Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.
7 de novembro de 2018
Salmonella spp. /Shigella spp. são patógenos comuns atribuídos a diarreia. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp. usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.
Este método fornece uma plataforma de alto rendimento para a triagem de Salmonella e Shigella. A principal vantagem dessa técnica é a repetição, específica, sensível e de alta produtividade. Esta técnica combina o método rápido NAAT e a cultura em que a triagem pcr em tempo real foi aplicada primeiro, e depois as positivas foram enviadas para cultura e identificação de bactérias.
Embora este método se concentre na triagem de Salmonella e Shigella, ele também pode ser aplicado a outros patógenos como Vibrios, Staphylococcus, E.Coli e et cetera. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a seleção da colônia correta é difícil devido à flora de fundo em amostras. Para começar, adicione três mililitros de caldo de nutrientes a cada amostra.
Em seguida, incubar as amostras a 36 graus Celsius por seis horas. Depois disso, centrifugar a cultura pré-enriquecimento a 800 gs por dois minutos. Em seguida, transfira o supernasal para um novo tubo, e centrífuga-lo novamente por cinco minutos a 12.000 gs.
Depois de descartar o supernascer, adicione 100 microliters de solução de extração de DNA à pelota. Então, vórtice do tubo por um minuto. Em seguida, aqueça a amostra a 1.000 graus Celsius no banho seco.
Depois de repetir a centrifugação, colete o sobrenatante em um novo tubo. Primeiro, crie a mistura de reação e defina o programa de ciclismo de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, execute PCR em tempo real em uma máquina PCR fluorescente em tempo real.
Primeiro, adicione 100 microliters da cultura pré-enriquecimento a cinco mililitros de meio de cristal selenita. Em seguida, incubar a cultura a 36 graus Celsius por 18 a 24 horas. Em seguida, colete um laço da cultura e espalhe-o em um prato.
Em seguida, incubar a placa a 36 graus Celsius por 18 a 24 horas. Após a incubação, selecione colônias suspeitas e transfira-as para uma placa. Incubar a placa a 36 graus Celsius por 18 a 24 horas.
Em seguida, identifique a colônia suspeita usando um sistema automatizado de identificação microbiana. Para iniciar a caracterização do O-antígeno, adicione uma gota do sera polivalente de o-antígeno a um slide limpo. Transfira um laço da colônia para o escorregador e moê-lo na sera.
Se as bactérias se parecerem com areia fluindo, repita o tratamento anterior com soro monovalente de O-antígeno até que o antígeno seja caracterizado. Para iniciar a caracterização h-antígeno, adicione uma gota de sera polivalente de h-antígeno a um slide limpo. Então, colecione um loopful da colônia e grid-lo na sera.
Use soro monovalente H-antígeno para repetir o tratamento até que o antígeno H específico seja caracterizado. Para separar a cultura, recolham um laço da cultura pré-enriquecimento e espalhem-na em um prato. Em seguida, incubar o lugar a 36 graus Celsius por 18 a 24 horas.
Após a incubação, colete uma colônia suspeita em um prato. Incubar a placa a 36 graus Celsius por 17 a 24 horas. Em seguida, sujeitar a colônia à identificação bioquímica por meio de um sistema automatizado de identificação microbiana.
Em seguida, aplique uma gota de sera polivalente da espécie Shigella em um slide limpo. Em seguida, use um micro-loop para coletar algumas das bactérias e moê-la na soro. Finalmente, se o sera se assemelha à areia fluindo, use a espécie shigella monovalente sera para caracterizar ainda mais as bactérias.
Usando este protocolo, amostras de fezes de pacientes foram rastreadas para as espécies Salmonella e Shigella. Utilizando PCR em tempo real, houve amplificação bem sucedida no canal HEX, indicando que a amostra foi positiva para as espécies de Salmonella. Outros PCR em tempo real indicaram que a amostra dois foi positiva para Salmonella e foi escolhida para a cultura guiada das espécies de Salmonella.
Na cultura guiada das espécies Salmonella, as colônias rosa e roxa foram banhadas separadamente e submetidas à identificação bioquímica. Os resultados indicaram que as colônias da amostra dois eram Salmonella paratyphi B.Utilizando PCR em tempo real, houve amplificação bem sucedida no canal FAM, indicando que a amostra foi positiva para as espécies de Shigella. Outros PCR em tempo real indicaram que a amostra 10 foi positiva para Shigella e foi escolhida para cultura guiada.
Na cultura guiada das espécies shigella, as colônias rosa-vermelha e incolor foram banhadas separadamente e submetidas à identificação bioquímica. Os resultados indicaram que a amostra 10 continha bactérias Shigella sonnei fase II. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar a limitação do método devido à variação da sequência.
