Name: Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a operar 48 cultivos paralelos de células CHO em microbioreatores para produção de anticorpos IgG1. Este protocolo automatizado permite controle de oxigênio dissolvido e pH, otimizando processos de biomanufatura.

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Os autores gostaria de agradecer Scott Lute pelo apoio analítico forneceram. Financiamento interno parcial e apoio para este trabalho foi fornecido pelo programa de caminho crítico CDER (CA. #1-13). Este projeto foi apoiado em parte por uma entrevista para o programa de participação de estágio/pesquisa no escritório de produtos de biotecnologia, U.S. Food e Drug Administration, administrado pelo Instituto de Oak Ridge para a ciência e a educação através de um acordo interinstitucional entre o departamento de energia dos EUA e a FDA.

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Aviso: Esta publicação reflecte as opiniões do autor e não deve ser interpretada para representar as opiniões ou políticas do FDA.

O sistema automatizado de biorreator micro a funcionar correctamente e com eficiência envolve a execução oportuna de múltiplas etapas automatizadas. Uma das partes mais importantes do funcionamento do sistema é o software de programação. Se houver algum erro ao escrever o programa, vai haver erros graves na experiência que pode resultar em alterações inesperadas no processo, estratégia, estratégia de amostragem ou qualidade do produto final que pode invalidar as conclusões do estudo de alimentação. Outro aspecto importante do funcionamento do sistema é para colocar e apertar a braçadeira corretamente para garantir adequada controle. A indicação mais comum que a placa foi reforçada desigualmente é variações inesperadas em fazer medições para navios, 1, 6, 7 e 12 (vasos de reator de canto). Geral instabilidade indica um afrouxamento de gaxetas para as linhas de entrada de gás nas placas de fixação. Esse cenário possa impedir atingindo o ponto de ajuste. Outra armadilha comum para evitar quando começar um experimento deixou as células sente-se muito tempo durante a etapa de inoculação, levando-os a resolver. O menos tempo que as células passam sentado, menos a possibilidade existe que progressivamente menor contagem de células de inóculo é adicionadas em ordem cronológica para os vasos de reator que podem induzir o viés significativo que inconscientemente prejudica resultados do estudo. É melhor inocular em vários estágios, ou seja, inocular cada estação cultura um após o outro com passos de pausa no meio, então as células não estão com a placa de inoculação por mais de 15 minutos.
Relativas à utilização do dia a dia, mantendo a esterilidade é vital. Embora o sistema está em uma câmara de segurança biológica, a esterilidade não é garantida devido ao movimento frequente dentro e fora do capô. Por conseguinte, tudo o que acontece no bairro deve ser pulverizado com 70% IPA. Em segundo lugar, é essencial garantir que espuma mínima ocorre durante a cultura; mídia pode obstruir gaseamento e esgotar as linhas, levando a danos da chapa de fixação e até mesmo componentes principais abaixo. Medidas preventivas adição antiespuma são fundamentais para qualquer projeto de programa de micro biorreator. No caso de uma espuma"para fora" seria benéfico para seguir os protocolo de limpeza fabricantes e pode evitar danos permanentes das placas de fixação. Alternativamente, a utilização de embarcações não-sparged pode ser benéfica para baixas densidades de célula ou quando executando no modo em lotes como superfície mais alta a relação volume permite eficiente oxigênio mesmo com a falta de um sparger. No entanto, os navios não-sparged não podem ser útil para culturas de células de alta densidade ou perfusão como o espaço é insuficiente para manter-se com as culturas de crescimento do consumo de oxigênio.
