Name: Síntese e caracterização de placentária Condroitina sulfato de uma (plCSA) - Targeting Lipid - nanopartículas de polímero (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Aprenda a sintetizar nanopartículas lipídico-poliméricas conjugadas com peptídeo plCSA-BP para entrega direcionada de fármacos a tumores humanos e trofoblastos placentários. Este método simples e reprodutível utiliza sonicação e técnicas de bioconjugação.

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Este trabalho foi financiado por doações da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China (2016YFC1000402), Fundação Nacional de ciências naturais (81571445 e 81771617) e a ciência Natural Fundação da província de Guangdong (2016A030313178) para O fundo de investigação do Basic de Shenzhen (JCYJ20170413165233512) para X.F. e X.F.

1. preparação das soluções estoque
<ol><li>Prepare uma solução aquosa de etanol a 4% diluindo com 100 mL de água ultrapura, 4 mL de etanol absoluto. Armazenar a solução a 4 ° C. Nota: Água ultrapura é definida como a água sem contaminantes, como bactérias, partículas, íons ou nucleases. Água ultrapura foi Obtida de um sistema de purificação de água com uma resistividade de alvo de até 18,2 mΩ·cm, que significa baixa contaminação aniônica.</li>
	<li>Prepare um 1 mg/mL solução de lecitina de soja, dissolvendo-se 20 mg de lecitina de soja em 20 mL de solução aquosa de etanol a 4%. Armazenar a solução estoque da lecitina de soja a 4 ° C.</li>
	<li>Prepare um 25 mg/mL solução DSPE-PEG (2000)-COOH dissolvendo-se 100 mg de DSPE-PEG-COOH em 4 mL de solução aquosa de etanol a 4%. Armazenar a solução estoque a-20 ° C.</li>
	<li>Prepare um 10 mg/mL solução stock de DOX, dissolvendo-se 50 mg de DOX em 5 mL de água ultrapura. Armazene a solução estoque DOX a 4 ° C no escuro.</li>
	<li>Prepare um 2 mg/mL solução stock de PLGA, dissolvendo-se 20 mg de PLGA em 10 mL de acetonitrila. Armazenar a solução estoque de PLGA a 4 ° C. Cuidado: Acetonitrilo é inflamável e tóxico. Operar com cuidado em uma coifa e usar o equipamento pessoal, tais como aventais, óculos de segurança e luvas de látex.</li>
	<li>Prepare uma solução stock ácido (MES, pH 6.0) de etanesulfónico 0,1 M 2-(morpholino) dissolvendo 2,17 g do MES em 100 mL de água ultrapura. Armazenar a solução a 4 ° C.</li>
</ol>2. síntese das DNPs
Nota: Para evitar degradação fotoquímica de DOX, todas as operações foram realizadas no escuro. Nanopartículas foram sintetizadas por um relatado anteriormente etapa única sonication método11,13,14.
<ol><li>Adicione 3 mL de solução aquosa de etanol a 4% para um tubo de centrifuga estéril 10 mL. Em seguida, adicione 90 µ g da solução-mãe lecitina de soja, 210 µ g da solução DSPE-PEG-COOH e 750 µ g da solução DOX para 3 mL de solução aquosa de etanol a 4%.</li>
	<li>Coloque o tubo de centrifugação em um banho de gelo e coloque o banho de gelo em um processador ultra-sônico.</li>
	<li>Com uma seringa de 1 mL, pipete 2 mg de PLGA solução-mãe gota a gota (1 gota/4-6 s) no tubo de centrífuga. Enquanto isso, proceda à sonicação do tubo usando um processador ultra-sônico em uma frequência de 20 kHz e uma amplitude de saída de 30% por 5 min para sintetizar os DNPs. Nota: Para sintetizar partículas uniformes com tamanhos pequenos, a velocidade na qual a solução PLGA é gotejada no tubo precisa ser lento, e geração de bolha deve ser evitada.</li>
