Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a autoterapia do olho, como qual é a eficácia de um tecido de bioengenharia especificamente projetado in vivo. Com esta técnica, fornecemos um método de produção e contorno do tecido retiniano, bem como uma estratégia para processar o tecido para implantação ocular em um modelo animal. Comece lavando de um a quatro pedaços de membrana amniótica humana de 30 por 30 mm, ou hAM.

Fixe um andaime de nylon duas vezes em 80ml de PBS por lavagem em uma garrafa de 250ml em uma coqueteleira, em alta velocidade por cinco minutos. Após a segunda lavagem, adicione 40ml de solução de termolisina funcional a cada frasco e agite os frascos duas vezes por cinco minutos a 450 rpm, seguidos de 30 segundos de vórtice. Após a segunda rodada de tratamento com Thermolisin, lave as peças mais duas vezes com 80ml de PBS por lavagem, conforme demonstrado.

Em seguida, use uma pinça longa e estéril para transferir os hAMs individualmente, para uma placa de cultura de 10 cm, contendo 10 ml de PBS. Em seguida, coloque uma membrana com o náilon voltado para baixo em uma segunda placa de cultura de 10 cm de PBS e retire dois dos quatro clipes que prendem a membrana ao náilon. Insira o anel menor do inserto de cultura entre o náilon e a membrana, certificando-se de que a membrana cubra completamente o anel menor.

Prenda a segunda parte do inserto de cultura na parte superior da membrana de modo que a membrana basal do hAM fique voltada para o lado direito para cima no inserto de cultura e solte os dois últimos clipes. Em seguida, use uma tesoura estéril para aparar qualquer membrana fora do inserto de cultura, conforme necessário. E use uma pinça para transferir a membrana para um poço de uma placa de 12 poços, contendo PBS para armazenamento a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Antes da semeadura, aqueça frascos criogênicos contendo uma vez 10 elevado à sexta célula RPE em 3 ml de meio RPE em um tubo cônico de 15 ml por frasco. Quando as células tiverem descongelado, pipetar para obter suspensões unicelulares em cada um dos tubos e contar o número de células viáveis por exclusão tri pan blue. Recolher as células por centrifugação e ressuspender os sedimentos a uma concentração de sete vezes 10 elevado ao quinto das células por mililitro em meio EPR fresco.

Em seguida, aspire o PBS de cada poço da placa de 12 poços preparada e adicione 500 microlitros de células ao centro de cada inserção de cultura e 1ml de meio RPE ao fundo de cada poço. Em seguida, retorne a placa para a incubadora de cultura de células por 30 dias, trocando o meio duas vezes por semana até o final da cultura. No dia 30 da cultura, aqueça uma solução de gelatina a 8% em banho-maria a 37 graus Celsius, por 30 minutos.

E encha a câmara interna de um vibratomo com quatro graus Celsius de meio independente de CO2. Use um bisturi para cortar um bloco de 5 cm por 5 cm de um bloco de gelatina a 20% armazenado a quatro graus Celsius. Prenda a parte superior do bloco ao suporte com um adesivo apropriado.

E coloque uma nova lâmina no vibratome. Ajuste o bloco até que esteja no mesmo nível da lâmina de barbear e encha o banho ao redor do suporte com meio independente de CO2 fresco de quatro graus Celsius. Corte o bloco a uma velocidade média até que o bloco seja cortado uniformemente com uma superfície de ataque lisa e defina a posição para zero.

Em seguida, aspire o meio ao redor da gelatina até que a gelatina esteja completamente seca. E use uma pinça para abrir cuidadosamente uma inserção de cultura semeada RPE no topo do bloco. Use uma tesoura para remover toda a membrana fora do anel de inserção e aspire todo o volume do meio residual.

Adicione até 1ml de solução de gelatina líquida a 8% na membrana até que ela esteja coberta. E remova cuidadosamente o excesso de gelatina. Após cinco a oito minutos, adicione meio fresco independente de CO2 de quatro graus Celsius ao banho até que a membrana solidificada esteja coberta.

E com o vibratomo na posição de 100 mícrons, corte uma seção da membrana em velocidade média, tomando cuidado para manter a orientação do tecido. Corte um canto da seção com um bisturi para permitir a identificação da orientação da seção. E use uma espátula para transferir a membrana embebida em gelatina para uma de uma placa de seis poços, preenchida com meio de conservação de quatro graus Celsius.

A orientação da fatia pode ser invertida devido ao movimento livre antes do canto ser cortado. Portanto, tome cuidado para garantir a posição da fatia logo após a seção. O tamanho do implante pode então ser ajustado ao tamanho do olho receptor sob um microscópio cirúrgico, antes do transplante.

Normalmente, algumas células mortas permanecem na superfície da membrana, após a fixação no inserto de cultura, mas essas células são eliminadas quando o meio de cultura é trocado. As fibras da membrana basal são visíveis em uma ampliação maior quando não restam células, indicando que o período de tratamento com termolisina foi otimizado. O epitélio da retina torna-se mais fácil de ver ao microscópio, à medida que amadurece, formando uma monocamada completa semelhante a um paralelepípedo em três semanas.

Com quatro semanas, o epitélio está maduro o suficiente para ser preparado para implantação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o estado da gelatina depende da temperatura. Portanto, tome cuidado para seguir rigorosamente as temperaturas recomendadas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da terapia com células-tronco explorarem o potencial terapêutico de um tecido de bioengenharia em um modelo animal de retinite pigmentosa. Embora esse método possa ser usado para preparar um tecido em cima de um andaime, para seu transplante subsequente, ele também pode ser aplicado a sistemas mais complexos contendo camadas fotorreceptoras. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à dificuldade em manusear as membranas amnióticas humanas, que são muito finas e tendem a se dobrar facilmente.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de fixação da membrana amniótica humana e de incorporação de gelatina são difíceis de aprender e requerem uma abordagem de manuseio específica.