Existem inúmeras vantagens fornecidas pelo sistema microbioreactor, como permite múltiplas culturas controladas ser executado em paralelo em uma pequena escala, com maior controle do que agitar os frascos. 17 portanto, o sistema facilita a execução de estudos, faz, estudos de clone de alta taxa de transferência e de Transfeccao de triagem. Manipulação automatizada de líquido também reduz a variabilidade de analista-para-analista, minimizando simultaneamente trabalho tedioso e demorada por pessoal treinado. Embora existam várias vantagens para o sistema, existem várias desvantagens principais que devem ser consideradas. Primeiro, um volume de cultura de 15 mL limita significativamente no processo amostragem e material de colheita final e vários biorreatores alternativos em pequena escala (até 500 mL) recentemente se tornaram disponíveis. Um avanço recente no sistema é a integração do bioreator microescala automatizado com o analisador de BioProfile FLEX 2 de Nova Biomedical, que atenua o processo de amostragem em questão, reduzindo o volume de amostra para análise de densidade e nutriente celular . Benefícios podem incluir a configuração rápida e praticamente sem limpeza levando a economia operacional, no entanto, o custo das unidades descartáveis deve ser considerado para projetos de longo prazo, como pode ser mais caro comprar as unidades do que os sistemas convencionais reutilizáveis.
O método discutido neste artigo é principalmente adequado para cultura de células de modo em lote, mas pode ser modificado dependendo das necessidades do usuário. Cada estação de cultura tem controle independente de temperatura, enquanto fazer e pH podem ser variadas a nível dos vasos de reator individual. Sartório também oferece DoE software projetado especificamente para permitir que as experiências de planejamento para ser adaptado para o sistema micro biorreator. Estudos de grande escala DoE usando o novo software DoE fornecido pelo fabricante podem ajudar na mídia e complementar a otimização. Embora não usado aqui, o sistema microbioreactor permite também alimentados-grupo estudos. O sistema ainda não foi otimizado para culturas de células de perfusão. No entanto, tem havido estudos limitados e ensaios para imitar a operação de cultura de células de perfusão no sistema atual de biorreator micro. 26 , esse método pode ser modificado para imitar as culturas de perfusão de alta densidade por célula, fixando-se. Variando a altura a que a pipeta é inserida no reator e otimizando o tempo de assentamento, a mídia pode ser removida e reabastecida para modo de profusão de espelho da cultura. Existem novos produtos nesta área em desenvolvimento que pode funcionar melhor do que o sistema apresentado aqui se modo de perfusão da cultura é desejado.
Em resumo, este estudo demonstra o uso de microbiorreatores automatizados e associados analítico para operações de cultura de células CHO produzir e caracterizar um anticorpo Monoclonal IgG1 modelo. Enfatiza a dramatização do microbiorreatores em pequena escala na fabricação de Bioprocessos e seu impacto no desenvolvimento de cultura de células e análise de mídia. Embora haja muitas vantagens em usar um sistema automatizado de pequena escala, para realizar plenamente seus benefícios processam de entendimento e caracterização analítica é imperativa. Este estudo fornece o usuário com uma diretriz para o uso de um sistema de reator de microescala automatizado, que pode ser desenvolvido e aperfeiçoado por necessidades de investigação individual.

Anticorpos monoclonais (mAbs) foram os primeiros produzidos em células de hibridoma rato em 19751. Desde então, um aumento no desenvolvimento da produção de proteína recombinante tem tomado lugar de humanizar mAbs para aumento na vivo segurança e eficácia de3,2,4. A maioria dos processos de produção de proteína recombinante emprega células de ovário de Hamster chinês (CHO) para a facilidade com que podem ser adaptadas para meios livres de soro, a sua capacidade de produzir proteínas com modificações borne-translational similares àquele de um ser humano inato proteína e sua confiabilidade como anfitrião células5,6.
Demanda está crescendo para entregar produtos mais rapidamente e para maiores populações de pacientes com qualidade consistente. Além dos benefícios econômicos, o repertório de doenças tratadas por mAbs está aumentando, que agora inclui cancros7, complicações pós-transplante, artrite e doenças auto-imunes. Rendimentos médios para linhas de produção modernas mAb comerciais são tipicamente na faixa de 5-6 g/L e continuarem a subir5. Em parte, isso foi feito através de engenharia celular CHO e rastreio de linha de produção melhorada utilizando biorreatores de elevado-throughput8. No entanto, a maioria dos aumentos na produção de proteínas têm sido atribuídos para processar melhorias, incluindo avanços em otimização de mídia, as condições de cultura celular e reforçada alimentação estratégias7,9,10. Suplementação nutricional é essencial não só para o crescimento celular adequada, mas também para a produção eficiente de proteína de alta qualidade. Além disso, as células necessitam da adição estequiométrica de nutrientes específicos, que exigem compreensão adicional para alimentação estratégia otimização6,11. Métodos de otimização tradicionais incluem a titulação de componente individual de meios de comunicação e mídia misturando-se com projetos de mistura. No entanto, esses métodos são demorada, mão de obra intensiva e envolvem riscos associados com o erro humano12,13.
