Name: Medição da concentração de íons na camada limite Unstirred com pipeta aberto Patch-Clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Aprenda a medir concentrações iônicas na camada limite não agitada usando patch-clamp com pipeta aberta. Este método melhora a precisão no estudo de canais iônicos mecanossensíveis e dinâmica de fluidos.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa pioneiro de centro de pesquisa (2011-0027921), pela ciência pesquisa programas básicos (2015R1C1A1A02036887 e 2016R1A2B4014795-NRF) através da nacional Research Foundation da Coreia financiada pelo Ministério da ciência, TIC & Planejamento de futuro e por uma concessão da Coreia saúde tecnologia R & D Project através de Instituto para o desenvolvimento indústria da saúde a Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (HI15C1540).

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações institucionais da Universidade de Konkuk.
1. Agarose pontes de sal entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl
Nota: Agarose 3M KCl pontes de sal são produzidos como anteriormente descrito12 com pequenas variações.
<ol><li>Formação de pontes<ol>
<li>Dobre os tubos capilares de vidro de fogo para formar uma U-forma conforme apropriado. O diâmetro interno dos capilares deve ser grande o suficiente para reduzir a resistência série, durante a gravação de correntes grandes do íon. Tubos de 2 a 5 mm de diâmetro interno são geralmente aceitáveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da solução de KCl 3M agarose<ol>
<li>Preparar 100 mL de solução de KCl 3M (1 M ou 2 M também é aceitável).</li>
		<li>Pese 3 g de agarose.</li>
		<li>Dissolver o agarose em 100 mL de KCl (ou seja, 3% agarose) sobre uma chapa quente entre 90 e 100 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carregando as pontes com agarose de KCl 3M<ol>
<li>Para facilitar o carregamento, mergulhe as pontes de vidro em forma de U na solução de agarose-KCl. Nota: É fácil de escavar as pontes de vidro, se a solução de agarose-KCl está contida em um recipiente raso e amplo.</li>
		<li>Mantê-los durante a noite em temperatura ambiente (RT) para a agarose definir e endurecer.</li>
		<li>Cuidadosamente Escave para fora as pontes de vidro de agarose-KCl-carregado do conjunto/endurecido agarose-sal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Armazenar as pontes<ol>
<li>Prepare-se volume suficiente (ou seja, 500 mL) da solução KCl 3M em uma todo o gargalo da garrafa.</li>
		<li>Armazene as pontes de sal-agarose preparadas o frasco no frigorífico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. a aplicação da força de cisalhamento do fluxo de fluido para células em uma câmara de Patch-aperto
Nota: Um diagrama esquemático da montagem da experiência da remendo-braçadeira é mostrado na Figura 1.
<ol><li>Lugar de um contêiner carregado com solução de banho (volume e altura já devem ser medidos) acima da câmara de remendo-braçadeira.</li>
	<li>Encha a câmara de remendo-braçadeira com a solução de banho por aspiração do tubo.</li>
	<li>Para parar o fluxo de fluido, cortar o tubo no lado do contêiner para bloquear o fluxo de fluido e, em seguida, cortar o tubo no lado da aspiração para parar a sucção ao mesmo tempo. Esta é a condição do controlo "estacionário".</li>
	<li>Para aplicar a força de cisalhamento do fluxo fluido, abra ambos os tubos dos lados do recipiente e sucção ao mesmo tempo.</li>
	<li>Antes ou depois de aplicar a força de cisalhamento do fluxo de fluido para a célula, medir a taxa de fluxo em mL/min.</li>
	<li>Calcule a taxa de fluxo, medindo-se a diminuição do volume de fluido ao longo de um determinado momento.</li>
	<li>Da taxa de fluxo medido e geometria (estrutura) da câmara de tomar banho, a força de cisalhamento aplicada à célula pelo fluxo do fluido deve ser estimada (consulte a seção de discussão).</li>
	<li>Como alternativa, para controlar a taxa de fluxo (para etapas 2.3-2.6), use uma bomba de perfusão. Neste caso, tenha cuidado para garantir uma constante, em vez de um fluxo pulsátil.</li>
</ol>3. medir mudanças no potencial de junção Metal líquido pelo fluxo de fluido entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl (Figura 3A)
<ol><li>Use o eletrodo de Ag/AgCl ou pellet, que está disponível a partir de produtos pré-fabricados, sem a ponte de sal de agarose.</li>
	<li>Prepare uma solução salina sal fisiológica normal para a câmara de banho (por exemplo, 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5mm HEPES, 0.5 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 11mm D-glicose; pH ajustado para 7,4 com NaOH).</li>
	<li>Coloque uma pipeta de patch, que contém uma solução de KCl 3M na câmara para minimizar a mudança de potencial de junção entre a pipeta e soluções de banho.</li>
	<li>Corrigir o amplificador de tensão-braçadeira para o atual modo de grampo ("eu = 0" ou "CC").</li>
	<li>Depois de anular o potencial de deslocamento inicial, medir as mudanças na tensão induzida por várias taxas de fluxo.</li>
	<li>Para verificar se as alterações na tensão são potenciais de junção do metal líquido, re-examine o efeito do fluxo de fluido sobre o potencial de junção usando a ponte de agarose-sal entre a solução do banho e o eletrodo de Ag/AgCl.</li>
</ol>4. experimental estimativa da concentração Real Cl– na camada Unstirred adjacente ao eletrodo de Ag/AgCl sob condição estática (Figura 3B)
<ol><li>Os resultados da etapa 3, desenhar as relações de taxa de fluxo de potencial de junção e estimar o valor máximo (saturação) do potencial mudança de junção pela taxa de fluxo de fluido supra.</li>
	<li>Preparar soluções com diferentes concentrações de Cl (i.e., 50, 99, 147, 195 e 288 mM de NaCl).</li>
	<li>Alterando o Cl– concentração no fluido balneares, desenhe a junção potencial [Cl–] relação. Note que a taxa de fluido deve ser constante e suficientemente alta (> 30 mL / min) para evitar a diminuição da concentração de Cl– , para que o eletrodo de referência Ag/AgCl adjacentes.</li>
	<li>De curvas de dois relação, estime as mudanças na concentração de Cl– a partir da mudança de potencial de junção medido.</li>
</ol>