	<li>Purificar os DNPs lavando a solução acima no buffer MES de 0,1 M (pH 6,0) 3 vezes usando um filtro de centrífuga (MWCO, 10 kDa). Centrifugar a 4 ° C e 1000 × g por 3 min cada tempo. Finalmente, aproximadamente 1 mL de nanopartículas MES-resolvido deve permanecer. Nota: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. Se não costumava conjugado peptídeos, as nanopartículas podem ser purificadas por tampão PBS (pH 7,4) e os DNPs purificados podem ser armazenados a 4° C, no escuro.</li>
</ol>3. conjugação de peptídeos para DNPs
<ol><li>
Ativação de éster
	<ol>
<li>Adicionar 0,4 mg de EDC (concentração final 2 mM) a 1 mL de DNPs.</li>
		<li>Adicionar 0,24 mg de NHS para a reação (concentração final de 2 milímetros). Nota: Para fácil adição da quantidade correta de EDC e NHS, uma solução pode ser preparar os reagentes são dissolvidos e usados imediatamente.</li>
		<li>Misturar os componentes de reação bem e colocar a reação num agitador; permita a reação por 30 min - 1 h à temperatura ambiente no escuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reação de amina
	<ol>
<li>Aumentar o tampão pH 7,2-7,5 usando PBS (20 ×, pH 7,4).</li>
		<li>Adicione 0,5 mg de plCSA-direcionamento peptide (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) para a solução de reação. Nota: Antes de adição, dissolva os peptídeos em 20% acetonitrila. Se não solúvel, peptídeos sonication em um sonicador de banho pode útil.</li>
		<li>Misture a solução bem e coloque em uma coqueteleira; permitir que a reação proceder a 4 ° C durante a noite, no escuro.</li>
		<li>Coloque a solução de conjugado em sacos de diálise (MWCO, 3.500 Da) para urinar e purificar os DNPs-plCSA usando o tampão PBS (pH 7,4) à temperatura ambiente por 24 h no escuro. Nota: Como alternativa, purificação pode ser executada como na etapa 2.4 para obter plCSA-DNPs.</li>
		<li>Para aplicações de cultura de células, filtre a solução reconstituída através de um filtro de 0,22 µm seringa estéril para remover potenciais precipitados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. caracterização de lipídios plCSA-alvo-nanopartículas de polímero
<ol><li>
Medição do tamanho hidrodinâmico de nanopartículas usando Difusão dinâmica da luz (DLS)
	<ol>
<li>Nanopartículas diluídas com água ultrapura (50-fold diluição). Carrega 500 µ l da amostra em uma cubeta de acordo com as instruções do instrumento potencial DLS ou zeta. Nota: Potencial Zeta e cubetas DLS podem diferir com base nas especificações do instrumento.</li>
		<li>Depois de concluída a medição, grave o diâmetro das partículas, índice de polidispersividade (PDI) e potencial zeta. Média dos resultados obtidos de 4 repetidas leituras e calcular o desvio padrão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) Nota: A morfologia das nanopartículas foi observada pela TEM com o método da mancha negativa. 24<ol>
<li>Nanopartículas diluídas com água ultrapura (400-fold diluição). Adicionar 20 µ l da amostra para um grid TEM e deixe para descansar por 5 min.</li>
		<li>Adicione 100 µ l de ácido fosfotúngstico a 2% (p/v) e deixe para descansar por 2 min. pavio fora da gota.</li>
		<li>Seque a grade TEM a temperatura de quarto.</li>
		<li>Definir a tensão de aceleração TEM 80 kV e ampliar a imagem para 100.000 × Visualizar as nanopartículas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinação da eficiência de encapsulação (EE) e LE
	<ol>
<li>Geração da curva padrão. Dissolver a DOX em água ultrapura para preparar soluções DOX de cinco diferentes concentrações: 1 µ g/mL, 5 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL e 100 µ g/mL. Medir a absorção das soluções DOX em 480 nm com um espectrómetro de UV-VIS. Gere uma curva padrão baseada-se as concentrações de DOX.</li>
		<li>Dilua 25 µ l de nanopartículas com 500 µ l de água ultrapura. Medir a absorção no 480 nm com um espectrómetro de UV-VIS. Calcule as concentrações de droga pela curva padrão.</li>