Estudos de otimização de mídia anteriormente invocado agitar frascos e biorreatores de 1-2 L, que podem ser proibitivamente caros em termos de matérias-primas e capital humano. Microplacas também têm sido utilizadas, mas estes métodos fornecem escalabilidade limitada. Além disso, isso ainda pode exigir várias execuções demoradas que introduzir variabilidade para lotes que obscurece a variabilidade CQA causada pela composição de mídia e alimentação estratégia14,15,16. Assim, a necessidade de biorreator paralelo altamente consistentes e de alta produtividade sistemas surgiu17,18,19,20.
Com a despesa significativa associada com a operação de biorreatores de escala banco tradicional (0,5-5 L), microbioreactors oferecer uma alternativa de redução de custos para avaliar a produção de biologicamente derivado de drogas. Biorreatores de tanque agitado 21 banco-escala são confiáveis e fornecem dados densos via sensoriais matrizes. Sistemas de controle de feedback permitem fácil fiscalização da operação. No entanto, a montagem, calibração, limpeza, custos trabalhistas, custos de substrato e requisitos de esterilização fazem banco-escala tanque agitado biorreactores caros e mão de obra intensiva para operar. Agitar frascos e placas de microtitulação remover alguns dos custos e problemas associados com maiores biorreatores de escala de trabalho, mas estas alternativas fornecem fraco controle sobre as condições de processamento e produzem dados de baixa densidade, frequentemente somente medições de ponto de extremidade. 22
Alternativamente, microbioreactors utilizar um pequeno volume de trabalho para fornecer uma abordagem de escala-para baixo a linha celular e desenvolvimento de processo upstream. A escala de microbioreactor experimentos pode diminuir significativamente o custo de funcionamento através de baixa utilização de poder, substrato, mão de obra, espaço e utilitários. 23 Microbioreactors são como agitar frascos em que eles são fáceis de manusear devido ao seu tamanho, mas eles mantêm as vantagens de biorreatores de escala banco tradicional através de seu controle de gabarito on-line de pH, temperatura, dissolvido, oxigênio e ácido/base consumo, bem como a sua saída de dados em tempo real de parâmetros de qualidade, incluindo a composição do gás. Microbioreactor escala permite a capacidade de rastreio de alto rendimento, que pode ser útil para seleção e processo de desenvolvimento de clone. 24
O biorreator de microescala avançado tem demonstrado ser uma ferramenta eficaz para a caracterização de processo CHO celular cultura e desenvolvimento18. Neste documento, um sistema automatizado de ambr15, consistindo de 48 microbioreactors em paralelo, que foram mostrados para ser comparável ao clássico agitou reatores tanque em escala estudos,25 foi usado de maneira análoga ao trabalho prévio que otimizado a mídia composição de uma linhagem de células CHO-DG44 produzindo um modelo quimérico IgG16. Os efeitos de condições variáveis de mídia sobre o crescimento e o título foram comparados e analisados. Neste trabalho foi apresentada uma orientação geral para executar o sistema de microbioreactor e análise de amostras de mídia bruta.

