Um procedimento de isolamento de RNA em Tandem do Oligonucleotide-baseado para recuperar complexos mRNA-proteínas eucariotas

Um procedimento de isolamento de RNA em tandem (viagem) para recuperação de complexos mRNA-proteínas endogenamente formado é descrito. Especificamente, complexos de RNA-proteína são quitosana na vivo, polyadenylated RNAs são isolados de extratos com grânulos de oligo (descolamento) e particulares mRNAs são capturados com modificados oligonucleotides antisentidos do RNA. Proteínas vinculadas a mRNAs são detectadas pela análise de immunoblot.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da regulação da expressão gênica, como a forma como as proteínas de ligação ao RNA se reúnem em RNAs específicos in vivo e, assim, impõem a regulação gênica pós-transcricional. A principal vantagem dessa técnica é que ela não precisa de clonagem ou manipulação genética. Pode ser adaptado a qualquer organismo modelo ou subtipo.

Para projetar oligonucleotídeos, analise a estrutura secundária do mRNA ou um fragmento dele usando ferramentas online. Primeiro, insira a sequência de nucleotídeos na caixa vazia e, em seguida, na caixa Opções básicas, selecione a energia livre mínima e evite pares de bases isolados. Na caixa Opções de saída, selecione o gráfico interativo da estrutura secundária do RNA e, finalmente, clique no botão Continuar.

Uma nova janela aparecerá exibindo a estrutura secundária do mRNA de interesse. Selecione pelo menos três sequências diferentes de 21 a 24 nucleotídeos dentro do mRNA de interesse, preferencialmente em regiões sem estruturas secundárias extensas e localizadas em regiões não traduzidas de 3 primos. Selecione regiões com uma proporção guanidina/citosina próxima a 50% e sem repetições em tandem de nucleotídeos para evitar a formação potencial de grampos de cabelo ou auto-anelamento.

Projete manualmente oligonucleotídeos de RNA modificados com 2-prime-metoxi com uma porção de biotina no 3-prime que sejam totalmente complementares às regiões selecionadas dentro do mRNA alvo desejado. Use uma ferramenta online adequada para ajustar a temperatura de fusão dos híbridos de RNA entre 60 e 65 graus e ter uma boa complexidade de sequência linguística. Use a Ferramenta Básica de Pesquisa de Alinhamento Local para procurar uma possível hibridização cruzada de ASO com outros mRNAs no transcriptoma.

Selecione Nucleotídeo BLAST, insira a sequência na caixa vazia e selecione o organismo de interesse. Mantenha os parâmetros restantes como padrão e clique em BLAST. Transfectar células HEK293 a 70% de confluência em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros, misturando dois microgramas do gene repórter com 20 microlitros de reagente de transfecção e adicionando às células.

Coloque as células em uma incubadora a 37 graus Celsius por 48 horas antes da colheita. No dia da colheita, remova o meio com uma pipeta sorológica e lave rapidamente as células duas vezes com 10 mililitros de PBS pré-aquecidos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione seis mililitros de PBS ao prato e coloque no gelo.

Em seguida, exponha as células à luz UV a 100 milijoules por centímetro quadrado em um reticulador UV. Após a exposição aos raios UV, raspe as células e o PBS e transfira para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, gire as células a 250 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Depois de remover o sobrenadante com uma pipeta, ressuspenda as células em dois mililitros de tampão de lise pré-resfriado pipetando para cima e para baixo cinco ou seis vezes, mantendo o tubo no gelo. Transfira o lisado com uma pipeta para um tubo de cinco mililitros colocado no gelo e sonice por três rodadas, consistindo em rajadas de 20 segundos com amplitude de 10 mícrons com 30 segundos de períodos de resfriamento no gelo. Depois de transferir o lisado para tubos de dois mililitros, centrifugue a 15.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Colete o sobrenadante e transfira para um novo tubo. Para iniciar o isolamento do RNA, equilibre um miligrama de esferas magnéticas acopladas a oligo (dT) em 500 microlitros de tampão de lise. Remova o tubo do rotador, coloque-o em um rack magnético e remova o tampão de lise.