		<li>Calcule o LE usando a seguinte equação: LE = ((quantidade de drogas em nanopartículas) / (peso total dos materiais)) × 100%.</li>
		<li>Calcule o EE usando a seguinte equação: EE = ((quantidade de drogas em nanopartículas) / (quantidade de adicionado droga)) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medição da eficiência conjugação usando o bicinchoninic ácido (BCA) ensaio 25 , 26 , 27<ol>
<li>Pipete 25 µ l de soluções padrão de peptídeo (tabela 1) ou plCSA-DNPs em poços da microplaca em duplicado. Adicionar 200 µ l de reagente de trabalho para cada poço e misture a placa bem em um agitador de placa por 30 s.</li>
		<li>Cobrir a placa e incubar a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Medir a absorvância a 562 nm em um leitor de placa. Use a curva padrão gerada para calcular as concentrações de plCSA de plCSA-DNPs.</li>
		<li>Calcule a eficiência de conjugação usando a seguinte equação: Eficiência de conjugação = ((quantidade de peptídeo em nanopartículas) / (quantidade de adicionado do peptide)) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tubo de ensaio</td>
			<td>Volume de diluente (μL)</td>
			<td>Volume e fonte de peptídeo (μL)</td>
			<td>Concentração final do peptide (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>0</td>
			<td>300 de estoque</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>250</td>
			<td>250 do frasco uma diluição</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>250</td>
			<td>250 de diluição do frasco B</td>
			<td>250</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>250</td>
			<td>250 de diluição frasco C</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>300</td>
			<td>200 de diluição frasco D</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>250</td>
			<td>250 de diluição do frasco E</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>400</td>
			<td>100 de diluição do frasco F</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>500</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Preparação de peptídeos padrão
5. avaliação de microscopia de fluorescência de plCSA-alvo absorção de nanopartículas nas células Coriocarcinoma (JEG3)
<ol><li>Semente de células em placas de 12 poços estéril em 1,0 × 104 células/poço com DMEM/F12 completa (cDMEM/F12, contendo 1% penicilina/estreptomicina e 10% fetal de soro bovino (FBS)). Permitir que as células a crescer a confluência de 60% a 37 ° C e 5% CO2 sob condições úmidas.</li>
	<li>Remova a mídia e adicionar 1 mL de mídia fresca fria com um teor baixo de soro (5% FBS) e DNPs ou plCSA-DNPs (5 µ g de equivalentes DOX).</li>
	<li>Incube a mistura de células e nanopartículas a 4 ° C, durante 1 h.</li>
	<li>Após a incubação, remova a mídia e lavar as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione 1 mL de cDMEM fresco/F12 e incube as celulas a 37 ° C por 30 min.</li>
	<li>Retire a cDMEM/F12 e lave as células três vezes com PBS.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de frio paraformaldeído 4% (PFA) e incubar a temperatura ambiente por 15 min consertar as células.</li>
	<li>Remova o PFA. As células com 2 mL de PBS lave uma vez. Adicionar 1 mL de PBS contendo DAPI (1 µ g/mL) para núcleos de coloração e incubar a temperatura ambiente por 10 min.</li>
	<li>Aspirar a PBS e lavar as células três vezes com PBS.</li>
	<li>Adicionar o meio de montagem e imagem a fluorescência com uma microscopia de fluorescência, utilizando canais verdes e azul para visualizar o DOX e núcleos, respectivamente.</li>
</ol>

