Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o papel das subpopulações de neutrófilos na imunologia tumoral, especialmente sobre o envolvimento mecânico de armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou NETs, na metástase tumoral. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização das interações adesivas das células tumorais com os TNEs intactos. As implicações dessa técnica se estendem à terapia do câncer.

Como TNEs derivados de subconjuntos específicos de neutrofil podem promover metástases tumorais. Demonstrando o procedimento estará Junko Shoniohara do nosso laboratório. Para adquirir os neutrófilos, primeiro infunda um litro de solução salina estéril normal imediatamente antes do fechamento da ferida diretamente na cavidade abdominal de um paciente que acabou de ser submetido a uma cirurgia abdominal devido a malignidade gastrointestinal e lave a cavidade abdominal extensivamente por pelo menos um minuto.

Em seguida, agite a solução salina dentro da cavidade e recupere 200 mililitros de líquido lavado com quatro seringas de 50 mililitros. No laboratório, transfira o fluido de lavagem peritoneal através de um filtro de náilon de 100 micrômetros para tubos individuais de 50 mililitros para centrifugação. Ressuspenda os pellets em 5 mililitros de PBS suplementado com 0,02% de EDTA e sobreponha cuidadosamente cada suspensão celular em três mililitros de solução de gradiente de densidade.

Após a separação do gradiente de densidade, colha dois a três mililitros da camada intermediária de cada tubo e lave as amostras de fluido peritoneal em 10 mililitros de PBS fresco mais EDTA por tubo. Junte os pellets em 10 mililitros de PBS fresco mais EDTA para uma lavagem adicional e dilua as células para uma vez 10 elevado à sétima célula por 60 microlitros de classificação de células ativadas magnéticas, ou MACS, concentração de tampão. Bloqueie qualquer ligação inespecífica com 20 microlitros de bloco Fc por 10 minutos a quatro graus Celsius, seguido pela adição de 20 microlitros de esferas magnéticas anti-CD66b.

Após 10 minutos a quatro graus Celsius, lave e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão MACS e adicione as células a uma coluna magnética de tamanho apropriado dentro do campo magnético de um separador magnético adequado. Quando todas as células CD66b negativas tiverem atravessado a coluna, adicionar 15 ml de tampão MACS novo ao reservatório da coluna e transferir a coluna do separador magnético para um novo tubo cónico. Em seguida, mergulhe imediatamente a coluna para liberar o positivo CD66b marcado magneticamente no tubo.

Após a centrifugação, ressuspenda os neutrófilos isolados de baixa densidade em cinco vezes 10 a sextas células por mililitro de meio RPMI1640 suplementado com concentração de FBS e semeie 1 mililitro de neutrófilos por poço na placa revestida de poli-L-lisina de seis poços. Após duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, corar as células em cada poço com um corante nuclear e cromossômico impermeável à membrana fluorescente apropriado, de acordo com as instruções do fabricante, e observar imediatamente a morfologia dos TNEs por microscopia de fluorescência. Para avaliar a adesão das células tumorais aos TNEs, ressuspenda as células tumorais gástricas coradas com o corante fluorescente contrastante em uma vez 10 elevado ao sexto por mililitro de RPMI1640 suplementado com 0,1% de concentração de albumina sérica bovina e adicione um mililitro de células tumorais a cada poço das culturas de neutrófilos de baixa densidade.

Após cinco minutos a 37 graus Celsius, remova o sobrenadante de cada poço e lave suavemente as células duas vezes com 2 mililitros de meio RPMI1640 pré-aquecido suplementado com BSA por lavagem. Uma incubação de cinco minutos é longa o suficiente para detectar a ligação específica do NET. Adicione o meio aquecido ao lado de cada poço, gire suavemente a placa e remova o sobrenadante com um aspirador.

Os NETs e as células tumorais anexadas podem então ser observados por microscopia de fluorescência. Para uma análise de vídeo de lapso de tempo das células tumorais aprisionadas cultive e core os neutrófilos peritoneais de baixa densidade em uma placa de 35 milímetros, revestida com poli-L-lisina, conforme demonstrado, seguida de uma breve lavagem em dois mililitros de 0,1% BSA mais RPMI1640. Substitua o meio por uma vez 10 elevado a sexto células tumorais gástricas não coradas suspensas em dois mililitros de RPMI suplementados com BSA por uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente.

No final da incubação, enxágue as células em dois mililitros de RPMI fresco suplementado com BSA por cinco minutos em temperatura ambiente, seguido de um giro suave para remover quaisquer células tumorais soltas. Em seguida, substitua o sobrenadante por DMEM suplementado com FBS e antibióticos e monte a placa em um sistema de observação de células de visão completa para análise de lapso de tempo do aprisionamento de células tumorais pelos TNEs. Após duas horas de cultura, os neutrófilos de baixa densidade CD66b positivos derivados do fluido de lavagem peritoneal exibem estruturas de cordas por coloração nuclear e cromossômica fluorescente verde, enquanto as células mononucleares CD66b negativas não.

Quando as culturas de neutrófilos de baixa densidade são pré-tratadas com 100 unidades por mililitro de DNAse I, no entanto, as estruturas características são destruídas, indicando que as estruturas são compostas de DNA extracelular expelido dos neutrófilos. Quando os neutrófilos de baixa densidade são cultivados em placas plásticas não revestidas, muitos aglomerados de NET podem ser observados flutuando dentro do meio com poucos NETs presos ao fundo do prato. Após cinco minutos de incubação com uma linha de células tumorais gástricas marcadas com fluorescência, muitas células tumorais se ligam aos neutrófilos dentro dos TNEs, um fenômeno que não é observado após o pré-tratamento com DNAse I. Padrões de adesão semelhantes também são observados para outras células tumorais.

OKUM-1 e NUGC-4. Curiosamente, enquanto os NETs desaparecem gradualmente dentro de várias horas após a co-cultura prolongada de células tumorais, as células tumorais presas pelos NETs começam a proliferar vigorosamente após a liberação do NET. Durante este procedimento, é importante lembrar que, como os NETs aderem fracamente ao prato, os processos de lavagem e transferência de louça devem ser realizados de maneira especialmente cautelosa.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores em vários campos da ciência biomédica explorarem a relação causal dos TNEs com várias doenças, como trombose, síndrome da resposta inflamatória sistêmica e doenças autoimunes.