Name: No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a rastrear timócitos em tempo real usando microscopia confocal em implantes timicos no olho de camundongos. Este método permite monitorar recrutamento de progenitores e egressão de células T maduras longitudinalmente.

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Este trabalho foi financiado por doações de NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) e R21ES025673 (AC) e pela concessão melhor/2015/043 (Consellería de Educació, cultura eu esport, Generalitat valenciana, Valência, Espanha) (EO). Autores agradecer a equipe enviada na Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valência, Espanha e Alberto Hernandez no Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valência, Espanha, por sua ajuda com filmagem e edição de vídeo.

O cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Miami aprovaram todos os experimentos de acordo com as diretrizes IACUC.
1. isolamento e corte de recém-nascido Thymi
<ol><li>Prepare todos os reagentes e instrumentos por autoclavagem ou outros métodos, garantindo condições estéreis.</li>
	<li>Para minimizar as contaminações, execute todos os procedimentos cirúrgicos sob uma capa de fluxo laminar.</li>
	<li>Antes da eutanásia ratos doador, encha um prato estéril de 60 mm com estéril prechilled 1x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) e coloque-o no gelo. Ele irá ser usado para enxaguar e armazenar o thymi extirpado de ratos doador antes do transplante.</li>
	<li>Proceda à eutanásia de ratos recém-nascido doador por decapitação, em conformidade com as diretrizes éticas.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre toalhas de papel absorvente estéril em uma posição ereta dorsal e spray e depois limpe, o abdômen de rato com etanol a 70%.</li>
	<li>Expor a cavidade torácica, tornando-se uma incisão em forma de V superficial ao nível da parte inferior do abdome e cortar a pele com um par de reta 10cm dissecando a tesoura seguindo uma linha mediana ventral para deixar uma abertura de cerca de 0,5-1 cm no nível do peito. Dobre a pele ao longo de cada lado do peito para expor a cavidade torácica.</li>
	<li>Faça dois mais profunda 0,5-1 cm incisões laterais através do diafragma e caixa torácica com o mesmo tipo de tesoura para acessar o mediastino superior na cavidade torácica anterior. O Timo deve aparecer como dois lóbulos pálidos bem acima do coração.</li>
	<li>Coloque um conjunto de pinças curvas debaixo do Timo e puxar verticalmente para extrair os órgãos completa. Evitar a foldback da caixa torácica com um par de pinças. Se necessário, use a pinça fina cuidadosamente em pedaços o tecido conjuntivo em torno do órgão sem interromper a cápsula antes de extrair o órgão. Nota: Este passo é facilitado por meio de um escopo de dissecação.</li>
	<li>Mergulhe o Timo isolado no frio estéril 1X PBS (pH 7,4) anteriormente exibidos em um prato de estéril de 60 mm e cortar o istmo conjuntivo com um bisturi para separar os lóbulos tímicos. Remova todos os restos do prato sem prejudicar a cápsula. Para minimizar o tempo thymi são expostos, aparar lóbulos de tomilho antes do implante. Nota: Cada isolado Timo recém-nascido normalmente processará seis segmentos de cerca de 1 mm de largura para um máximo de três ratos do anfitrião ao receber implantes em ambos os olhos.</li>
	<li>Repita as etapas de 1,4-1,9 para cada rato do doador. Para minimizar o tempo thymi são expostos, isole um timo de cada vez.</li>
</ol>2. Timo implantação em Câmara Anterior do olho
<ol><li>Antes do transplante, tag e pesar cada destinatário do mouse.</li>
	<li>Use uma dose entre 1-2% dos vapores isofluorano para anestesiar o destinatário do mouse. Assegure a adequada anesthetization pela ausência de reflexo seguinte pitada de dedo do pé antes de iniciar o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Prosseguir com o transplante de Timo segmentos como segue:<ol>
<li>Posicione o mouse em uma posição reclinada lateral de lado para que um olho é virado para cima exposto diretamente para a lente do escopo dissecação.</li>