Combine quatro miligramas de extrato de proteína HEK293 com as esferas magnéticas acopladas a oligo (dT) 25. Misture as amostras vigorosamente e incube por 10 minutos a 25 graus Celsius. Coloque os tubos em um suporte magnético por 10 segundos e, em seguida, remova o sobrenadante.

Mantenha o sobrenadante no gelo para as rodadas subsequentes de recuperação. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem A às contas e vórtice por cinco segundos. Colete as esferas com um ímã e, em seguida, lave-as duas vezes com 500 microlitros de tampão de lavagem B.To elui o RNA, adicione 30 microlitros de Tris-HCl 10 milimolares e incube o tubo a 80 graus Celsius por dois minutos com agitação contínua a 1.000 RPM.

Transfira o tubo diretamente para o suporte magnético e colete o eluído o mais rápido possível após 10 segundos ou mais para evitar a possível religação de mRNAs aos grânulos em temperaturas mais baixas. Os eluatos de rodadas repetidas são então combinados e podem ser armazenados a menos 80 graus Celsius. Para capturar mRNAs específicos, adicione 30 microlitros de esferas magnéticas acopladas à estreptavidina a um mililitro de ligação e tampão de lavagem contendo 0,1 miligrama por mililitro de RNA de transferência de E.coli.

Equilibre-se em um rotador por uma hora em temperatura ambiente. Após uma hora, lave as contas três vezes com 750 microlitros de encadernação e tampão de lavagem. Vortex o tubo, em seguida, remova o tampão P&B, depois ressuspenda em 30 microlitros de tampão e mantenha no gelo até o uso.

Dilua aproximadamente 35 microgramas de proteína total do isolamento poli (A) anterior em 100 microlitros de tampão de ligação e lavagem, em seguida, adicione 200 picomoles do oligonucleotídeo antisense apropriado e incube a 70 graus Celsius por cinco minutos para facilitar o recozimento. Remova todo o bloco de calor do dispositivo e coloque-o em temperatura ambiente por 10 minutos para esfriar lentamente. Em seguida, adicione os 30 microlitros de esferas magnéticas acopladas a estreptavidina equilibradas à amostra e, em seguida, incube a mistura por 30 minutos a 25 graus Celsius com agitação constante a 950 rpm em um misturador.

Coloque o tubo no suporte magnético, remova o sobrenadante e lave as contas três vezes com 750 microlitros de encadernação pré-aquecida e tampão de lavagem a 55 graus Celsius. Adicione 20 microlitros de Tris-HCl 10 milimolares e coloque a 90 graus Celsius com agitação constante a 950 rpm por 10 minutos para eluir o RNA. Após 10 minutos, coloque o tubo no suporte magnético e colete imediatamente o eluído.

Este é um gel de agarose usado para a detecção de mRNAs com RT-PCR usando primers específicos após captura com oligo (dT) e um oligonucleotídeo antisense para mRNAs p27 do extrato de células HEK293. Um controle sem oligonucleotídeos antisense também é mostrado. As pistas de entrada mostram o RNA total das células reticuladas.

Além disso, são também apresentados os resultados da concorrência com a poli(A). Aqui é mostrada uma análise de immunoblot de proteínas ligadas ao mRNA com anticorpos que detectam o antígeno R humano, proteína de ligação ao RNA desconhecida e beta-Actina, que é uma proteína de controle negativo. O blot mostra que o antígeno humano R foi detectado com sucesso em isolados de poli(A)RNA após a captura de mRNAs de p27 com oligonucleotídeos antisense.

O antígeno humano R não foi detectado em isolados de controle sem oligonucleotídeo antisense. As pistas de entrada mostram as proteínas no extrato de células reticuladas e os resultados da competição com poli (A) também são mostrados. Após este procedimento, outro método como espectrometria de massa pode ser realizado para analisar sistematicamente toda a amostra de proteína interagindo com um RNA específico in vivo.

É importante ressaltar que o TRIP é uma abordagem versátil que pode ser adaptada a todos os tipos de RNAs poliadenilados em organismos para entender o arranjo dinâmico das interações de proteínas de RNA. Portanto, pode ser usado para investigar RNAs controlados pelo desenvolvimento ou relacionados a doenças e pode eventualmente levar a novos alvos para intervenção terapêutica.