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<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+TAT+peptide+in+drug+delivery+systems%3A+proteolytic+stability+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements.</a> Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+ocular+delivery+to+laser-induced+choroidal+neovascularization+by+dual+internalizing+RGD+and+TAT+peptide-modified+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).</li>
</ol>

X.F. e B.Z. são os inventores sobre a patente PCT/CN2017/108646 e 201710906587.6 submetidos SIAT que abrange um método de síntese de nanopartículas plCSA-alvo e aplicação. Não há conflitos de interesse potenciais foram divulgados por outros autores.

Este protocolo fornece um método eficiente e reproduzível para a síntese de nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-BP-conjugados. O método passo a passo sonication para preparar nanopartículas de lipídios-polímero é rápido, reprodutível e diferente do típico nanoprecipitation métodos que envolvem o aquecimento, evaporação ou num Vortex. Portanto, o método desenvolvido reduz significativamente o tempo de síntese. Além disso, a EDC/NHS bioconjugate utilizado neste protocolo é uma técnica comumente usada e conveniente co...

Um método terapêutico eficaz câncer reduz e elimina tumores com mínima toxicidade sistêmica. Daí, tumor seletivo segmentação é a chave para explorar métodos terapêuticos bem sucedidos. Nanopartículas para oferecer uma oportunidade promissora para a terapia do câncer, e moleculares assemblies com diferentes grupos funcionais irão melhorar a eficácia da droga e reduzir os efeitos colaterais associados1,2. Além disso, os sistemas de nanopartículas principalmente utilizam passiva e ativa como alvo para atingir o alvo tumores3.
Segmentação passiva explora as características inatas de nanopartículas e permeabilidade reforçada e efeitos de retenção (EPR) para alcançar as células do tumor. Os lipossomas catiônicos têm sido utilizados com sucesso para entregar várias drogas anticâncer para tumores em aplicações clínicas4,5,6. Apesar do potencial efeito terapêutico eficaz do cancro, uma concentração baixa de drogas na região de tumor e uma incapacidade de distinguir as células do tumor de tecidos normais são duas limitações principais de nanopartículas de direcionamento de passivo-7.
Estratégias de segmentação ativas aproveitam do antígeno-anticorpo, ligante-receptor e outras interações de reconhecimento molecular para entregar drogas especificamente tumores8. O sulfato de condroitina placentária glicosaminoglicano um (plCSA) é amplamente expresso na maioria das células cancerosas e trophoblasts placentárias. Além disso, a proteína da malária VAR2CSA especificamente pode ligar para plCSA9,10. Portanto, o VAR2CSA pode ser uma ferramenta para o direcionamento de células cancerosas humanas. No entanto, quando VAR2CSA é conjugada com nanopartículas, a proteína completo pode limitar a penetração de nanopartículas em células tumorais. Recentemente, descobrimos um peptídeo de vinculação de plCSA (plCSA-BP), derivado da proteína da malária VAR2CSA. nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-BP-conjugados rapidamente ligado a células de Coriocarcinoma e doxorrubicina significativamente aumentada (DOX) atividade anticancerígena em vivo11; Estas partículas também especificamente ligados a trophoblasts da placenta e podem servir como uma ferramenta para a entrega de alvo de drogas para a placenta12.
Nanopartículas de lipídios-polímero consistem em um escudo de monocamada lipídico e um núcleo de polímero hidrofóbico e representam uma nova transportadora para a entrega da droga. Essas nanopartículas combinam as vantagens de lipossomas e nanocarriers poliméricos, tais como tamanho controlável de nanopartículas, alta biocompatibilidade, liberação de drogas sustentado, eficiência de carregamento de droga alta (LE) e excelente estabilidade13. Neste trabalho, usamos um método passo a passo sonication para sintetizar lipídios-polímero nanopartículas. Este método é rápido, conveniente e apropriado para aumentar e tem sido amplamente utilizado para preparar as nanopartículas de lipídios-polímero do nosso grupo11,14 e outros15,16,17,18 .
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) cloridrato de carbodiimida (EDC) é uma popular carbodiimida usada como um agente de reticulação para conjugar biomoléculas contendo aminas e carboxilatos19. Além de EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) é o reagente de conjugação mais comum na superfície e nanopartículas conjugação reações20,21. NHS pode reduzir o número de reações colaterais e melhorar a estabilidade e o rendimento do éster intermediários22,23.
Aqui, descrevemos um protocolo para a síntese de nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo. Primeiro, a síntese de etapa única sonication de nanopartículas de lipídios-polímero DOX-carregado (DNPs) é descrita. Então, uma técnica de bioconjugate EDC/NHS para a geração de nanopartículas de lipídios plCSA-BP-conjugados-polímero é introduzida. Esta técnica de bioconjugate também pode ser usada para conjugar outros anticorpos e peptídeos de nanopartículas. Finalmente, descrevemos o ensaio físico-químico de propriedades e in vitro usado para caracterizar as nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo. Acreditamos que essas nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo poderiam constituir um sistema eficaz para a entrega de alvo de drogas para cânceres mais humanos e a alvo entrega de cargas para a placenta para tratar anormalidades da placenta.

