Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave da imunobiologia básica e pesquisas de doenças inflamatórias intestinais sobre a cascata de aderência das células imunes necessárias para o envio de órgãos periféricos. A principal vantagem dessa técnica é que é uma abordagem conveniente e direta para responder a perguntas funcionais no contexto da adesão celular em condições de fluxo. Embora este método tenha sido desenvolvido para explorar o mecanismo de anticorpos anti-integrin poiéticos celulares em doenças inflamatórias intestinais, ele pode ser modificado para analisar questões semelhantes em outros ambientes de doença inflamatória.

Comece esticando um pedaço de tubo de borracha de um lado com uma tesoura pequena para permitir a inserção de um capilar retangular de aproximadamente 0,5 centímetros no tubo. Em seguida, selar a conexão com o filme de parafina. Cubra o capilar com 20 microlitadores do endereço de interesse e sele o lado não conectado à tubulação com filme de parafina de plástico por pelo menos uma hora de incubação a 37 graus Celsius.

No final da incubação, remova o filme plástico de parafina e deixe o líquido sair do capilar em uma toalha de papel para esvaziar a tubulação. Em seguida, bloqueie o capilar com 20 microliters de solução de bloqueio por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius. É muito importante aplicar o bloqueio ao capilar logo após a remoção do revestimento para evitar a secagem do capilar, pois isso pode prejudicar a funcionalidade das proteínas codificadas.

Enquanto o capilar está sendo bloqueado, adicione 18 mililitros de sangue humano inteiro anticoagulado de um tubo de 50 mililitros e dilua o sangue a um volume total de 35 mililitros com PBS. Camada 10 mililitros de gradiente de densidade médio sob a solução sanguínea e isolar as células sanguíneas mononucleares periféricas por centrifugação gradiente de densidade. No final da separação, transfira as células mononucleares de sangue periféricos da interface do gradiente de densidade para um novo tubo de 50 mililitros.

E traga o volume total no tubo até 50 mililitros com PBS fresco. Após a centrifugação, resuspengue a pelota em 10 mililitros de PBS fresco para contagem e colorir as células com um corante de rastreamento celular adequado de acordo com as instruções do fabricante. No final da incubação de manchas, colete as células por centrifugação e resuspengue a pelota em 1,5 vezes 10 para as seis células por mililitro de concentração média RPMI completa.

Em seguida, semente um mililitro de células em tantos poços de uma placa 48 bem como há condições. E adicione o volume apropriado de anticorpo anti-integrino aos poços apropriados para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, use uma pipeta P1000 para resuspensar as células várias vezes antes de transferir as células para dois tubos mililitros individuais.

Enxágüe cada poço com um mililitro de PBS e acumule as lavagens nos tubos de dois mililitros apropriados. Após a contagem, pelota as células por centrifugação e resususpensou as células no volume apropriado de tampão de adesão para obter 1,5 vezes dez para as sextas células por suspensões mililitros. Em seguida, adicione o volume apropriado de cloreto de manganês a cada tubo a uma concentração final de um mililitro.

Quando as células estiverem prontas, ligue o microscópio e selecione os filtros e lasers apropriados, modo objetivo e de aquisição. Remova o filme de parafina de plástico da ponta do capilar e use uma tesoura para esticar um pedaço de tubo de borracha de cinco centímetros para permitir que o capilar seja conectado ao tubo menor. Sele a conexão entre o capilar e o tubo com filme de parafina de plástico.

E montar o capilar em uma bandeja de fixação. Coloque a bandeja no porta-bandeja do microscópio para que o capilar esteja em foco. E insira a tubulação de borracha no entalhe correspondente da bomba peristáltica.

Coloque a extremidade não sectada da tubulação no primeiro tubo de amostra contendo a suspensão celular. E insira o tubo curto do outro lado do capilar em um tubo de 15 mililitros para coletar fluxo através. Deixe o tubo encher a uma taxa de fluxo de 500 microliters por minuto até que a suspensão da célula quase atinja o capilar.

Em seguida, deixe o preenchimento capilar a uma taxa de fluxo de 100 microliters por minuto. Quando o capilar estiver cheio de células, ajuste a taxa de fluxo para 10 microliters por minuto e capture imagens de lapso de tempo das células movendo-se lentamente através do capilar ao longo do interior da parede revestida de endereçada a cada dois segundos por um total de três minutos. Uma vez que a suspensão celular atinja o interior do capilar, é fundamental evitar qualquer interrupção do fluxo, pois isso levará a uma interação estática de integrin potencialmente tendenciosa a medição.

Antes de descartar o fluxo todo o capilar através da ocular do microscópio para ter certeza de que a seção observada na tela é representativa. Liberte a tubulação da bomba e deixe o fluido restante correr de volta para o tubo de dois mililitros. Em seguida, desconecte o capilar e o tubo da bandeja de fixação e imagem do próximo capilar como apenas demonstrado.

Para avaliar as gravações de lapso de tempo, abra a primeira sequência no software de análise apropriado e exporte as três primeira e últimas imagens como arquivos TIFF. Abra as três imagens ina que estão no ImageJ e selecione imagem, digite e 32 bits para converter as imagens em 32 bits. Em seguida, selecione canais de imagem, cor e mesclagem para mesclar as imagens em uma imagem e converter a imagem composta em RGB para salvar como um arquivo TIFF.

Depois de converter as três últimas imagens da mesma forma, conte as células brancas visíveis no início e terminando imagens compostas. E subtrair o número de células brancas na imagem inicial do número de células brancas na imagem final. A perfusão de capilares revestidos com ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, mas não isótipo Fc quimera com PBMCs humanos leva à adesão marcada quando um dos três addressins está presente.

Em contraste, a inibição de integrin abordando interações usando anticorpos neutralizantes normalmente leva a uma diminuição acentuada da adesão dinâmica que está ausente quando anticorpos de controle de isótipo são adicionados. Além disso, o tratamento de células T humanas CD4 com quimioterapias específicas leva a um aumento da adesão às endereçadas em comparação com células humanas não tratadas. Ao tentar esse procedimento, é muito importante lembrar que vários fatores contribuem para a adesão celular dinâmica in vivo que não pode ser completamente recapitulada neste ensaio.

No entanto, é possível ajustar o ensaio para abordar questões muito complexas. Para abordar questões adicionais sobre o comportamento diferencial de adesão dos tipos de células de teste, também é possível realizar ensaios de adesão competitivos com diferentes tipos de células rotulados com diferentes corantes de rastreamento celular. Após seu desenvolvimento, essa técnica nos permitiu explorar os efeitos dos diferentes anticorpos anti-integrin utilizados ou atualmente em desenvolvimento para o tratamento de doenças inflamatórias intestinais.