Name: Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a isolar neutrófilos de baixa densidade de fluido de lavagem peritoneal para estudar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e sua interação com células tumorais. Este método permite visualizar a adesão de células tumorais às NETs intactas.

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Agradecemos a Sra. J. Shinohara e I. Nieda para trabalhos técnicos e administrativos. Também, agradecemos os Drs Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina e Kazuya Takahashi sua cooperação para aquisição de amostra na sala de cirurgia. Este trabalho foi financiado por um subsídio para a investigação científica do Ministério da educação, ciência, esportes e cultura do Japão e o Japão sociedade para a promoção da ciência (17K 10606).

LDN foram obtidos de pacientes matriculados neste estudo e foram aprovados pela institucional Review Board de Jichi médica Universidade.
1. isolamento de LDN de Lavages de cavidade Abdominal e deteção líquida
<ol><li>Aquisição de amostra<ol>
<li>Infundi 1.000 mL de solução salina estéril diretamente na cavidade abdominal antes do fechamento da ferida em pacientes que se submeteram à cirurgia abdominal devido a malignidade gastrointestinal. Nota: As amostras foram obtidas de pacientes que se submeteram a uma gastrectomia, colectomia ou Esofagectomia sem preconceito com base na idade ou sexo. Solução salina foi transferida para um recipiente e vertida em todo abdome dentro de um minuto. Esta é realizada de rotina como uma lavagem peritoneal pós-operatória sem efeitos significativos sobre os pacientes.</li>
		<li>Lavagem da cavidade abdominal extensivamente pelo menos 1 min. Nota: É recomendável que o fluido infundido lentamente agita-se com as mãos do cirurgião para que as amostras são uniformes.</li>
		<li>Recupere 200 mL de líquido de lavagem com 4 seringas de 50 mL. Nota: Às vezes, um conector de borracha é usado para pegar os fluidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize a purificação da LDN peritoneal usando mAb específico de granulócitos, CD66b16. Nota: Porque a camada intermediária após centrifugação gradiente de densidade contém muitas células mononucleares, selecção positiva de neutrófilos polimorfo usando CD66b mAb foi executada.<ol>
<li>Transferi o líquido de lavagem peritoneal para um tubo de 50 mL. Nota: Nesta etapa, passe os fluidos através de um filtro de nylon 100 µm para remover as impurezas.</li>
		<li>Centrifugue o fluido peritoneal a 270 x g, durante 7 min na RT</li>
		<li>Resuspenda as pelotas em 5 mL de PBS com EDTA 0,02%.</li>
		<li>Sobreposição com cuidado a 5 mL de suspensão de células em uma solução de gradiente de densidade de 3 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 1.700 x g, durante 15 min em RT sem intervalos.</li>
		<li>Colher o ~ 2-3 mL de solução contendo as camadas intermediárias (figura 1A), usando uma pipeta e misturar com 10 mL de PBS com EDTA 0,02%.</li>
		<li>Centrifugue o fluido peritoneal em 400 x g, durante 7 min na RT e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione outro 10 mL de PBS com EDTA 0,02% e centrifugar a 270 x g, durante 7 min na RT. descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Dissolva o centrifugado (1 x 107) em 60 µ l de tampão para o kit de separação magnética celular.</li>
		<li>Adicionar 20 µ l do bloco Fc nas pelotas e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Adicionar 20 µ l do anti-CD66b conjugados com microbeads e incube por um adicional 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Lave e ressuspender as pelotas em 500 µ l de tampão de MACS.</li>
		<li>Aplicar a suspensão de células de uma coluna magnética no campo magnético de um separador magnético adequado e recolher as células de passagem contendo CD66b(-) pela coluna com 15 mL de tampão de lavagem.</li>
		<li>Remover a coluna a partir do separador magnético e expulsar imediatamente as pilhas de CD66b(+) magneticamente etiquetadas empurrando firmemente o êmbolo na coluna. Nota: A população de células de CD66b(+) consiste principalmente de neutrófilos, conforme determinado pela análise de FACS indicando que > 95% da fração CD66(+) são positivas para CD15, CD11b e CD16, mas negativas para CD14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geração de redes<ol>
<li>Após a centrifugação a 270 x g, durante 7 min na RT, re-suspender a LDN isolado (5 x 106) em 1 mL de RPMI1640 com FCS de 10%.</li>
		<li>Cultura da LDN em uma placa revestida 6-poços poli-L-lisina (6 cm de diâmetro) por 2 h em 37 ˚ c em 5% CO2.</li>
