Visualizando o colapso do Cone de crescimento Axonal e primeiros efeitos β amiloide nos neurônios cultivados Mouse
30 de outubro de 2018
Aqui apresenta-se um protocolo para investigar os efeitos iniciais da amiloide-β (Aβ) no cérebro. Isto mostra que Aβ induz endocitose mediada por Clatrina e colapso dos cones de crescimento axonal. O protocolo é útil em estudar os efeitos iniciais de Aβ em cones de crescimento axonal e pode facilitar a prevenção da doença de Alzheimer.
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa da doença de Alzheimer, especialmente os primeiros eventos envolvidos no colapso do cone de crescimento. A principal vantagem dessa técnica é possibilitar visualizar e analisar cones de crescimento axonal imediatamente após o tratamento beta amiloide. Comece usando micro-tesouras para picar cortices cerebrais recém-isolados de camundongos embrionários no dia 14 em meio de cultura de neurônios sem antibióticos.
Recolher os tecidos e centrifugar os tecidos em 87G por três minutos. Após a centrifugação, remova o supernasce e adicione dois mililitros de 0,05% de trippsina à pelota. Incubar por 15 minutos a 37 graus Celsius e misturar tocando a cada cinco minutos.
Após 15 minutos, adicione quatro mililitros de médio A para neutralizar o trypsin e misture tocando. Em seguida, centrifugar os tecidos a 178 vezes G por três minutos. Depois de remover o supernante, adicione a solução inibidora de DNAse e de experimentação de soja e incuba por 15 minutos a 37 graus Celsius com a mistura a cada cinco minutos como antes.
Quando o tempo de incubação estiver decorrido, adicione quatro mililitros de A.Mix médio e centrífuga como antes. Depois de remover o supernaspe, adicione quatro mililitros de médio A e tritura os tecidos com uma pipeta Pasteur polida até que nenhum detrito seja observado. Em seguida, filtre os tecidos triturados com malha do tamanho de 70 mícrons.
Após a filtragem, conte as células com um hemótmetro e calcule a densidade celular. Pipeta 0,8 vezes 10 para a quarta célula em média A em cada poço de um slide de cultura de oito poços. Em seguida, incubar em uma atmosfera umidificada de 10% de CO2 a 37 graus Celsius.
Após quatro horas de cultivo, mude a cultura de meio para médio B.A pureza dos neurônios que utilizam este método é de aproximadamente 75% Inicie este ensaio com pelo menos uma semana de antecedência, abrindo um frasco fresco de um beta 42 de comprimento completo obtido comercialmente e dissolvendo o conteúdo em água estéril e destilada para uma concentração de 0,5 mililitro. Incubar a 37 graus Celsius durante sete dias para induzir agregação e toxicidade. Prepare alíquotas de A beta 1-42 agregadas e armazene a menos 80 graus Celsius até o uso.
No quarto dia da cultura neuronal, trate os poços com 100 microlitres de 0,5 micromolar agregado A beta 1-42 ou solução de veículo em média B por uma hora como demonstrado anteriormente. Após a hora de passar, remova o meio de cultura e fixe imediatamente os neurônios com 4% de paraformaldeído contendo 4% de sacarose em PBS por uma hora a 37 graus Celsius em uma placa quente. A fixação é mais importante, pois manter a forma dos cones de crescimento é fundamental para este protocolo.
Após a fixação, lave os neurônios três vezes com PBS. Em seguida, depois de remover a câmara, monte os neurônios com um meio de montagem aquoso. Seque o meio de montagem a quatro graus Celsius por dois a quatro dias.
Capture toda a área de cada poço com uma lente objetiva seca de 20X em um microscópio invertido. Capturar e analisar toda a área em cada poço é importante para evitar a subjetividade. Classifique os neurites mais longos de cada neurônio no estágio três ou quatro como axônios.