<table><tbody><tr><td>Linha celular CHO DG44</td><td>Invitrogen</td><td>A1100001</td><td></td></tr><tr><td>sistema de microbiorreator automatizado ambr 15 Micro biorreator</td> automatizado <td>Sartorius</td><td>001-2804</td><td>ambr</td></tr><tr><td>15 Cultura de células 24 biorreatores descartáveis - Sparged</td><td>Sartorius</td><td>001-2B80</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta descartáveis de 1 mL, esterilizadas</td><td>Sartorius</td><td>A-0040</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta descartável de 5 mL pontas, esterilizadas</td><td>Sartorius</td><td>A-0039</td><td></td></tr><tr><td>24 Placas de poço profundo</td><td>Sartorius</td><td>A-0038</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 1 poço</td><td>Sartorius</td><td>A-0068</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>contador de células automatizado</td></tr><tr><td>EX-CELL&nbsp; Antiespumante (irradiado com raios gama)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59920C-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD OptiCHO AGT Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1122205</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-005-CV</td><td></td></tr><tr><td>100X Penicilina/Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>125 mL F-Bottom Shake Frascos (Estéril, Ventilado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PBV12-5</td><td></td></tr><tr><td>Frascos giratórios de vidro de 125 mL</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>250 mL PP Tubos de centrífuga cônicos (estéreis)</td> <td>Nalgene (Thermo Scientific)</td> <td>376814</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>BioRad Laboratories, Inc.</td><td></td><td></td>1450103</tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BioProfile FLEX Analyzer</td><td>Nova Biomedical</td><td>49418</td><td>Analisador de Nutrientes</td></tr><tr><td>Octeto Vermelho 96</td><td>Pall Fort&eacute; Bio&nbsp;</td><td>99-0042</td><td>Biossensor de Proteína A</td></tr><tr><td>Biossensores de Mergulho e Leitura de Proteína</td><td>A Pall Fort&eacute; Bio&nbsp;</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de polipropileno de 96 poços, fundo em F, estilo chaminé, Greiner preto</td><td>Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr></tbody></table>

uso do elevado-throughput microbioreactor sistema automatizado para produção de igg1 modelo em células cho

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Biorreatores de microescala automatizado (15 mL) podem ser uma ferramenta útil para os engenheiros de cultura de células. Facilitam a execução simultânea de uma grande variedade de condições experimentais, minimizando o potencial variabilidade do processo. As aplicações desta abordagem incluem: clone rastreio, mudanças de temperatura e pH, otimização de mídia e suplemento. Além disso, os volumes de pequeno reator são conducentes à grande Design de experimentos que investigar uma ampla gama de condições. Isto permite que processos montante significativamente ser otimizadas antes de aumentar onde experimentação é mais limitada no escopo devido ao tempo e restrições econômicas. Os sistemas de biorreator microescala automatizados oferecem várias vantagens sobre o tradicional em pequena escala unidades de cultura celular, tais como frascos de agitar ou frascos de girador. No entanto, durante a escala piloto processo desenvolvimento significativo deve ter cuidado para garantir que estas vantagens sejam realizadas. Quando executado com cuidado, o sistema pode habilitar automação de nível elevada, podem ser programado para executar DOE com um maior número de variáveis e pode reduzir o tempo de amostragem quando integrado com um analisador de nutrientes ou contador de célula. Integração da heurística perito-derivado apresentada aqui, com experiências de biorreator de microescala automatizado atual pode minimizar armadilhas comuns que impedem a resultados significativos. Em casos extremos, a aderir aos princípios estabelecidos aqui pode provocar danos no equipamento que requer reparos caros. Além disso, os sistemas de microbioreactor têm volumes de pequena cultura, dificultando a caracterização das condições de cultura celular. O número e a quantidade de amostras colhidas em processo na cultura de modo lote é limitado como volumes operacionais não podem cair abaixo de 10 mL. Este método irá discutir os benefícios e as desvantagens dos sistemas de biorreator de microescala.

Monitoramento de parâmetros de processos críticos e outros parâmetros de cultura celular em toda operação de culturas de pilha é um aspecto importante em Bioprocessamento. O contador de célula e analisador de nutrientes foram usados para quantificar a cinco atributos que caracterizam o crescimento celular, consumo de nutrientes e formação do subproduto. A contagem de células foram obtidas diariamente para todas as condições de cultura. A densidade média de células viáveis e realidades são como visto na Figura 3 , juntamente com seu intervalo de ± 1 SD. Os perfis de nutriente e subproduto também são mostrados com o intervalo de ± 1 SD através da fase estacionária das culturas. A inclinação deste perfil representa as taxas médias de produção de lactato e consumo de glutamina e glicose. Em geral, estes resultados demonstram a viabilidade de monitoramento desses atributos no sistema microbioreactor; assim como a capacidade do sistema de microbioreactor para manter estes parâmetros dentro de uma faixa apertada.