		<li>Um dos lóbulos tímicos isolados mentindo na frio 1X PBS (pH 7,4) impostos especiais de consumo-encheu o prato de 60 mm em pedaços com até 1 mm de largura para implante. Seguem um padrão zig-zag para garantir que cada segmento contém tímico córtex e medula. Use tesoura vannas para o aparamento de acordo com as orientações fornecidas na figura 1A. Nota: A remoção do Timo deve ser feita antes do implante para otimizar a enxertia de tecido.</li>
		<li>Começando na base da córnea correspondente à área cirúrgica, introduza a ponta de uma agulha de 40mm G18 tornar-se uma pequena incisão em camadas externas córnea para que a ponta de uma tesoura a dissecação pode ser introduzida.</li>
		<li>Fazer um 5-10 mm flanco incisão diretamente ao redor da base da córnea usando tesoura vannas, mantendo a abertura da córnea firmemente para impedir que efectuou. Use pinça com as extremidades planas para evitar danos aos tecidos.</li>
		<li>Segure o epitélio corneano corte e expor a abertura mantendo a córnea com um par de pinças de cerdas chatas, enquanto empurrando um segmento do Timo através da abertura. Molhe o olho com estéril 1X PBS (pH 7,4) ou lágrimas artificiais como necessário para evitar a dessecação do tecido até a manipulação está completa.</li>
		<li>Pressione suavemente na superfície do olho para deslizar o segmento de tecido introduzido para uma posição lateral em relação ao aluno a preservar a função eye´s. Garantir que o enxerto se encontra em uma posição oposta do olho abertura para impedir a interferência posterior com imagem latente, trote.</li>
		<li>Com o auxílio de pinça plana, pressione com firmeza, para aproximadamente 3-5 s, os dois lados da abertura da córnea uns contra os outros para promover Auto-selante. A cirurgia não requer qualquer grampeamento ou costura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se os transplantes são realizados em ambos os olhos, vire o mouse do lado lateral oposto diretamente expor o segundo olho para a lente do microscópio dissecação e repita etapas 2.3.2-2.3.7.</li>
	<li>Após a cirurgia está concluída, retorne o mouse para uma gaiola vazia pré-aquecido com uma lâmpada de calor.</li>
	<li>Certifique-se de que cada rato transplantado recupera a mobilidade completa e consciência antes de colocá-lo em uma gaiola, compartilhada com outros animais. Isto normalmente ocorre dentro de 1h após a cirurgia.</li>
	<li>Após transplante, tratar os ratos com analgésicos conforme necessário e fornecer os ratos com paracetamol em uma concentração de 1,6 mg/mL na água potável.</li>
	<li>Repita as etapas 2.2-2,9 para cada destinatário do mouse.</li>
	<li>Monitor de atividade animal no pós-operatório, bem como a aparência dos olhos implantados para detectar possíveis complicações de saúde.</li>
</ol>3. confocal Imaging de Thymi implantado usando 3D único fóton fluorescência microscopia Confocal
<ol><li>Anestesia o mouse destinatário usando uma dose entre 1-2% dos vapores isofluorano. Assegurar a adequada anesthetization pela ausência de reflexo seguinte pitada de dedo do pé antes de iniciar o procedimento de imagem</li>
	<li>Posicione o mouse na plataforma de microscópio palco fixo em uma posição reclinada lateral de lado para que um olho é virado para cima. Uma almofada de calor é colocada na plataforma do microscópio para assegurar a temperatura corporal constante de ratos durante as gravações. Nota: Consulte complementar Figura 1 para obter detalhes.</li>
	<li>Insira a cabeça do rato um headholder estereotáxica e ajuste o botão para conter a cabeça de rato em uma posição lateral lado permitindo o acesso directo do objectivo microscópio de olhos segurando o enxerto do timo.</li>
	<li>Coloque o focinho de rato em uma máscara de gás para manter o animal anestesiado durante todo o processo. Isto permite a regulagem de vapores isofluorano conforme necessário.</li>