<ol><li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li>
<li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li>
<li>Langille, B. L., O’Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li>
<li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li>
<li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+mechanically+activated+ion+channel%2C+is+required+for+vascular+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li>
<li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li>
<li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV4-mediated+endothelial+Ca2%2B+influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li>
<li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2%2B+channel+via+enhancement+of+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K%2B+current+by+convectively+restoring+%5BK%2B%5D+at+the+cell+membrane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585(2016).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes%3A+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li>
<li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2%2B+channel+activation+in+vascular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li>
<li>A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018).</li>
<li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium%3A+for+better+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste estudo, temos demonstrado um método para medir a concentração de Cl– real na camada unstirred adjacente para o eletrodo de referência Ag/AgCl, determinando a potencial de junção metal líquido com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta preenchida com um alto KCl concentração. A mudança na concentração de Cl– na camada limite pode resultar em uma mudança de potencial de junção quando mudar de estática para condições de fluxo de fluido. Simplesmente usar um ponte de KCl entre o eléctrodo de refe...

Fluxo de fluido é uma importante sinalização ambiental que controla muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como vasodilatação induzida pelo fluxo de fluido e fluido cisalhamento força dependente vascular remodelação e desenvolvimento1,2, 3,4,5. Embora os mecanismos moleculares para as respostas biológicas para força de cisalhamento do fluxo de fluido não são totalmente compreendidos, acredita-se que o fluido fluxo-mediada regulamento de retenção de canal de íon criticamente pode contribuir para respostas induzidas pelo fluxo fluido5 , 6 , 7 , 8. por exemplo, a ativação do retificador endotelial para dentro Kir2.1 e Ca2 +-ativado K+ (KCa2.3, KCNN3) canais depois de Ca2 + influxo pelo fluxo de fluido tem sido sugerido para contribuir ao fluido vasodilatação induzida pelo fluxo6,7,8. Portanto, muitos canais iônicos, canais especialmente ativado mecanicamente ou - inibidas, têm sido estudados em termos de sensibilidade de fluxo fluido/cisalhamento força com o remendo-braçadeira técnica6,9,10 , 11. no entanto, dependendo do protocolo experimental realizado durante a gravação da remendo-braçadeira, resultados e interpretação dos dados sobre o fluxo de fluido-regulamentos de canais iônicos podem ser errônea10,11.
Uma fonte de fluido induzida por fluxo artefatos em gravação de remendo-braçadeira é de potencial entre o fluido de banho e de eletrodo de referência Ag/AgCl11da junção. Geralmente acredita-se que a junção de metal líquido potencial entre o banho fluido e o eletrodo de Ag/AgCl é constante como a concentração de Cl– do banho líquido é mantida constante, considerando a resposta química entre a solução do banho e o eletrodo de Ag/AgCl para ser:
AG + Cl–↔ AgCl + elétron (e–) (equação 1)
No entanto, em um caso onde a reação global eletroquímica entre a solução do banho e eletrodo de referência Ag/AgCl (equação 1) procede da esquerda para a direita, a concentração de Cl– do banho fluido adjacente para o Ag/AgCl referência eletrodo (camada de limite unstirred12,13,14,15) pode ser muito menor do que a granel de banhar a solução, a não ser suficiente convecçao transporte é assegurada. Usar um eletrodo de Ag/AgCl velho ou não-ideal com cloração inadequada do Ag pode aumentar esse risco. Este artefato relacionados ao fluxo de fluido para o eletrodo de referência, na verdade, pode ser excluído, simplesmente colocando uma ponte de agarose-sal convencional entre o banho fluido e referência eletrodo, desde que o artefato é baseado em alterações na real Cl– concentração adjacente para o eletrodo de Ag/AgCl11. O protocolo apresentado neste estudo descreve como impedir que as alterações de potencial de junção de fluxo-relacionados e medir as concentrações de íon real na camada limite unstirred.