A produtividade total das culturas de célula foi quantificada através de um sistema de biosensor proteinA depois que os meios de cultura de células colhidos foi passado através de um filtro PVDF 0,22 micron. A produtividade específica por célula variou de 0,87 pg/célula-d a 1,15 pg/célula-d como visto na Figura 4. Com base nesses resultados pode ser investigado um vasto leque de condições para selecionar a composição da mídia e alimentação estratégias que maximizam a quantidade de proteína produzida por um investimento mínimo em procedimentos experimentais.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig1.jpg"> Figura 1 : Layout do sistema de microbioreactor com 4 estações de cultura (CS) tendo 12 navios cada reactor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig2.jpg"> Figura 2 : Exemplo amostra placa set-up para uma quantificação básica com experiência de regeneração no sistema biosensor proteinA. linha 1 (vermelha "R") é reservada para amostra de referência (ou seja, a matriz ausente analito); linha 2 (aquamarine) é um conjunto de normas (concentrações estão em µ g/mL); linhas 3 e 4 (laranja) são conjuntos de controles positivos altos e baixos ("PL" e "PH", respectivamente); linhas de 5 a 10 (roxo) contêm amostras desconhecidas; linhas 11 e 12 (cinza) são as posições de programa-padrão para regeneração ("R") e buffers de neutralização ("N"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig3.jpg"> Figura 3 : um) média de perfis de densidade e viabilidade celular viável mais de um lote. ± 1 SD também é mostrado para indicar o controle apertado de crescimento celular em sistemas de microbioreactor. b) perfil nutriente médio de glicose e glutamina, bem como o perfil de subproduto média de lactato. ± 1 SD também é mostrado para indicar o controle apertado sobre composição de mídia em sistemas de microbioreactor. (N = 3, todas as condições foram executadas em triplicado). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig4.jpg"> Figura 4 : Caixa-enredo representativa da produtividade média específica, as diferentes situações de mídia. (N = 3, todas as condições foram executadas em triplicado) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

É apresentado um protocolo detalhado para a operação simultânea de 48 culturas de pilha paralela em variadas condições em um sistema de microbioreactor. Processo de cultura de células, colheita e análise de título de anticorpos subsequentes são descritos.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Este método pode ajudar a responder algumas das questões importantes no campo da fabricação de processos bios sobre aspectos da caracterização da linha celular e mediar e otimizar processos. As vantagens dessa técnica são que ela fornece maior controle em frascos de shake e permite a automação e o desempenho de um grande número de estudos em pequena escala para rápida geração de dados. Demonstrando o procedimento, Sai Rashmika Velugula e Casey Kohnhorst, pesquisadores do meu laboratório.Comece imergindo um estoque vil de três vezes 10 a o sétimo show células por mililitro de meio congelante em um banho de água de 37 graus Celsius. Quando apenas uma pequena lasca de gelo permanecer, incruste suavemente a suspensão celular rapidamente descongelada algumas vezes e transfira um mililitro de células para um frasco de shake ventilado de 125 mililitros contendo 29 mililitros do meio OptiCHO. Coloque o frasco em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 8%de CO2 com sacudindo-o 130 RPM.Subculturando as células após 72 horas em 100 mililitros de médio Celsius fresco de 37 graus Celsius em um frasco rotador de 125 mililitros para outra incubação de 72 horas a 37 graus Celsius e 8%DE CO2 com agitação a 70 RPM. No terceiro dia de subcultura, adicione um meio pré-aquecido fresco ao frasco rotador para manter as células em uma viabilidade de pelo menos 90% para uma última 24 horas de cultura. Na manhã seguinte, clique no ícone remoto da área de trabalho e clique em conectar.Quando a área de trabalho remota estiver conectada, abra o software do contador de células e instale um novo Reagent Pak. Em seguida, esvazie o lixo trypan azul e prime o sistema. Em seguida, minimize a conexão remota e abra o software do micro reator bio usando um experimento existente como modelo para criar um novo experimento.Antes de iniciar uma corrida, defina as placas usadas durante a execução na seção de imitação do software e coloque 12 vasos de cultura estéreis em cada estação de