	<li>Para facilitar a estabilização do olho durante as gravações, evitando a retração das pálpebras, puxe para trás as pálpebras, mantendo o olho à margem da córnea com um par de pinças que têm suas dicas cobertas por um tubo de polietileno, que estão ligados a um UST-2 sólida junção universal. Esta disposição permite uma fixação firme da cabeça e do olho e fornece flexibilidade sem interrupção do fluxo de sangue no olho, como descrito anteriormente,22. Nota: Complementar figuras 1B, C mostrar o conjunto completo.</li>
	<li>Adicione algumas gotas de lágrimas artificiais ou Salinas estéril como o líquido de imersão entre a córnea e a lente, antes de colocar o objetivo do microscópio no olho do rato. Nota: gotas adicionais são dispensadas na necessidade durante todo o procedimento para manter o caminho de microscópio e impedir a secagem do olho.</li>
	<li>Primeiro use lente de baixa ampliação (5x) para localizar o Timo no campo do microscópio. Em seguida, alternar para imersão de água mais alta resolução (10, 20 e 40 X) mergulhando objectivos com longa distância de trabalho. Evite LSM Fotodano e branqueamento do implante do timo, aplicando o poder do laser mínima e reduzir o tempo de digitalização tanto quanto possível. Isto é conseguido usando o scanner de ressonância do microscópio. Nota: O microscópio confocal que usamos é equipado com espelhos de varredura ressonantes capazes de recolher imagens em 25 frames/s. Outras marcas têm seus próprios microscópios com scanners de ressonância.</li>
	<li>Selecione o modo de aquisição, utilizando o software do microscópio e iniciar o modo de scanner ressonante. Em seguida, escolher o modo de imagem XYZT e configurar as configurações de aquisição como segue:<ol>
<li>Ligar o laser de argônio e ajustar o poder de 30% para a excitação da fluorescência.</li>
		<li>Escolha uma linha de laser de excitação e definir o controle de splitter (AOBS) feixe óptico-acústico para comprimentos de onda de emissão diferentes. Além disso, para detectar retroespalhamento e delinear a estrutura do tecido, use a detecção de reflexão simultaneamente. Nota: Ao selecionar um conjunto de cores para a excitação (GFP e RFP), o AOBS é automaticamente programado para direcionar estas linhas de excitação para o espécime e transmitir a emissão entre eles. Por exemplo, para as boas práticas agrícolas e RFP, usamos bandas estreitas de reflexão para luz de excitação em 488 nm e 561 nm, respectivamente. Isto deixa grandes bandas para a coleção de fótons fluorescência emitida, reduzindo assim a necessidade de tempo de poder e aquisição do laser. No modo de reflexão, o AOBS é usado como um divisor de feixe 50/50 para luz refletida em qualquer comprimento de onda longe aqueles utilizados para a detecção de emissão de fluorescência da imagem.</li>
		<li>Coletar a emissão no comprimento de onda selecionado, em seguida, selecione uma resolução de 512 × 512 pixels e começar ao vivo de imagem pressionando o botão Live , ajustando os níveis de ganho, conforme necessário (ganho típico é de cerca de 600 V).</li>
		<li>Definir o início e fim da z-pilha, centrando-se no topo do implante do Timo e selecione Iniciare, em seguida, mover para o último avião que pode ser focado no timo implantado e selecione final. Use um tamanho de passo-z de 5 µm. O software automaticamente irá calcular o número de aviões confocal.</li>
		<li>Escolher o intervalo de tempo para aquisição de cada pilha-z (normalmente 1,5 a 2 segundos) e selecione a opção de adquirir, até que parou para a imagem latente contínua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pressione o botão Iniciar para inicializar.</li>
	<li>Imagem os enxertos repetidamente em momentos diferentes do mesmo animal, repetindo as etapas 3.1-3.9. Nota: Se o animal possui enxertos em ambos os olhos, gravações do olho também podem ser tomadas por repetir passos 3.2-3.9 após a mudança do lado da posição ereta da cabeça do rato.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Devido a importância do processo de maturação de células T de competência imunológica individual4 e o presumível impacto da dinâmica de célula precursora na T-células maduras, produzidas pela Timo2,3, grandes esforços foram investidos desenvolver alternativas para a abordagem de instantâneo clássico tecido fixo.