Depois de colocar um ponte de KCl entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl de agarose, há outro fator crucial que deve ser considerado: apenas como referência o eletrodo de Ag/AgCl atua como um eletrodo de Cl– , os canais iônicos também podem funcionar como um eletrodo íon-seletivo. A situação de uma camada de limite unstirred entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl surge durante o movimento de íons entre as soluções extracelulares e intracelulares através dos canais de íon de membrana. Isto implica que o cuidado deve ser usado quando interpretar o Regulamento do íon canais pelo fluxo de fluido. Conforme discutido no estudo anterior11, o movimento de íons através de uma solução em que se encontra um gradiente electroquímico pode ocorrer através de três mecanismos distintos: difusão e convecção, onde a difusão é o movimento de migração induzida pelo gradiente de concentração, a migração é o movimento impulsionado pelo gradiente elétrico e convecção é o movimento através de fluxo de fluido. Entre esses mecanismos de três transporte, modo convecção contribui mais para o movimento de íons11 (> 1.000 vezes maiores do que a difusão ou migração sob configurações do remendo-braçadeira habitual). Isto constitui a base teórica por potenciais entre o banho fluido e eletrodo de referência Ag/AgCl junção pode muito sob diferentes condições estáticas e fluxo de fluido11.
Conforme a hipótese acima proposta, alguns efeitos facilitatórios do fluxo do fluido no canal iônico atual podem ser inferidos a partir da restauração convectiva das concentrações do íon real adjacentes à entrada do canal, na superfície da membrana (camada de limite unstirred) 10. neste caso, os efeitos de induzida pelo fluxo de fluido em correntes do canal de íon simplesmente surgiram de eventos eletroquímicos, não do Regulamento de retenção de canal de íon. Uma ideia semelhante foi anteriormente sugerida por Barry e colegas12,13,14,15 com base em Considerações teóricas rigorosas e evidência experimental, também conhecida como a camada de unstirred ou efeito do número de transportes. Se alguns canais de íon tem suficiente condutância de canal único e bastante aberto-tempo para fornecer taxas de transporte suficiente através dos canais (um ritmo mais rápido transporte na membrana do que na superfície da membrana unstirred), um efeito de camada limite podem surgir . Assim, o transporte de convecção-dependente pode contribuir para as eventuais facilitações fluido fluxo-induzida do íon atual10,12,13,14,15.
Neste estudo, enfatizamos a importância de usar um ágar ou agarose sal-ponte enquanto estudava fluido fluxo-induzida pelo Regulamento das correntes de íon. Nós também fornecemos um método para medir concentrações de íon real na camada limite unstirred adjacente para os canais de íon da eletrodo e membrana da referência do Ag/AgCl. Além disso, a interpretação teórica do fluido modulação induzida pelo fluxo das correntes do canal de íon (ou seja, a hipótese de convecção ou camada unstirred transporte número efeito) pode fornecer informações valiosas para a concepção e interpretação de estudos sobre o cisalhamento força-regulamento de canais iônicos. De acordo com o efeito de número de transporte camada de limite unstirred, prevemos que as correntes de canal de iões através de todos os tipos de canais iônicos de membrana podem ser facilitadas pelo fluxo de fluido, independente de sua sensibilidade biológica à força de cisalhamento fluxo fluido, mas somente se os canais de íon tem suficiente condutância de canal único e aberto-tempo. Maiores densidades de corrente de canal de íon pode aumentar o efeito unstirred da camada limite na superfície da membrana celular.

