.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. guiada cultura
<ol><li>
Salmonella spp. PCR positiva amostra<ol>
<li>Cultura seletiva em meio<ol>
<li>Adicione 100 µ l de cultura pré-enriquecimento em 5 mL de meio de Selenito cistina em um tubo de ensaio. Incube a 36 ° C por 18-24 h em uma incubadora.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Separando a cultura em placa<ol>
<li>Coletar um loop da cultura com um micro-loop e espalhar-se para um prato XLD ou placa de ágar cromogênico de Salmonella . Incube a 36 ° C por 18-24 h em uma incubadora.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identificação bioquímica<ol>
<li>Selecione colônia suspeita no XLD placa (Colônia rosa com/sem coração escuro, escura colônia; colônia amarela com/sem coração escuro) ou placa de ágar cromogênico de Salmonella (roxo ou prunosus colônia, redondo e liso) (Figura 2).</li>
			<li>Colônia suspeita de assunto para identificação bioquímica no sistema automatizado de identificação microbiana, de acordo com as instruções do instrumento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Caracterização sorológica<ol>
<li>O caracterização de antígeno<ol>
<li>Adicione uma gota do sera polivalente antígeno O numa lâmina limpa.</li>
				<li>Colete um loop da colônia com uma micro-loop e moagem no sera.</li>
				<li>Vá para a etapa 3.1.4.1.4 se parece fluir a areia, o que significa que a colônia é reativa para os soros (Figura 3). Caso contrário, vá para a etapa 3.1.4.1.5.</li>
				<li>Use soros monovalentes de O antígeno para repetir passos 3.1.4.1.1 para 3.1.4.1.3 até o antígeno O específico é caracterizado.</li>
				<li>Use soros Vi para repetir passos 3.1.4.1.1 para 3.1.4.1.3. Recolher aquelas colônias de reativo de soros Vi em um tubo e ferve a 100 ° C por 5 min em um banho seco. Centrifugar a 12.000 x g por 5 min. coletar o sedimento e repita os passos de 3.1.4.1.1 para 3.1.4.1.4 até antígeno específico O é caracterizado.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Caracterização de antígeno H<ol>
<li>Adicione uma gota de soros polivalentes de antígeno H numa lâmina limpa.</li>
				<li>Colete um loop da colônia com uma micro-loop e moagem no sera.</li>
				<li>Vá para a etapa 3.1.4.2.4 se parece fluir a areia, o que significa que a colônia é reativa para o sera.</li>
				<li>Use soros monovalentes de H antígeno para repetir passos 3.1.4.2.1 para 3.1.4.2.3 até o antígeno H específico é caracterizado. Nota: Às vezes indução de soro pode ser necessária para caracterizar o antígeno de fase H a segunda. Se assim for, as seguintes etapas opcionais devem ser executadas.</li>
				<li>(Opcional) Adicione uma gota de soros específicos do antígeno H em placa de ágar nutriente. Espere até que todos os soros são absorvidos.</li>
				<li>(Opcional) Colete um loop da colônia com uma microlaço e espalhar sobre o prato onde soros específicos do antígeno H são absorvidos. Incube a 36 ° C por 18-24 h em uma incubadora.</li>
				<li>(Opcional) Use soros monovalentes de H antígeno para repetir passos 3.1.4.2.1 para 3.1.4.2.3 até a segunda fase do antígeno H é caracterizada.</li>
				<li>Vá para a etapa 4.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Shigella spp. PCR positiva amostra<ol>
<li>Separando a cultura em placa<ol>
<li>Coletar um loop da cultura pré-enriquecimento com um micro-loop e espalhe sobre um XLD placa ou placa de MAC. Incube a 36 ° C por 18-24 h em uma incubadora.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identificação bioquímica<ol>
<li>Coletar a colônia suspeita no XLD placa (liso, redondo, transparente e vermelho colônia) ou placa de MAC (Lisa, redondo, transparente e incolor colônia com 2-3 mm de diâmetro; Shigella sonnei pode ser maior e rosados à luz como o alongamento do tempo de incubação) (Figura 4).</li>
			<li>Colônia suspeita de assunto para identificação bioquímica no sistema automatizado de identificação microbiana, de acordo com as instruções do instrumento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Caracterização sorológica<ol>
<li>Adicione uma gota de soros polivalentes de Shigella spp. numa lâmina limpa.</li>
			<li>Colete um loop da colônia com uma micro-loop e moagem no sera.</li>
			<li>Vá para o passo 3.2.3.4 se parece fluir a areia, o que significa que a colônia é reativa para o sera.</li>
			<li>Use soro monovalente de Shigella spp. Repita as etapas 3.2.3.1 para 3.2.3.3 até específicas spp. Shigella é caracterizada.</li>
			<li>Vá para a etapa 4.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. o relatório
<ol><li>Emitir relatórios de positivos ou negativos de acordo com os resultados acima.</li>
</ol>

