Avaliação global da eficácia e segurança de entrega de droga Placenta-alvo usando três métodos complementares

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da nanomedicina sobre a eficácia e a segurança do medicamento carregado em nanopartículas entregues à mãe e ao feto. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita uma medição bioquímica precisa da quantidade de medicamento entregue à placenta. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de complicações da gravidez mediadas pela placenta, porque é importante garantir o direcionamento preciso da administração do medicamento à placenta.

A demonstração visual desse método é crítica, pois a avaliação por ultrassom de alta frequência do desenvolvimento embrionário requer paciência e experiência para dominar. Para injeção intravenosa de nanopartículas, transfira um camundongo prenhe do Dia Embrionário 14.5 com veias da cauda dilatadas pelo calor para um limitador e limpe a cauda com um cotonete embebido em álcool. Em seguida, insira a ponta da agulha de uma seringa de insulina de calibre 28 em uma veia da cauda dilatada e pressione lentamente o êmbolo por cinco a 10 segundos com pressão uniforme para entregar as nanopartículas na veia da cauda.

30 minutos após a injeção, coloque a rata grávida anestesiada na câmara de imagem de um sistema de imagem de fluorescência in vivo na posição supina. Selecione a fluorescência 2D e os parâmetros fotográficos apropriados para a imagem dos sinais de fluorescência verde de indocianina e defina a exposição para auto e os comprimentos de onda de excitação e emissão para 710 e 820 nanômetros, respectivamente. Em seguida, imagine o animal e devolva a rata grávida à gaiola.

48 horas após a injeção, use pinças de Graefe, pinças de tecido de Graefe e tesouras de dissecação para coletar os fetos e placentas e obter imagens dos tecidos colhidos como acabamos de demonstrar para todo o animal. Para avaliação de ultrassom de alta frequência do desenvolvimento embrionário, 24 horas após a injeção de nanopartículas, prenda a mãe grávida anestesiada em uma plataforma de imagem de ultrassom pré-aquecida de 37 a 42 graus Celsius na posição supina e coloque o transdutor de 40 megahertz no braço mecânico. Em seguida, ajuste a posição do transdutor para obter imagens longitudinais do feto e da placenta com a região de interesse dentro da zona focal.

Para imagens e análises no modo B, selecione o modo B e abaixe o transdutor sobre o abdômen até que o feto e a placenta sejam visualizados. Clique em Digitalizar/Congelar para iniciar e parar a imagem, Armazenamento de Cinema para armazenar o loop de cinema e Armazenamento de Quadros para armazenar as imagens do quadro. Em seguida, clique em Medir para analisar o comprimento do saco gestacional, o comprimento da garupa da coroa fetal, o diâmetro biparietal, a circunferência abdominal, o diâmetro da placenta e a espessura da placenta.

Para imagens e análises Doppler de onda de pulso, usando a mesma projeção de varredura, primeiro clique em Colorido, selecione Onda de pulso e coloque a caixa de volume de amostragem no centro da artéria umbilical. Clique em Scan/Freeze para iniciar a imagem e em Cine Store para coletar as imagens da artéria umbilical. Em seguida, clique em Medir para calcular a velocidade de pico da artéria umbilical.

Para imagens e análises do modo Doppler colorido, usando a mesma projeção de varredura, clique em Cor e ajuste a posição do transdutor para obter imagens do coração fetal, conforme demonstrado. Em seguida, clique em Medir para calcular a frequência cardíaca fetal do loop de imagem de cinema armazenado. Para análise de cromatografia líquida de alta pressão, ou HPLC, primeiro injete uma rata grávida embrionária do dia 14.5 com uma única dose de nanopartículas, conforme demonstrado.

Após 24 horas, perfunda o coração da animal grávida com 50 mililitros de solução salina gelada a 0,9% por 10 minutos para remover quaisquer nanopartículas não ligadas e colete os fetos e placentas para armazenamento de menos 80 graus Celsius. No dia da análise, adicione 500 microlitros de solução de homogeneização recém-preparada a cada amostra de tecido de 200 miligramas e homogeneize as amostras duas vezes em velocidade máxima por 30 segundos por dissociação. Após a segunda homogeneização, centrifugue as amostras e filtre os sobrenadantes através de um filtro de seringa de 0,45 micrômetro em um frasco para HPLC.

Coloque os frascos de amostra em uma bandeja de amostrador automático para injeção e ligue o desgaseificador de HPLC para remover o ar do sistema. Em seguida, ligue o fluxo para equilibrar a coluna com a fase móvel por 30 minutos para reduzir o ruído da linha de base e defina a temperatura da coluna para 25 graus Celsius. Em seguida, injete volumes de amostra de 20 microlitros a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto em 30 minutos e clique em Executar método para iniciar a análise.

Quando as execuções estiverem concluídas, altere manualmente a fase móvel para acetonitrila de grau HPLC e execute a acetonitrila por aproximadamente 15 minutos para proteger o sistema. A imagem in vivo revela fortes sinais verdes de indocianina no tecido uterino 30 minutos após a injeção de nanopartículas conjugadas com fluorescência ligadas ao sulfato de condroitina placentária, enquanto as nanopartículas não ligadas se localizam principalmente no fígado e nas regiões esplênicas. 48 horas após a injeção, o sinal fluorescente é observado na placenta de animais injetados com nanopartículas ligadas ao sulfato de condroitina placentária, sem sinais detectados no feto.

O monitoramento por ultrassom de alta frequência de animais injetados com nanopartículas conjugadas com fluorescência ligadas a sulfato de condroitina placentária revela uma diminuição significativa nos principais marcos de desenvolvimento fetal e placentário. Curiosamente, o tratamento com nanopartículas ligadas ao metotrexato também prejudica ligeiramente o desenvolvimento fetal e placentário, indicando que as nanopartículas podem melhorar a entrega de metotrexato à placenta por meio da permeabilidade aprimorada e do efeito de retenção. A medição das concentrações de metotrexato por HPLC indica um tempo de retenção de sete minutos dentro das placentas de camundongos injetados com nanopartículas ligadas ao metotrexato.

24 horas após a injeção, os níveis de metotrexato placentário no grupo injetado com nanopartículas ligadas ao metotrexato são significativamente mais baixos do que os medidos no grupo de sulfato de condroitina placentária e nanopartículas ligadas ao metotrexato, sem metotrexato detectado nos fetos deste último. O metotrexato ainda pode ser detectado na placenta 48 horas após a injeção de sulfato de condroitina placentária e nanopartículas ligadas ao metotrexato, demonstrando que o sulfato de condroitina placentária e as nanopartículas ligadas ao metotrexato não podem atravessar a placenta, minimizando assim os potenciais efeitos adversos no feto. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a placenta começa a se formar por volta do Dia Embrionário 9 1/2 e, portanto, o experimento de imagem in vivo é melhor realizado no Dia Embrionário 10 1/2 ou posterior.

Após este procedimento, outros métodos, como coloração e análise de imunofluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a localização das nanopartículas dentro da placenta. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da medicina reprodutiva explorarem a possibilidade de tratamento direcionado à placenta em complicações na gravidez.