<table><tbody><tr><td>Câmara de banho aberta RC-11</td><td>Warner instruments, EUA</td><td>W4 64-0307</td><td></td></tr><tr><td>Pellet de eletrodo Ag / AgCl</td><td>World Precision Instruments, EUA</td><td>EP1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-aldrich, EUA</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de grampo de tensão</td><td>HEKA, Alemanha</td><td>EPC8</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de grampo de tensão</td><td>Molecular Devices, EUA</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Bomba para líquidos</td><td>KNF Flodos, Suíça</td><td>FEM08</td><td></td></tr></tbody></table>

medição da concentração de íons na camada limite unstirred com pipeta aberto patch-clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Fluxo de fluido é um importante estímulo ambiental que controla muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como vasodilatação induzida pelo fluxo de fluido. Embora os mecanismos moleculares para as respostas biológicas para força de cisalhamento do fluxo fluido/não são totalmente compreendidos, fluido fluxo-mediada regulamento de retenção de canal de íon pode contribuir criticamente. Portanto, sensibilidade de força fluido fluxo/tesoura de canais iônicos tem sido estudada usando a técnica patch-clamp. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados e a interpretação dos dados podem ser errôneas. Aqui, apresentamos a evidência experimental e teórica para erros relacionados ao fluxo fluidos e fornecer métodos para estimar, prevenindo e corrigindo esses erros. Alterações na junção potencial entre o eletrodo de referência Ag/AgCl e banho líquido foram medidas com uma pipeta aberta cheia de 3 M KCl. escoamento de fluidos pode, em seguida, deslocar o mV de potencial de aproximadamente 7 junção metal líquido. Por outro lado, medindo-se a mudança de tensão induzida pelo fluxo de fluido, estimamos a concentração do íon na camada limite unstirred. Na condição estática, as concentrações de íon real adjacentes para a entrada do canal eletrodo ou íon da referência do Ag/AgCl na superfície da membrana celular podem chegar tão baixo como aproximadamente 30% do que na condição de fluxo. Colocando um agarose 3M ponte de KCl entre o eléctrodo de referência e fluido banho pode ter evitado este problema de deslocamento potencial de junção. No entanto, o efeito de camada unstirred adjacente à superfície da membrana celular não poderia ser fixado desta forma. Aqui, nós fornecemos um método para medir concentrações de íon real na camada limite unstirred com uma pipeta de remendo-braçadeira aberta, enfatizando a importância do uso de um sal de agarose-ponte enquanto estudava fluido Regulamento induzida pelo fluxo de correntes de íon. Portanto, esta nova abordagem, que leva em consideração a concentração real de íons na camada limite unstirred, pode fornecer uma visão útil no delineamento experimental e interpretação de dados relacionados ao regulamento de tensão de cisalhamento fluido de canais iônicos .

Toda célula dependentes de voltagem Ca L-tipo2 + canal (VDCCL) correntes foram gravadas nos rato enzimaticamente dispersos miócitos de arterial mesentérica, como descrito anteriormente,11. Os miócitos arteriais foram diálise com uma solução de pipeta Cs-rica sob a configuração de nistatina perfurado com solução de banho livre de cátion divalente, para facilitar o fluxo de corrente através de de11,VDCCL</...

Canais de íon Mechanosensitive muitas vezes são estudados em termos de sensibilidade de fluxo fluido/cisalhamento força com gravação de remendo-braçadeira. No entanto, dependendo do protocolo experimental, os resultados no fluxo fluidos-regulamentos de canais iônicos pode ser errôneo. Aqui, nós fornecemos métodos de prevenção e corrigir esses erros com uma base teórica.