Após esse procedimento, outros métodos, como a cultura direta, podem ser realizados para evitar resultados falsos negativos negativos de PCR em tempo real. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da detecção de Salmonella e Shigella, já que o novo protocolo poderia aumentar a taxa positiva em duas vezes e diminuir significativamente a carga de trabalho e a TAT. Não se esqueça que trabalhar com Salmonella e Shigella pode ser extremamente perigoso, e os equipamentos de proteção individual, EPI, devem ser sempre tomados durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma plataforma de alto rendimento para triagem de Salmonella spp. e Shigella spp. utilizando PCR em tempo real combinada com cultura direcionada. O método enfatiza especificidade, sensibilidade e eficiência na detecção de patógenos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Detecção de Patógenos
- Triagem de Alta Produtividade
Antecedentes
- Salmonella e Shigella são causas significativas de diarreia.
- Métodos precisos e rápidos de detecção são cruciais para a saúde pública.
- Os métodos tradicionais podem ser lentos e menos específicos.
- Este estudo apresenta uma abordagem inovadora que combina técnicas de NAAT e cultivo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de triagem de alto rendimento para Salmonella e Shigella.
- Aprimorar a especificidade e a sensibilidade da detecção de patógenos.
- Fornecer uma demonstração visual do método para melhor seleção de colônias.
Métodos Utilizados
- Triagem por PCR em tempo real aplicada às amostras.
- Amostras positivas enviadas para cultura bacteriana e identificação.
- Uso de caldo nutriente para preparar as amostras.
- Avaliação visual para selecionar as colônias corretas entre a flora de fundo.
Resultados Principais
- O método demonstrou alta especificidade e sensibilidade.
- Pode ser adaptado para outros patógenos, como Vibrios e E. coli.
- A orientação visual melhorou a precisão na seleção de colônias.
- A capacidade de alto rendimento foi confirmada.
Conclusões
- O método desenvolvido é eficaz para triagem de Salmonella e Shigella.
- Oferece uma alternativa confiável aos métodos tradicionais de detecção.
- Aplicações futuras podem estender-se a outras bactérias patogênicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção rápida e específica de patógenos entéricos como Salmonella e Shigella é fundamental para a vigilância em saúde pública e a resposta a surtos. Esta plataforma de alto rendimento combina triagem por PCR em tempo real com cultura orientada para aumentar a sensibilidade e reduzir o tempo até o resultado, em comparação com os métodos tradicionais de cultura. A abordagem favorece a validação precoce de alvos na pesquisa de doenças infecciosas, permitindo a identificação confiável de patógenos a partir de amostras clínicas complexas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao confirmar a presença do patógeno em modelos pré-clínicos de infecção.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da identificação específica de sorotipos de Salmonella e Shigella.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na redução de riscos dos alvos ao diminuir falsos negativos nos fluxos de trabalho de detecção de patógenos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem downstream de eficácia antimicrobiana ou vacinal.
- Valor Operacional: Padroniza o processamento de amostras com pré-enriquecimento, extração de DNA e PCR em tempo real para resultados reprodutíveis.
- Escalabilidade: Permite a triagem de alto rendimento de amostras clínicas ou ambientais com redução do tempo de manipulação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao fornecer amostras com confirmação do patógeno para estudos de eficácia.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a detecção de marcadores de virulência por meio da caracterização bioquímica e sorológica após o cultivo.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção ao confirmar a presença do patógeno antes de investir em candidatos terapêuticos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial da descoberta, apoiando a verificação de hipóteses em modelos de infecção e permitindo a detecção confiável de patógenos antes dos esforços de identificação de compostos promissores.
- Biologia da Descoberta: Facilita a elucidação de vias ao confirmar Salmonella ou Shigella como agentes causais em modelos de doenças.
- Triagem: Fornece amostras prontas para ensaio com carga quantificada do patógeno por meio dos valores de Ct da PCR em tempo real para análise comparativa.
- Análises: Gera medidas quantitativas de variáveis dependentes (valores de Ct, contagens de colônias) que permitem comparação entre condições e seleção de alvos.
- Pesquisa Translacional: Assegura o uso de sistemas relevantes para a doença ao validar a presença do patógeno em modelos antes dos testes terapêuticos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de triagem reutilizável aplicável a múltiplos patógenos além de Salmonella e Shigella.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao confirmar a identidade do patógeno por meio de PCR ortogonal e confirmação por cultura.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de pré-enriquecimento, centrifugação e extração de DNA.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência do capital ao reduzir a carga de trabalho e o tempo de resposta, permitindo maior capacidade de processamento de amostras.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados confiáveis de detecção de patógenos para decisões de prosseguir ou interromper.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microbiologia molecular e no design de ensaios de PCR em tempo real.
- Depende do acesso a equipamentos de PCR em tempo real com detecção fluorescente e sistemas automatizados de identificação microbiana.
- Necessita padronização entre equipes nos critérios de manipulação de amostras e seleção de colônias.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a outros patógenos, devido a variações nos meios de enriquecimento e reagentes sorológicos.
- Inclui limitações práticas, como a variação de sequência que afeta a ligação dos iniciadores e a necessidade de EPI ao manipular patógenos do Nível de Biossegurança 2.