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<li>Wang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+shigellosis+by+real-time+PCR+suggests+underestimation+of+shigellosis+prevalence+by+culture-based+methods+in+a+population+of+rural+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China.</a> Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).</li>
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<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viable+but+nonculturable+state+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The viable but nonculturable state in bacteria.</a> The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).</li>
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<li>Dekker, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drinking+water+from+dug+wells+in+rural+ghana--salmonella+contamination%2C+environmental+factors%2C+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).</li>
<li>Gargano, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+from+selected+diseases+that+can+be+transmitted+by+water+-+United+States%2C+2003-2009%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009.</a> Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).</li>
<li>Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+culture%2C+ELISA+and+PCR+assays+for+the+detection+of+Salmonella+in+seafood%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood.</a> Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).</li>
<li>Herrera-Leon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blind+comparison+of+traditional+serotyping+with+three+multiplex+PCRs+for+the+identification+of+Salmonella+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes.</a> Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).</li>
<li>Cunningham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-hour+molecular+detection+of+Campylobacter%2C+Salmonella%2C+Yersinia%2C+and+Shigella+species+in+feces+with+accuracy+as+high+as+that+of+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).</li>
<li>Eriksson, E., Aspan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+culture%2C+ELISA+and+PCR+techniques+for+salmonella+detection+in+faecal+samples+for+cattle%2C+pig+and+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry.</a> BMC Veterinary Research. 3, 21(2007).</li>
<li>Dutta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+performance+characteristics+of+a+direct+PCR+with+stool+samples+in+comparison+to+conventional+techniques+for+diagnosis+of+Shigella+and+enteroinvasive+Escherichia+coli+infection+in+children+with+acute+diarrhoea+in+Calcutta%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Desde Salmonella spp. /Shigella spp. são frequentemente associados com intoxicação alimentar e transmissão fecal-oral de gastroenterite aguda28,29 , e o método de rotina é trabalhoso ou demorado 7, nós descrevemos uma plataforma de alta produtividade para a Salmonella spp. / rastreio deShigella spp., usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.
Há várias etapas que ...