		<li>Adicione o corante verde de contraste fluorescente (um corante membrana impermeável para manchar o núcleo e cromossomos) na concentração final de 5 µM.</li>
		<li>Imediatamente observe a morfologia das redes (os componentes DNA extracelulares expelidos da LDN sob microscopia de fluorescência).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. coloração de células tumorais com tintura de vinculador de célula fluorescente vermelha
<ol><li>Prepare o câncer humano linhas celulares, MKN45, NUGC e OCUM-1.</li>
	<li>Lavam-se 1 x 107 células com PBS + EDTA 0,02% em um tubo de 15 mL e centrifugar 270 x g por 7 min em RT</li>
	<li>Adicionar 1 mL de solução para tintura coloração nas pelotas e pipetar suavemente.</li>
	<li>Dissolver 4 µ l de corante vermelho fluorescente célula vinculador em 1 mL de solução para coloração e misture com a suspensão de células da etapa 2.2.</li>
	<li>Incubar as pelotas por 4 min na RT</li>
	<li>Adicionar 4 mL de DMEM (10% FBS) para parar a reação de coloração.</li>
	<li>Centrifugue a 270 x g, durante 7 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita os passos de 2.6 e 2.7 duas vezes.</li>
	<li>Verifique com um microscópio de fluorescência (excitação = 551 nm, emitindo = 567 nm) que as células do tumor estão manchadas de vermelho.</li>
</ol>3. análise da aderência de célula de Tumor nas redes
<ol><li>Ressuspender as células de tumor manchada fluorescente vermelha (1 x 106) em 1 mL de RPMI 1640 suplementado com 0,1% de BSA.</li>
	<li>Adicione as células do tumor para a cultura LDN que produziu as redes conforme descrito na etapa 1.3.</li>
	<li>Incube durante 5 min à 37 ˚ c, o que permite que as células do tumor entrar em contato com as redes. Nota: Incubação longa induz aderência de célula do tumor para LDN ou para as placas.</li>
	<li>Remover o meio e delicadamente lavar os poços, adicionando 2 mL de mídia escaldadas (0,1% BSA + RPMI 1640) e girando o prato.</li>
	<li>Repita o procedimento de lavagem no passo 3.4 duas vezes. Nota: Desde redes fracamente anexar a placa, a lavagem deve ser feita o mais suavemente possível para evitar a remoção das redes se.</li>
	<li>Adicione o corante verde fluorescente para manchar o núcleo e cromossomos em uma concentração final de 5 µ g/mL para visualização das redes.</li>
	<li>Observar as redes e anexado células tumorais usando os filtros apropriados (verde, excitação = 504 nm, emitindo = 523 nm; vermelho, excitação = 551 nm, emitindo = 567 nm).</li>
	<li>Mescle os números para mostrar as células do tumor que estão preso por redes. Nota: Em alguns experimentos, enzima de degradação do DNA foi adicionada à cultura LDN (concentração final de 100 U/mL) 5 min antes co incubação por 5 min.</li>
</ol>4. análise de vídeo lapso tempo das células do Tumor preso
<ol><li>Cultura da LDN peritoneal em um 35 milímetros rodada prato revestido com poli-L-lisina, conforme descrito na etapa 1.3.</li>
	<li>Adicione o corante verde fluorescente para manchar o núcleo e cromossomos Visualizar redes conforme descrito na etapa 1.3.</li>
	<li>Após 1 minuto de incubação, remova a mídia e adicionar 2 mL de 0.1% BSA + RPMI 1640.</li>
	<li>Remova a mídia e adicionar imaculado 1 x 106 MKN45 células suspensas em 0,1% BSA + RPMI 1640. Incubar durante 5 min à RT.</li>
	<li>Remova quaisquer células de tumor desanexado lavando suavemente conforme descrito no passo 3.4 e adicione DMEM com 10% de FCS suplementado com 100 u/mL penicilina e 100 µ g/mL Estreptomicina.</li>
	<li>Montar o prato de cultura em um sistema de observação do vista para toda a célula e selecione o campo apropriado no qual tumor, as células são presos por redes.</li>
	<li>Continue a cultura co por mais 2 dias e tirar fotos contínuas do campo cada 6 min sob luz normal e fluorescência, que detecta células MKN45 e redes, respectivamente.</li>
	<li>Sobrepor as imagens em cada commit e construir vídeos Time-Lapse utilizando software visualizador de imagens.</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).</li>
<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Estudos anteriores relataram que circulam células tumorais pode ser presa por substratos NET na vivo10,11. Células de câncer de mama metastático foram mostradas para estimular os neutrófilos e induzir a formação de redes, que auxilia no crescimento de células de tumor no órgão alvo17. Além disso, nós encontramos que a curto prazo culturas de LDN de fluido de lavagem pós-operatória produziam enormes redes que poderiam montar uma ar...