Medição da concentração de íons na camada limite Unstirred com pipeta aberto Patch-Clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Este subal pode ajudar a responder a perguntas-chave na esfera eletrofisi fisiológica, como o fluxo de fluidos apenas nas regulamentações dos canais de íons. A principal vantagem desta técnica é que ela pode estimar a concentração real de íons na camada de limite não írparada da superfície da membrana para interpretação de dados relacionada à regulação do fluxo de fluidos dos canais de íons. Para iniciar este procedimento, dobre o tubo capilar de vidro disparado para formar uma forma de U.O diâmetro interno do capilar deve ser grande o suficiente para reduzir a resistência da série ao registrar grandes correntes de íons. Em seguida, dissolva três gramas de agarose em 100 mililitros de cloreto de potássio de três molares, e coloque-o em uma placa quente entre 90 e 100 graus Celsius. Em seguida, carregue a ponte com o cloreto de potássio, imergindo a ponte de vidro na solução.Mantenha-o durante a noite em temperatura ambiente para que a agarose afinada e endureça. No dia seguinte, desenterre cuidadosamente a ponte de vidro carregada de cloreto de potássio agarose do sal agarose endurecido. Guarde a ponte em uma garrafa de pescoço largo de cloreto de potássio de três molares na gelade

measurement-ion-concentration-unstirred-boundary-layer-with-open

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este destina-se como uma introdução para o patch clamp de gravação a partir de oócitos Xenopus laevis. Abrange vitelínico remoção da membrana, a formação de um selo gigaohm (gigaseal), ea conversão opcional do patch para a topologia de fora-out.

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Função das proteínas da membrana é regulada pela composição lipídica da membrana celular. Este artigo detalhes de vídeo-how para formar um remendo adesivo utilizando eletrodos bicamada, bem como a forma de utilizar os canais gramicidin como repórteres de propriedades da membrana alterada.

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Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Os transportadores nas membranas celulares permitem a segregação diferencial de íons através das membranas celulares ou camadas celulares e desempenham papéis cruciais durante a fisiologia, reparo e patologia dos tecidos. Descrevemos o microeletrodo de auto-referência íon-seletivo que permite a medição de fluxos de íons específicos em células e tecidos individuais in vivo.

Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Canais mechanosensitive bacterianas podem ser utilizados como transdutores mecanoelétrica em dispositivos biomoleculares. Bilayers de interface de gotículas (DIBs), de inspiração celulares blocos de construção para tais dispositivos, representam novas plataformas para incorporar e estimular canais mechanosensitive. Aqui, demonstramos um novo método baseado na micropipeta de formar DIB, permitindo que o estudo de canais mechanosensitive sob estimulação mecânica.

Método multifuncional, baseado em Micropipeta de Incorporação e estimulação do bacteriana Mechanosensitive canais iônicos em gotículas de interface Bicamadas

Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

Aqui, apresentamos um protocolo para a formação de bilayers do lipid usando um método de BICAMADA contato bolha. Uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico, segundo a qual uma monocamada é constituída na interface água-óleo. Duas pipetas são manipuladas para encaixar as bolhas para formar uma BICAMADA.

Experimentos de bicamada lipídica com contato bolha Bilayers para Patch-Clampers

Este protocolo detalha um método para medir diretamente a atividade do canal iônico em vesículas intracelulares usando um sistema manual de patch-clamp endolisossomal. Ilustramos o método que envolve o aumento dos endolisossomos e o isolamento manual dessas vesículas. Essa abordagem garante que os pesquisadores possam replicar e aplicar o procedimento com precisão.

Técnicas de Patch-Clamp para Análise de Vesícula Endolisossômica Única

Este manuscrito descreve como preparar gânglios da raiz dorsal intactos para gravações de patch clamp. Esta preparação mantém o microambiente para neurônios e células gliais satélites, evitando assim as alterações fenotípicas e funcionais observadas usando neurônios DRG dissociados.

Remendo Recordings Grampo na Intact gânglios das raízes dorsais de ratos adultos

Aprenda a medir concentrações iônicas na camada limite não agitada usando patch-clamp com pipeta aberta. Este método melhora a precisão no estudo de canais iônicos mecanossensíveis e dinâmica de fluidos.

Medição da concentração de íons na camada limite Unstirred com pipeta aberto Patch-Clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem (Vídeo) | JoVE Journal

Medição da concentração de íons na camada limite Unstirred com pipeta aberto Patch-Clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem

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