Diarreia é ainda um problema de saúde comum com uma incidência elevada taxa globalmente1,2. Embora a mortalidade é relativamente baixa, alguns pacientes apresentam sintomas de várias semanas (por exemplo, solta e aguadas fezes, urgência para ir ao banheiro), que tornam o impacto sócio-econômico muito alta3,4. Mais a sério, alguns pacientes podem desenvolver até mesmo síndrome do intestino irritável se deixados sem tratamento5. Existem vários tipos de bactérias, vírus e parasitas que podem causar diarreia6. Salmonella spp. /Shigella spp. estão entre as bactérias mais comuns para a transmissão de gastroenterite aguda7,8,9,10,11. Portanto, muitos condados emitiram leis ou regulamentos para regular Salmonella spp / triagem deShigella spp. entre as pessoas que iria lidar com comida e água. Por exemplo, o governo chinês emitiu leis para obrigatório Salmonella spp / triagem deShigella spp. uma vez por ano.
O método padrão-ouro para Salmonella spp. / deteção deShigella spp. é a cultura de bactérias. Através de cultura de bactérias e sucessiva identificação bioquímica e sorológica caracterização, podemos identificar as espécies de bactérias, que podem facilitar a gestão do surto de doença e antimicrobiana de perfil para auxiliar o tratamento de pacientes 12. pode também ajudar localizar a fonte de infecção durante a Salmonella spp. /Shigella spp. surto13. No entanto, este método é trabalhosa (que exigem operação manual) e demorado (leva vários dias), especialmente para os testes de um grande número de amostras7. Além disso, viável mas não-viáveis (VBNC) Salmonella spp /pode existir em algumas amostras de fezesdeShigella spp.14. Tendo em conta essas desvantagens, muitos laboratórios tentaram desenvolver novas técnicas para a detecção de Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. todos esses métodos usam o teste de amplificação de ácido nuclear (NAAT), entre os quais a reação em cadeia do polymerase (PCR) é o mais comum. Uma grande limitação destes métodos NAAT baseado é que bactérias mortas, detritos mesmo bacteriana contendo incompleta DNA genômico, poderiam mostrar resultados positivos,26, que em grande parte poderia influenciar o diagnóstico preciso da doença. Blanco et al mostrou que aquele ensaio molecular é altamente sensível, não só viável salmonelas nas culturas, mas também para genomas parciais e bactérias mortas ou inviáveis de infecções passadas ou contaminação26. Portanto, a nova tecnologia deve ser desenvolvida.
Aqui, descrevemos um método inovador que combina o NAAT baseado método e cultivo. Como mostrado na Figura 1, este novo método se aplica a PCR em tempo real, triagem primeiro e em seguida as amostras positivas são enviadas para a identificação e a cultura de bactérias.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sigma</td><td>11332473001</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Takara</td><td>9012</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS (Premix)</td><td>Takara</td><td>R040Q</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Nutrientes</td><td>LandBridge</td><td>CM106</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Nutriente</td><td>LandBridge</td><td>CM107</td><td></td></tr><tr><td>Selenita Cistina média</td><td>LandBridge</td><td>CM225</td><td></td></tr><tr><td>XLD</td><td>LandBridge</td><td>CM219</td><td></td></tr><tr><td>MAC&nbsp;</td><td>LandBridge</td><td>CM908</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella ágar cromogênico</td><td>CHROMagar</td><td>SA130</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella soro de diagnóstico</td><td>Tianrun</td><td>SAL60</td><td></td></tr><tr><td>Shigella</td><td>Tianrun</td><td>SHI54</td><td></td></tr><tr><td>swab anal (tubo coletor mais)</td><td>Huachenyang</td><td></td><td></td></tr><tr><td>slide</td><td>Mingsheng</td><td>7102</td><td></td></tr><tr><td>micro-loop</td><td>Weierkang</td><td>W511</td><td></td></tr><tr><td>incubadora</td><td>Jinghong</td><td>DNP-9082</td><td></td></tr><tr><td>autoclave</td><td>AUL</td><td>SS-325</td><td></td></tr><tr><td>banho seco</td><td>Jinghong</td><td>KB-20</td><td></td></tr><tr><td>sistema automatizado de identificação microbiana</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>VITEK2</td><td>outro sistema equivalente pode ser usado</td></tr> máquina <tr><td>de PCR fluorescente em tempo real</td><td>ThermoFisher</td><td>ABI7500</td><td>outra máquina equivalente pode ser usada</td></tr></tbody></table>

uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de salmonella spp. /shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Transmissão fecal-oral de gastroenterite aguda ocorre de vez em quando, especialmente quando pessoas que cuidou de comida e água são infectadas por Salmonella spp./Shigella spp. O método padrão-ouro para a detecção de Salmonella spp./Shigella spp. é cultura direta mas é trabalhosa e demorada. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para Salmonella spp./Shigella spp. triagem, usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) combinada com cultura guiada. Há duas fases principais: a cultura guiada e PCR em tempo real. Para a primeira fase (PCR em tempo real), vamos explicar cada passo do método: coleção, pré-enriquecimento, extração de DNA e PCR em tempo real da amostra. Se o resultado PCR em tempo real é positivo e, em seguida, é realizada a segunda fase (cultura guiada): seletiva cultura, identificação bioquímica e sorológica caracterização. Ilustraremos também resultados representativos gerados a partir dele. O protocolo descrito aqui seria uma plataforma valiosa para a seleção rápida, específica, sensível e elevado-throughput de Salmonella spp. /Shigella spp.

O protocolo foi aplicado para o rastreio de Salmonella spp. / amostras deShigella spp. em fezes anal de pessoas que iria lidar com comida e água.
Na etapa PCR em tempo real, como mostrado na Figura 5A, houve uma amplificação bem-sucedida no canal de HEX, o que significava que a amostra mista era positiva para Salmonella spp. Em seguida, um mais PCR em temp...