<table><tbody><tr><td>peptídeo plCSA</td><td>Shanghai GL Biochem</td><td>573518</td><td>para síntese de peptídeos</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sinopharm 10009218 químico</td><td></td><td>para síntese de nanopartículas</td></tr><tr><td>Lecitina de soja</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>441601</td><td>para síntese de nanopartículas</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880125</td><td>para síntese</td></tr> <tr><td>de nanopartículasDoxorrubicina</td><td>JKChemical</td><td>113424</td><td>para síntese de nanopartículas</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Shanghai Lingfeng</td><td>1008621</td><td>para síntese de nanopartículas</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719897</td><td>para síntese de nanopartículas</td></tr><tr><td>Processador ultrassônico</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>para síntese de nanopartículas</td></tr><tr><td>Filtro centrífugo (MWCO 10 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>para centrífuga de purificação de nanopartículas</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>3-18KS</td><td>para purificação de nanopartículas</td></tr><tr><td>Ácido 2-[morfolino] etanossulfônico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>para conjugação de peptídeos</td></tr><tr><td>Cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>para conjugação de peptídeos</td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td>para conjugação de peptídeos</td></tr><tr><td>Bolsas de diálise</td><td>Spectrum</td><td>132592T</td><td>para purificação de nanopartículas</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 10 mL, polipropileno</td><td>Aladdin</td><td>S-025</td><td>para síntese de nanopartículas</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL, polipropileno</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>para várias aplicações</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtro de seringa estéril</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td>para purificação de nanopartículas</td></tr><tr><td>seringa de 1 ml, polipropileno</td><td>BD</td><td>328421</td><td>para síntese de nanopartículas</td></tr><tr><td>Malvern Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>Nano ZS</td><td>para analisador de tamanho de partícula</td></tr><tr><td>Ácido</td><td></td><td></td> fosfotúngstico <td>para TEM</td></tr><tr><td>Grade TEM</td><td>EMCN</td><td>BZ10024a</td><td>para TEM</td></tr><tr><td>Espectrômetro UV-VIS</td><td>Leagene</td><td>DZ0035</td> para microscópio eletrônico <td>de transmissão</td></tr><tr><td>TEM </td><td>JEOL</td><td>JEM-100CXII</td><td>para analisador de tamanho de partícula</td></tr><tr><td>Reagente BCA A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23228</td><td>para ensaio</td></tr><tr><td>BCA Reagente BCA B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23224</td><td>para ensaio BCA</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>para BCA leitor</td></tr><tr><td>de placas</td> de ensaio <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan&trade; GO</td><td>para ensaio BCA</td></tr><tr><td>Placas de 12 poços</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>JEG3 célula</td><td>Banco de células da Academia Chinesa de Ciências</td><td>TCHu195</td><td>Planeta humana</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Hyclone</td><td>SH30272.01</td><td>fenol sem vermelho</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>GIBCO</td><td>10100</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15070063</td><td>para cultura celular</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>OLYMPUS</td><td>CKK53</td><td>para captação celular</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Shanghai Lingfeng</td><td>1372021</td><td>para captação celular</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606584</td><td>para captação celular</td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>Vida</td><td>útil P36961</td><td>para captação celular</td></tr></tbody></table>

síntese e caracterização de placentária condroitina sulfato de uma (plcsa) - targeting lipid - nanopartículas de polímero

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Um método terapêutico eficaz câncer reduz e elimina tumores com mínima toxicidade sistêmica. Nanopartículas ativamente direcionamento oferecem uma abordagem promissora para a terapia do câncer. O sulfato de condroitina placentária glicosaminoglicano um (plCSA) é expressa em uma ampla gama de células cancerosas e trophoblasts da placenta e proteína da malária que var2csa especificamente pode ligar para plCSA. Um peptídeo de sulfato de condroitina placentária relatado A ligação (plCSA-BP), derivado da malária proteína VAR2CSA, especificamente também pode ligar para plCSA em células cancerosas e trophoblasts placentárias. Daí, nanopartículas plCSA-BP-conjugado podem ser usadas como uma ferramenta para entrega de drogas específicas para cânceres humanos e trophoblasts placentárias. Neste protocolo, descrevemos um método para sintetizar lipídios plCSA-BP-conjugados-polímero nanopartículas carregadas com doxorrubicina (plCSA-DNPs); o método consiste em um único sonication passo e bioconjugate técnicas. Além disso, vários métodos para caracterizar plCSA-DNPs, incluindo a determinação de suas propriedades físico-químicas e celular captação pelas células da placenta Coriocarcinoma (JEG3), são descritos.