Cones de crescimento axonal que não têm lamellipodia ou possuem menos de três filopodias são considerados cones de crescimento em colapso. Um beta 1-42 oligômeros, mostrado aqui antes da incubação, agregado após sete dias de incubação a 37 graus Celsius. Após o tratamento com um beta 1-42 agregado, imunosmunhagem com um anticorpo para o oligômero tóxico de A beta mostra manchas positivas em vermelho em um beta 1-42 neurônios tratados, mas não neurônios tratados com veículos.
Os primeiros fenômenos induzidos pelo tratamento beta 1-42 foram analisados após quatro dias na cultura. Os axônios identificados foram confirmados como tal por imunostaining positivo para o marcador axonal tau-1 mostrado em imunostaining vermelho e negativo para o marcador dendrático, MAP-2, mostrado em verde. Após uma hora de tratamento veicular, cones de crescimento se espalharam lamellipodia e várias filopodia.
Estes foram identificados como cones de crescimento saudável. Por outro lado, uma hora de tratamento beta 1-42 levou a cones de crescimento encolhidos, que não desenvolveram lamellipodia ou filopodia. Estes foram identificados como cones de crescimento em colapso.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fixar as células com 4%PFA e 4% de sacarose a 37 graus Celsius para o meu-nor-idge este protocolo de fixação na melhor das hipóteses. Seguindo este protocolo, outro método como imagens de células vivas e transfecção genética pode ser realizado para responder a perguntas adicionais como quando e como os cones de crescimento do axônio são colapsados e como os cones de crescimento colapsados são recuperados.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo desenvolvido para avaliar os efeitos iniciais do amiloide-β (Aβ) sobre cones de crescimento axonais em neurônios. O estudo utiliza cortes cerebrais de camundongos embrionários, demonstrando que o Aβ induz a endocitose mediada por clatrina e leva ao colapso dos cones de crescimento. Esta pesquisa é fundamental para compreender os mecanismos iniciais que podem contribuir para a doença de Alzheimer.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa sobre Doença de Alzheimer
Antecedentes
- Aβ está implicado na patogênese da doença de Alzheimer, particularmente na degeneração neuronal.
- Compreender os efeitos de Aβ sobre os neurônios pode revelar informações essenciais sobre a progressão da doença de Alzheimer.
- O colapso dos cones de crescimento axonal é um evento inicial na lesão neuronal.
- O estudo fornece uma metodologia essencial para visualizar e analisar essas alterações em resposta a Aβ.
Objetivo do Estudo
- Investigar os mecanismos pelos quais o Aβ influencia os cones de crescimento axonal.
- Facilitar a compreensão dos eventos fisiopatológicos iniciais da doença de Alzheimer.
- Desenvolver um protocolo para observar os efeitos imediatos do Aβ na estrutura neuronal.
Métodos Utilizados
- O estudo utiliza uma plataforma de cultura celular com neurônios derivados dos córtices cerebrais de camundongos do dia embrionário 14.
- Após o isolamento, os neurônios são tratados com Aβ agregado para avaliar seu impacto nos cones de crescimento.
- Os passos principais incluem a preparação e a incubação de culturas neuronais, seguidas por fixação e imunomarcação para avaliar a morfologia dos cones de crescimento.
- O protocolo descreve os tempos críticos de incubação para agregação de Aβ e as cronologias de tratamento para culturas neuronais.
- As observações são realizadas por microscopia para classificar os cones de crescimento com base em características estruturais.
Resultados Principais
- O tratamento com Aβ resultou no colapso dos cones de crescimento, caracterizado pela ausência de lamelipódios e redução de filopódios.
- Os neurônios controle exibiram morfologia saudável dos cones de crescimento, contrastando significativamente com os tratados com Aβ.
- A imunomarcação confirmou a identidade axonal e os efeitos tóxicos do Aβ na estrutura neuronal.
- Os achados apoiam a hipótese de que o Aβ impacta negativamente o desenvolvimento neuronal em estágios iniciais.
Conclusões
- Este estudo demonstra um protocolo valioso para elucidar os efeitos do Aβ sobre os cones de crescimento axonais.