cultura. Coloque placas de fixação autoclavadas em cima dos vasos e coloque as placas de mexida em cima das placas de fixação certificando-se de que cada pino está inserido com segurança. Em seguida, fixe as placas de fixação com os parafusos e nobs fornecidos.Para iniciar o sistema, digitalize o código de barras fornecido com cada vaso cultural. O sistema inicializará e verificará a presença dos navios apropriados. Coloque o controle de temperatura em 37 graus Celsius e a agitação para 1.000 RPM e ligue o monitor PH de oxigênio dissolvido.Em seguida, execute o programa de carregamento médio. Quando todo o meio tiver sido carregado, 35 microliters de EX-CELL Antifoam serão adicionados da placa Antifoam aos vasos culturais. Após 30 minutos começar a registrar o oxigênio dissolvido e PH dentro dos meios de cultura, permitindo que o oxigênio dissolvido atinja um ponto de 50% após o equilíbrio de oxigênio dissolvido, ligue as adições de base de fundo para atingir um ponto de 7,1 PH para todos os vasos culturais.Na manhã seguinte, execute a etapa PH pausada e transfira todo o conteúdo do frasco rotador para um tubo cônico de 250 mililitros estéril para centrifugação. Resuspenque a pelota em meio fresco suficiente para que a densidade final seja de uma vez 10 a sexta células CHO por mililitro depois de adicionar o inóculo aos vasos de cultura e adicionar as células suspensas nos poços apropriados de uma placa de poço estéril de 24 poços. Adicione três mililitros de inóculo a cada poço e coloque a placa inóculo na mesa designada dentro do capô.Em seguida, deixe os vasos de cultura se equilibrarem por pelo menos uma hora e iniciem a etapa de contagem de cinco EX-CELL no programa. Para análise diária de nutrientes e metabólitos no segundo dia coloque as placas do suporte do tubo de amostra em seus decks designados e carregue tubos de microcentrifuuge abertos nos suportes apropriados. Em seguida, coloque as amostras na bandeja do analisador, para realizar a análise de nutrientes.Para terminar a corrida, desligue o controle de temperatura seguido da agitação. Pare o controle de PH de oxigênio dissolvido e as adições da base de fundo, todos os outros controles e o monitor do sistema. Desaparafusar o grampo e mexer as placas, remover os vasos de cultura e enroscar as placas de secagem na estação de cultura.Em seguida, execute o ciclo de secagem de duas horas no programa;clicando em parar no software bioreator uma vez que o ciclo de secagem tenha terminado. Para colher as células, transfira o fluido de cultura celular dos vasos do reator para tubos cônicos correspondentes para centrifugação e filtrar os supernantes através de filtros PVDH estéreis de 0,22 micrômetros. Em seguida, transfira um mililitro de cada cultura celular estéril supernacido em tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro para armazenamento negativo de 20 graus Celsius até a análise de titer.Para medir os títulos IgG das amostras, primeiro ligue o sistema biosensor de auxílio à proteína. Depois que a lâmpada tiver aquecido por pelo menos uma hora, permita que as amostras se equilibrem à temperatura ambiente e pré-ak uma ponta de auxílio proteico por amostra em meio de células frescas por pelo menos 30 minutos. Em seguida, coloque a temperatura da placa em 26 graus Celsius.Carregue as amostras no sistema e execute o ensaio usando o ensaio padrão de alta sensibilidade com regeneração no software de aquisição de dados. Utilizando o contador celular integrado, as densidades e viabilidades celulares viáveis médias podem ser obtidas diariamente para todas as condições culturais. Utilizando o analisador de nutrientes também podemos obter os perfis de nutrientes e subprodutos demonstrando a viabilidade de monitorar esses atributos no sistema de reator microbio.Além disso, a produtividade total das culturas celulares sob as várias condições culturais de interesse pode ser quantificada usando o sistema biosensor de auxílio proteico, como demonstrado. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que o protocolo só funciona se a programação for feita corretamente;garantindo a execução oportuna das etapas do protocolo com erros mínimos. Seguindo este procedimento, outros métodos como: cromatografia líquida, espectrometria de massa e dispersão de luz multi-ângulos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as propriedades físicas e químicas do produto fabricado.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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