Neste protocolo, lecitina de soja, DSPE-PEG-COOH e PLGA são um polímero representativo, lipid-PEG-COOH conjugado e lipídios, respectivamente. A síntese de nanopartículas de lipid-polímero plCSA-alvo através de uma única etapa sonication método e uma técnica EDC/NHS é ilustrada na Figura 1. Primeiro, em condições de sonication, lecitina de soja, PLGA e DSPE-PEG-COOH auto-montagem para shell-núcleo de forma estruturada DNPs. O núcleo consiste de PLGA e...

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de sulfato de condroitina placentária A peptídeo de vinculação (plCSA-BP)-conjugados lipid-polímero nanopartículas através de etapa única sonication e bioconjugate técnicas. Estas partículas constituem uma nova ferramenta para a entrega de alvo da terapêutica de tumores mais humanos e trophoblasts da placenta para tratar cancros e anormalidades da placenta.

Síntese e caracterização de placentária Condroitina sulfato de uma (plCSA) - Targeting Lipid - nanopartículas de polímero

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de entrega de medicamentos, como a entrega direcionada de terapêuticas a cânceres humanos e o cistoblasto da placenta. A principal vantagem dessa técnica é que é um método simples e reprodutível para sintetizar peptídeos conjugados em outras partículas. Para começar, adicione três milímetros de 4% de etanol a um tubo de centrífuga de 10 mililitros estéril.Em seguida, adicione 90 microgramas de solução de estoque de lecitina de soja, 210 microgramas de solução de estoque de ácido DSPE-PEG-carboxílica e 750 microgramas de solução de estoque DOX. Use uma seringa de um mililitro para pipetar dois miligramas de solução de estoque PLGA. Coloque o tubo de centrífuga em um banho de gelo em um processador ultrassônico e sonicate por dois minutos.Em seguida, adicione a solução de estoque PLGA em termos de gota no tubo centrífuga. Para purificar os DNPs, use um filtro de centrífuga para lavar a solução em 0,1 amortecedor MES molar. Em seguida, centrifugar a solução a 1000 G por três minutos a quatro graus Celsius.Para iniciar a ativação do éster, adicione 0,4 miligramas de EDC a um mililitro de DNPs. Em seguida, adicione 0,24 miligramas de NHS à reação. Em seguida, permita que a reação ocorra por até uma hora à temperatura ambiente no escuro.Depois disso, misture bem os componentes de reação e coloque a reação em um agitador. Para iniciar a reação de amina, use PBS para aumentar o pH tampão de 7,2 para 7,5. Em seguida, adicione 0,5 miligramas de peptídeo de mira pICSA à solução de reação.Misture bem a solução e coloque-a em um shaker. Então, permita que a reação prossiga a quatro graus Celsius durante a noite no escuro. No dia seguinte, encha sacos de diálise com a solução conjugada.Purifique os DNPs pICSA com tampão PBS à temperatura ambiente por 24 horas no escuro. Depois de esculpir células de acordo com o protocolo de texto, remova a mídia e adicione um mililitro de mídia fresca e fria com 5% de FBS e DNPs pICSA ou DNPs. Em seguida, incubar a célula e a mistura de nanopartículas por uma hora a quatro graus Celsius.Depois disso, remova a mídia e lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione um mililitro de mídia fresca e incuba as células por 30 minutos a 37 graus Celsius. Depois disso, remova a mídia e lave as células três vezes com PBS.Em seguida, adicione dois mililitros de frio, 4% PFA e incubar a mistura à temperatura ambiente por 10 minutos. Remova o PFA e lave as células com dois mililitros de PBS. Em seguida, adicione um mililitro de PBS com DAPI para coloração de núcleos.Deixe a mistura incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. Por fim, adicione o meio de montagem e a imagem da fluorescência com um microscópio de fluorescência. Utilizando este protocolo, os DNPs foram preparados com sucesso e conjugados para pICSA BP. Após a conjugação, o diâmetro dos DNPs primários aumentou para aproximadamente 109 nanômetros.As imagens TEM dos DNPs e dos DNPs pICSA mostraram que as partículas estavam bem dispersas e geralmente demonstravam morfologia esférica. O potencial zeta das nanopartículas foi negativo 20,1 e 29,9 milivolts, indicando que as nanopartículas eram altamente estáveis. O ensaio de captação celular JEG3 indicou os DNPs pICSA ligados às células JEG3 dentro de 30 minutos.Portanto, a pICSA BP foi eficientemente conjugada à superfície. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sonicar a mistura por um a dois minutos antes de adicionar PLGA. Após este procedimento, nossos métodos como o ensaio HPLC podem ser realizados a fim de determinar a eficiência da conjugação com mais precisão.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia reprodutiva explorarem a possibilidade de tratamento direcionado à placenta em complicações da gravidez.