Salmonella spp. /Shigella spp. são patógenos comuns atribuídos a diarreia. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp. usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Este método fornece uma plataforma de alto rendimento para a triagem de Salmonella e Shigella. A principal vantagem dessa técnica é a repetição, específica, sensível e de alta produtividade. Esta técnica combina o método rápido NAAT e a cultura em que a triagem pcr em tempo real foi aplicada primeiro, e depois as positivas foram enviadas para cultura e identificação de bactérias.Embora este método se concentre na triagem de Salmonella e Shigella, ele também pode ser aplicado a outros patógenos como Vibrios, Staphylococcus, E.Coli e et cetera. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a seleção da colônia correta é difícil devido à flora de fundo em amostras. Para começar, adicione três mililitros de caldo de nutrientes a cada amostra.Em seguida, incubar as amostras a 36 graus Celsius por seis horas. Depois disso, centrifugar a cultura pré-enriquecimento a 800 gs por dois minutos. Em seguida, transfira o supernasal para um novo tubo, e centrífuga-lo novamente por cinco minutos a 12.000 gs.Depois de descartar o supernascer, adicione 100 microliters de solução de extração de DNA à pelota. Então, vórtice do tubo por um minuto. Em seguida, aqueça a amostra a 1.000 graus Cel

a-high-throughput-platform-for-screening-salmonella-sppshigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um procedimento para líquidos baseados em cultura e distribuição...

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

Nós descrevemos um baixo custo, o método de alto rendimento para a tela para a atividade endoglucanase fúngicas...

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Fonte: Yang, Z., et al. Uma Plataforma de Alta Capacidade para a Triagem de Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o enriquecimento seletivo e a identificação de Salmonella usando xilose, lisina desoxicolato (XLD) e ágar cromogênico. O caldo de selenito promove o crescimento de Salmonella , enquanto o ágar XLD revela colônias de centro negro por meio da produção de sulfeto de hidrogênio. O ágar cromogênico confirma a identidade por meio da formação de pigmentos...

Enriquecimento seletivo e identificação de espécies de Salmonella usando xilose, lisina desoxicolato e ágar cromogênico

Um ensaio de elevado débito para a Salmonella in vitro o fenótipo ou outra associação bacteriana, invasão e replicação em células fagocíticas, com capacidade de alto rendimento foi desenvolvido. O método foi empregado para avaliar knockout gene Salmonella cepas mutantes de seus envolvimentos na interação patógeno-hospedeiro.

De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo Salmonella enterica Typhimurium Association, invasão e replicação em macrófagos

O objetivo geral do presente protocolo é para sintetizar nanosensors funcional para o portátil, econômica, e rápida detecção de direcionado especificamente bactérias patogênicas através de uma combinação de relaxação magnética e as modalidades de emissão de fluorescência.

Patógeno de origem alimentar rastreio usando Nanosensor Magneto-fluorescente: Rápida detecção de Escherichia Coli O157: H7

Aqui descrevemos um protocolo que é um anfitrião inteiro, adaptável, ferramenta de triagem de alto teor que pode ser utilizada para estudar interações patógeno-hospedeiro e ser usado para a descoberta de medicamentos.

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

Aqui nós apresentamos um protocolo para medir a atividade Shigellacidal de anticorpos no soro. Soro é misturado com bactérias e complemento exógeno, incubado, e a mistura de reação é revestida em placas de ágar. Bactérias viáveis formam colônias que são contadas, usando um enumerador de colônia automatizado e usado para determinar a concentração bactericida.

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um teste isotémico de amplificação de ácido nucleico (iNAAT) que tem atraído amplo interesse no campo de detecção de patógenos. Aqui, apresentamos um protocolo salmonella LAMP validado em vários laboratórios como um método rápido, confiável e robusto para a triagem de Salmonella em alimentos animais e confirmando salmonela presuntiva do isolamento cultural.

Amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural

Os micróbios intestinais podem impactar positiva ou negativamente a saúde de seu hospedeiro por meio de mecanismos específicos ou conservados. Caenorhabditis elegans é uma plataforma conveniente para rastrear esses micróbios. O presente protocolo descreve a triagem de alto rendimento de 48 isolados bacterianos quanto ao impacto na resistência ao estresse dos nematoides, usados como um proxy para a saúde dos vermes.

Triagem de alto rendimento de isolados microbianos com impacto na saúde de Caenorhabditis elegans

Aqui apresentamos o princípio, a estrutura e a instrução do sistema inteligente de teste de sensibilidade antimicrobiana de alto rendimento/triagem de fagos. Sua aplicação é ilustrada usando Salmonella isolada de aves em Shandong, China, como exemplo. O índice Lar é calculado, e sua importância na avaliação da resistência antimicrobiana é discutida de forma abrangente.

Aplicação do Sistema Inteligente de Teste de Sensibilidade Antimicrobiana de Alto Rendimento/Phage Screening System e Índice Lar de Resistência Antimicrobiana

Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.

Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas

Aprenda uma plataforma de alto rendimento para rastreamento de Salmonella spp. e Shigella spp. usando PCR em tempo real combinado com cultura guiada. Este método oferece alta especificidade e sensibilidade na detecção de patógenos.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

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