- A metodologia permite a exploração dos mecanismos de resposta neuronal ao tratamento com Aβ.
- Compreender essas alterações precoces nos cones de crescimento pode orientar estratégias para a prevenção e tratamento da doença de Alzheimer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a detecção precoce do colapso do cone de crescimento axonal induzido por amiloide-β, um evento mecanicista chave que precede a disfunção sináptica na doença de Alzheimer. Ao visualizar em tempo real a endocitose mediada por clatrina e a degeneração estrutural, ele auxilia na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos para doenças neurodegenerativas. A abordagem fornece um sistema relevante para a doença, útil na avaliação de intervenções terapêuticas destinadas a bloquear a toxicidade downstream do Aβ antes que se manifeste a deterioração cognitiva.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga a hipótese de que a endocitose induzida por Aβ promove o colapso do cone de crescimento, permitindo a validação de alvos mecanicistas.
- Valor Operacional: Utiliza imunomarcação para marcadores axonais (tau-1) e dendríticos (MAP-2) para confirmar a identidade neuronal e a especificidade fenotípica.
- Valor Preditivo: Demonstra que a inibição da endocitose previne a toxicidade do Aβ, oferecendo uma leitura semelhante a um biomarcador para o envolvimento da via.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Produz leituras morfológicas quantitativas (presença de lamelipódios/filopódios) para análise de alto conteúdo dos efeitos de compostos.
- Reprodutibilidade: Fixação padronizada com PFA 4% e sacarose preserva a estrutura do cone de crescimento, minimizando a variabilidade na pontuação baseada em imagens.
- Escalabilidade: Compatível com lâminas de cultura multi-poço, permitindo testes paralelos de agregados de Aβ e inibidores potenciais.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para a Doença: Modela a toxicidade inicial de oligômeros de Aβ em neurônios primários de camundongo, refletindo eventos fisiopatológicos anteriores ao comprometimento da memória.
- Continuidade Translacional: Relaciona a degeneração axonal à desorganização da rede neural, apoiando a lógica para intervenção precoce na DA.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Identifica a endocitose como um ponto farmacologicamente explorável anterior à neurodegeneração, orientando a seleção de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial do descobrimento, fornecendo informações mecanicistas após o engajamento do alvo, mas antes da triagem fenotípica em modelos de doenças complexas.
- Biologia da Descoberta: Permite o teste de hipóteses sobre vias de sinalização do Aβ por meio da visualização direta da dinâmica dos cones de crescimento.
- Triagem: Gera dados morfológicos padronizados e quantitativos adequados para miniaturização e automação de ensaios.
- Análises: Baseia-se na classificação baseada em microscopia dos estados dos cones de crescimento, permitindo comparação objetiva entre diferentes condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Permite avaliação alinhada a biomarcadores de compostos que inibem a endocitose ou resgatam o colapso do citoesqueleto.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo de oligômeros de Aβ e outras neurotoxinas em culturas primárias de neurônios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar a exposição ao Aβ a alterações citoesqueléticas definidas nos cones de crescimento.
- Valor Operacional: Fornece fluxos de trabalho padronizados de imagemagem dependentes de fixação, compatíveis com a infraestrutura existente em neurobiologia.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar ao identificar compostos que bloqueiam danos estruturais precoces induzidos pelo Aβ.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de terapêuticas que visam mecanismos pré-sinápticos na doença de Alzheimer.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura primária de neurônios, imunomarcação e microscopia de fluorescência.
- Depende do acesso a microscópios invertidos, hemocitômetros e câmaras de cultura ambiental (10% de CO2, 37°C).
- Necessita de protocolos padronizados de agregação de Aβ (incubação de 7 dias a 37°C) para garantir consistência dos oligômeros tóxicos.
- Envolve otimização conforme os níveis de pureza neuronal (~75% neste protocolo) e variabilidade potencial na morfologia dos cones de crescimento.
- Limita-se a ensaios de ponto final, a menos que combinado com imagem de células vivas, já que a fixação impede o rastreamento longitudinal.