synthesis-characterization-placental-chondroitin-sulfate-plcsa

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este artigo descreve um método para sintetizar nanoprecipitation polímero baseado em nanopartículas usando dibloco co-polímeros. Vamos discutir a síntese de dibloco co-polímeros, a técnica nanoprecipitation e aplicações potenciais.

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

Descrevemos a produção e caracterização de nanopartículas e micropartículas compostas por poli(ácido lático-co-glicólico) utilizando a vitamina E-TPGS como emulsificante. Variando os parâmetros de formulação, como a concentração do emulsificante, é possível produzir nanopartículas com diâmetros médios que variam de 220 nm a 1,98 μm.

Nanopartículas de PLGA formadas por emulsão simples ou dupla com vitamina E-TPGS

O objetivo deste protocolo é incorporar SDF-1α, um fator de homing de células-tronco, em nanopartículas de sulfato de dextrano-quitosana.  As partículas resultantes são medidas quanto ao seu tamanho e potencial zeta, bem como o conteúdo, atividade e taxa de liberação in vitro de SDF-1α das nanopartículas.

Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano

Neste estudo, foi descrito um método para sintetizar populações ultrapequenas de nanopartículas biocompatíveis, bem como vários métodos in vitro para avaliar suas interações celulares.

Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) para intracelular Segmentação Aplicações

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

Uma nanopartícula cristal líquido (LCNP) nanocarrier é utilizado como um veículo para a libertação controlada de uma carga hidrofóbico à membrana plasmática de células vivas.

Targeted Plasma Membrane entrega de um hidrofóbica Carga encapsulado em um cristal líquido nanopartículas Transportador

Este artigo descreve um processo para ajustar a densidade de tamanho e reticulação de covalentemente quitosana nanopartículas de poliéster linear contendo funcionalidade pendente. Ajustando os parâmetros de síntese (peso molecular de polímeros, incorporação de funcionalidades de pingente e crosslinker equivalentes), uma densidade de tamanho e reticulação de nanopartículas desejado pode ser alcançada para aplicações de entrega de drogas.

Nanosponge pré-definido em tamanho e densidade de reticulação

Descrevemos um sistema que utiliza três métodos para avaliar a segurança e a eficácia da entrega da droga placenta-alvo: no vivo de imagem para monitorar o acúmulo de nanopartículas, ultra-som de alta frequência para monitorar o desenvolvimento placentário e fetal e HPLC para quantificar a entrega da droga ao tecido.

Avaliação global da eficácia e segurança de entrega de droga Placenta-alvo usando três métodos complementares

Este artigo descreve o encapsulamento de falcarindiol em revestidos de lipídeos 74 nm nanopartículas. A absorção celular das nanopartículas por células-tronco humanas em gotículas lipídicas é monitorada por imagem fluorescente e confocal. Nanopartículas são fabricadas pelo método de injeção rápida do solvente de movimento, e seu tamanho é medido com a técnica de espalhamento de luz dinâmica.

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Este protocolo descreve a síntese e formulação de biomateriais hidrogéis de polímero supramolecular injetável (PNP). As aplicações desses materiais para entrega de medicamentos, estabilização biofarmacêutica e encapsulamento e entrega celular são demonstradas.

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Aprenda a sintetizar nanopartículas lipídico-poliméricas conjugadas com peptídeo plCSA-BP para entrega direcionada de fármacos a tumores humanos e trofoblastos placentários. Este método simples e reprodutível utiliza sonicação e técnicas de bioconjugação.

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