Os neutrófilos nucleares polimorfo, na circulação de sangue normalmente são separados de células mononucleares através do método de preparação de gradiente de densidade. No entanto, alguns neutrófilos conhecidos como neutrófilos baixa densidade (LDN), com fenótipos CD11b(+), CD15(+), CD16(+) e CD14(-), são co purificados com células mononucleares. O número relativo de LDN aumenta significativamente em diversas condições patológicas, incluindo doenças auto-imunes,1,2, sepse3e câncer4,5. Estudos anteriores mostraram que LDN são uma classe fenotipicamente e funcionalmente distinta de neutrófilos6. Deve notar-se que LDN na circulação de sangue são mais propensos a produzir neutrófilos armadilhas extracelulares (redes) do que a densidade normal neutrófilos2,7. As redes são estruturas semelhantes a web compostas de ácidos nucleicos, histonas, proteases e proteínas cytosolic e granulares, e eficientemente podem enganar e destruir patógenos8.
Recentemente, as redes foram mostradas para capturar não só os micróbios, mas também plaquetas e circulantes de células de tumor que podem ajudar no trombo formação9 e tumor metástases10,11. No entanto, os mecanismos moleculares por trás as interações adesivas entre redes e plaquetas ou células tumorais são ainda pouco claras. Mais recentemente, um ensaio de adesão em vitro revelou que células de leucemia mieloide (K56212) e células de carcinoma de pulmão (A54913) anexar a redes através de integrinas β1 e β3. Os autores utilizaram NET ações isoladas de neutrófilos e ativado pelo phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) como o substrato de adesão14. Embora este ensaio permite a detecção de interações reais com componentes líquidos na ausência de neutrófilos, é discutível se a "célula livre circulante líquido" isolados por centrifugação de alta velocidade mantém a estrutura molecular idêntica à redes produzidas em vivo. Recentemente, encontramos o líquido de lavagem peritoneal após cirurgia abdominal continha muitos LDN maduro, que gerou enormes redes e anexado às células de tumor causando metástases peritoneais15. Neste estudo, analisámos com sucesso a adesão das células tumorais para redes intactas sem qualquer manipulação física. Aqui, nós mostramos detalhes de uma técnica para detectar interações adesivas entre redes e células tumorais livre.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, SUÉCIA</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>DiretoDe&trade; Microesferas de sangue total CD66b</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Bloco Fc</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Solução de enxágue MACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Solução de estoque MACS BSA</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Colunas LS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Separador Magnético MACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>Solução de 5mM de coloração de ácido nucleico verde SYTOX em DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kit de ligação de células fluorescentes vermelhas para rotulagem geral de membranas celulares</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>Diluente C</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr> RPMI1640 <tr><td>Médio</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS)</td> <td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Solução de 0,5 mol / l-EDTA (pH 8,0)</td> <td>nacalai tesque, Japão</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal, qualificado, regiões aprovadas pelo</td><td>USDA gibco by life technologies, México</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino liofilizado em pó, &ge; 96% (eletroforese em gel de agarose)</td> <td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies Japan</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin Prophylactic</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-USA</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina-Revestida MICROPLACA 6Well</td><td>IWAKI, Japão</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>MICROPLATE 24Well IWAKI revestido com poli-L-lisina</td><td>, Japão</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>estereomicroscópio de fluoresceína</td><td>BX8000, Keyence, Osaka Japão</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de observação de células de visão completa</td><td>Nikon, Kanagawa, Japão</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>MKN45 linha celular de câncer gástrico humano</td><td>Riken, Tukuba Japão</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular de câncer gástrico humano NUGC-4</td><td>Riken, Tukuba Japão</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>OCUM-1 linha de células de câncer gástrico humano</td> Universidade da <td>Cidade de Osaka, Japão</td><td>N / D</td><td>Presente do Dr. M.Yashiro</td></tr></tbody></table>

neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem peritoneal mediato fixação e crescimento de células de tumor

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Ativado os neutrófilos liberação dos neutrófilos extracelular armadilhas (redes), que podem capturar e destruir micróbios. Estudos recentes sugerem que as redes estão envolvidas em vários processos de doença, tais como metástases de tumor, trombose e doenças auto-imunes. Aqui, nós mostramos uma técnica detalhada em vitro para detectar atividade NET durante a captura de células de tumor gratuito, que crescem após a ligação a redes. Primeiramente, coletamos neutrófilos de baixa densidade (LDN) de líquido de lavagem peritoneal no pós-operatório de pacientes que se submeteram a laparotomias. Cultivo a curto prazo da LDN resultou na maciça formação líquida que foi visualizada com verde fluorescente nuclear e corante de contraste do cromossomo. Após a incubação co de linhas de células de câncer gástrico humano MKN45, OCUM-1 e NUGC-4 com as redes, muitas células de tumor foram aprisionadas por redes. Posteriormente, o acessório foi totalmente revogado pela degradação de redes com DNase I. tempo-lapso vídeo revelou que células tumorais capturadas pelas redes não morreu, mas em vez disso, cresceu vigorosamente em uma cultura contínua. Esses métodos podem ser aplicados para a detecção de adesivas interações entre redes e vários tipos de células e materiais.

Na cultura de 2 horas, LDN CD66b(+), derivado de estruturas de sequência mostrou fluido de lavagem peritoneal corados com corante verde-fluorescente para nuclear e cromossomo (figura 1B), enquanto CD66b(-) células mononucleares não fizeram (Figura 1). No entanto, quando as culturas LDN foram pré-tratados com 100 U/mL DNase, a estrutura característica era destruído (Figura 1), indicando que eles eram ...

Aqui, apresentamos um método no qual neutrófilos baixa densidade humanos (LDN), recuperados do líquido de lavagem peritoneal pós-operatórias, produzem maciço dos neutrófilos extracelulares armadilhas (redes) em armadilha eficientemente as células do tumor gratuito que crescem posteriormente.

Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o papel das subpopulações de neutrófilos na imunologia tumoral, especialmente sobre o envolvimento mecânico de armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou NETs, na metástase tumoral. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização das interações adesivas das células tumorais com os TNEs intactos. As implicações dessa técnica se estendem à terapia do câncer.Como TNEs derivados de subconjuntos específicos de neutrofil podem promover metástases tumorais. Demonstrando o procedimento estará Junko Shoniohara do nosso laboratório. Para adquirir os neutrófilos, primeiro infunda um litro de solução salina estéril normal imediatamente antes do fechamento da ferida diretamente na cavidade abdominal de um paciente que acabou de ser submetido a uma cirurgia abdominal devido a malignidade gastrointestinal e lave a cavidade abdominal extensivamente por pelo menos um minuto.Em seguida, agite a solução salina dentro da cavidade e recupere 200 mililitros de líquido lavado com quatro seringas de 50 mililitros. No laboratório, transfira o fluido de lavagem peritoneal através de um filtro de náilon de 100 micrômetros para tubos individuais de 50 mililitros para centrifugação. Ressuspenda os pellets em 5 mililitros de PBS suplementado com 0,02% de EDTA e sobreponha cuidadosamente cada suspensão celular em três mililitros de solução de gradiente de densidade.Após a separação do gradiente de densidade, colha dois a três mililitros da camada intermediária de cada tubo e lave as amostras de fluido peritoneal em 10 mililitros de PBS fresco mais EDTA por tubo. Junte os pellets em 10 mililitros de PBS fresco mais EDTA para uma lavagem adicional e dilua as células para uma vez 10 elevado à sétima célula por 60 microlitros de classificação de células ativadas magnéticas, ou MACS, concentração de tampão. Bloqueie qualquer ligação inespecífica com 20 microlitros de bloco Fc por 10 minutos a quatro graus Celsius, seguido pela adição de 20 microlitros de esferas magnéticas anti-CD66b.Após 10 minutos a quatro graus Celsius, lave e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão MACS e adicione as células a uma coluna magnética de tamanho apropriado dentro do campo magnético de um separador magnético adequado. Quando todas as células CD66b negativas tiverem atravessado a coluna, adicionar 15 ml de tampão MACS novo ao reservatório da coluna e transferir a coluna do separador magnético para um novo tubo cónico. Em seguida, mergulhe imediatamente a coluna para liberar o positivo CD66b marcado magneticamente no tubo.Após a centrifugação, ressuspenda os neutrófilos isolados de baixa densidade em cinco vezes 10 a sextas células por mililitro de meio RPMI1640 suplementado com concentração de FBS e semeie 1 mililitro de neutrófilos por poço na placa revestida de poli-L-lisina de seis poços. Após duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, corar as células em cada poço com um corante nuclear e cromossômico impermeável à membrana fluorescente apropriado, de acordo com as instruções do fabricante, e observar imediatamente a morfologia dos TNEs por microscopia de fluorescência. Para avaliar a adesão das células tumorais aos TNEs, ressuspenda as células tumorais gástricas coradas com o corante fluorescente contrastante em uma vez 10 elevado ao sexto por mililitro de RPMI1640 suplementado com 0,1% de concentração de albumina sérica bovina e adicione um mililitro de células tumorais a cada poço das culturas de neutrófilos de baixa densidade.Após cinco minutos a 37 graus Celsius, remova o sobrenadante de cada poço e lave suavemente as células duas vezes com 2 mililitros de meio RPMI1640 pré-aquecido suplementado com BSA por lavagem. Uma incubação de cinco minutos é longa o suficiente para detectar a ligação específica do NET. Adicione o meio aquecido ao lado de cada poço, gire suavemente a placa e remova o sobrenadante com um aspirador.Os NETs e as células tumorais anexadas podem então ser observados por microscopia de fluorescência. Para uma análise de vídeo de lapso de tempo das células tumorais aprisionadas cultive e core os neutrófilos peritoneais de baixa densidade em uma placa de 35 milímetros, revestida com poli-L-lisina, conforme demonstrado, seguida de uma breve lavagem em dois mililitros de 0,1% BSA mais RPMI1640. Substitua o meio por uma vez 10 elevado a sexto células tumorais gástricas não coradas suspensas em dois mililitros de RPMI suplementados com BSA por uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente.No final da incubação, enxágue as células em dois mililitros de RPMI fresco suplementado com BSA por cinco minutos em temperatura ambiente, seguido de um giro suave para remover quaisquer células tumorais soltas. Em seguida, substitua o sobrenadante por DMEM suplementado com FBS e antibióticos e monte a placa em um sistema de observação de células de visão completa para análise de lapso de tempo do aprisionamento de células tumorais pelos TNEs. Após duas horas de cultura, os neutrófilos de baixa densidade CD66b positivos derivados do fluido de lavagem peritoneal exibem estruturas de cordas por coloração nuclear e cromossômica fluorescente verde, enquanto as células mononucleares CD66b negativas não.Quando as culturas de neutrófilos de baixa densidade são pré-tratadas com 100 unidades por mililitro de DNAse I, no entanto, as estruturas características são destruídas, indicando que as estruturas são compostas de DNA extracelular expelido dos neutrófilos. Quando os neutrófilos de baixa densidade são cultivados em placas plásticas não revestidas, muitos aglomerados de NET podem ser observados flutuando dentro do meio com poucos NETs presos ao fundo do prato. Após cinco minutos de incubação com uma linha de células tumorais gástricas marcadas com fluorescência, muitas células tumorais se ligam aos neutrófilos dentro dos TNEs, um fenômeno que não é observado após o pré-tratamento com DNAse I. Padrões de adesão semelhantes também são observados para outras células tumorais.OKUM-1 e NUGC-4. Curiosamente, enquanto os NETs desaparecem gradualmente dentro de várias horas após a co-cultura prolongada de células tumorais, as células tumorais presas pelos NETs começam a proliferar vigorosamente após a liberação do NET. Durante este procedimento, é importante lembrar que, como os NETs aderem fracamente ao prato, os processos de lavagem e transferência de louça devem ser realizados de maneira especialmente cautelosa.Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores em vários campos da ciência biomédica explorarem a relação causal dos TNEs com várias doenças, como trombose, síndrome da resposta inflamatória sistêmica e doenças autoimunes.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neutrófilos Traps Extracelular (NET) são um mecanismo inato importante imunológico para combater as bactérias patogênicas, fungos e parasitas. Aqui nós descrevemos métodos para isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e para ativá-las para formar redes. Nós apresentamos técnicas de preparação para visualizar NETs em microscopia óptica e eletrônica.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Neste vídeo, descrevemos o procedimento para isolar neutrófilos de baixa densidade, ou LDNs, do fluido de lavagem peritoneal de um paciente humano pós-operatório. Os LDNs assim obtidos podem ser usados em outros experimentos a jusante para entender seu papel no crescimento e progressão do tumor.

Isolamento de neutrófilos de baixa densidade peritoneal: uma técnica para obter neutrófilos de baixa densidade a partir de fluido de lavagem peritoneal usando classificação de células ativadas por magnetismo

Este vídeo demonstra a coloração fluorescente de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), os componentes do DNA extracelular expelidos pelos neutrófilos. Esta técnica permite a visualização da interação adesiva entre células cancerígenas e TNEs.

Microscopia de fluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs: uma técnica para observar a interação adesiva entre células cancerígenas e NETs

Neste vídeo, analisamos o comportamento pós-adesão de células cancerígenas presas em armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) por meio da co-cultura de neutrófilos de baixa densidade e células cancerígenas gástricas. A análise de vídeo com lapso de tempo ajuda a monitorar vários eventos celulares e estudar o papel dos TNEs em condições patológicas.

Microscopia de fluorescência de lapso de tempo de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs: uma técnica para analisar a interação pós-adesão entre células cancerígenas e TNEs

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para gerar e isolar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Os neutrófilos são isolados do sangue periférico e estimulados com acetato de miristato de forbol (PMA) para produzir TNEs. Durante a incubação, os neutrófilos passam por um processo de morte celular (NETosis) para liberar NETs compreendendo cromatina descondensada misturada com proteínas citoplasmáticas granulares.

Uma técnica in vitro para gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos

Neste vídeo, demonstramos um ensaio utilizando microscopia de fluorescência para detectar a adesão de células cancerígenas a armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Nos poços de teste, há um aumento notável no número de células cancerígenas marcadas com fluorescência que aderem aos TNEs, enquanto os poços tratados com DNase exibem adesão reduzida de células cancerígenas aos TNEs.

Ensaio de adesão in vitro para detectar a adesão de células cancerígenas a armadilhas extracelulares de neutrófilos

Os neutrófilos desempenham um papel importante não apenas na defesa do hospedeiro contra microrganismos invasores, mas também estão envolvidos na vigilância imunológica das células tumorais. Aqui, descrevemos técnicas relacionadas ao isolamento de neutrófilos com propriedades antitumorais e métodos para monitorar a função de neutrófilos antitumorais in vitro e in vivo.

Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Uma série de métodos é descrita, incluindo o isolamento da lipoproteína de baixa densidade (LDL) do plasma humano, diferenciação de células HL-60 em células semelhantes a neutrófilos, preparação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) na presença de LDL e estimulação de células endoteliais aórticas humanas com uma mistura de NETs e LDL.

Estimulação de células endoteliais vasculares usando armadilhas extracelulares de neutrófilos na presença de lipoproteína de baixa densidade

Aprenda a isolar neutrófilos de baixa densidade de fluido de lavagem peritoneal para estudar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e sua interação com células tumorais. Este método permite visualizar a adesão de células tumorais às NETs intactas.

Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor (Vídeo) | JoVE Journal

Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

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