Apesar de fatias de tecido e outros explantes são claramente superiores em reproduzir a arquitetura d...

Diferenciação de células T intratímica e seleção de subpopulação de células T constituem processos-chave para o desenvolvimento e a manutenção da imunidade mediada por células de vertebrados1. Esse processo envolve uma sequência complexa de eventos firmemente organizados, incluindo o recrutamento de progenitores da corrente sanguínea, migração e proliferação celular, expressão diferencial de proteínas de membrana e morte celular programada maciça para subconjuntos seleção. O resultado é a liberação de T-células maduras reativas para um amplo espectro de antígenos estranhos ao exibir respostas minimizadas para autopeptídeos, que acabar-se colonizar os órgãos linfoides secundários do individual2,3. Seleção de timócitos aberrante do repertório αβTCR leva à doença auto-imune ou desequilíbrio imune4 que derivam principalmente de defeitos durante os processos de seleção de precursor negativo ou positivo, respectivamente.
Migração direcional de timócitos através do timo é intrínseca a todas as fases de maturação de células T e é previsto como uma série de simultânea ou sequencial a vários estímulos, incluindo quimiocinas, adesivas, e adesivo de matriz extracelular (ECM) 3,de interações proteína5. O estudo dos tecidos fixos tornou a informação crítica sobre os padrões de expressão de pistas migratórias de timócitos no microambiente tímico definidos5,6, enquanto estudos ex vivo revelou dois prevalente comportamentos migratórios de timócitos em duas áreas histologicamente distintas do órgão: lento movimentos estocásticos no córtex e motilidade rápida, confinada na medula7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. aumento taxas migratórias correlacionam com selecção positiva do Timo13 e seleção negativa é associada com o comportamento de rastreamento apoiam a hipótese de que a cinética da viagem através do Timo determina o próprio maturação dos timócitos. Apesar de sua relevância, a topologia de interações de células estromais de timócitos e a dinâmica da motilidade de timócitos em microambiente do órgão durante a maturação de células T continua mal definida.
A maioria dos ex vivo estudos realizados até à data incluem fetais ou reaggregate órgão tímico culturas14,15, fatias de tecido ou explantes lóbulo tímico intacta, onde os movimentos de timócitos são visualizados por varredura a laser de dois fotões microscopia (TPLSM)8, uma técnica de imagem intravital com um máximo restrito trabalhando a distância e profundidade de 1 mm de acordo com o tecido de imagem examinou16. Em contraste com as culturas de laborioso órgão do Timo que dependem de tempos de incubação prolongado para formar estruturas de 3D, ambos, a técnica de fatia do Timo e a introdução de autorização controlada de abordagem lóbulo tímico intacta de subconjuntos específicos de pre-rotulado timócitos em um ambiente de arquitetura do tecido nativo. No entanto, desde que o fluxo sanguíneo é ausente nestes modelos, eles são claramente limitados para estudar o processo de recrutamento de Timo resolução progenitores (TSPs) para o parênquima do timo ou a dinâmica de egression do timo de células T maduras.
Modelos in vivo para o estudo da fisiologia de maturação de células T do timo em ratos incluem os enxertos de fragmentos ou lóbulos de todo órgão colocados tanto no interior do rim cápsula17 ou18por via intradérmica. Embora essas opções mostraram sua utilidade para interrogar a enxertia funcional sistêmica do tecido, a posição dos enxertos tímicos profundamente dentro do animal ou cobertos por camadas de tecido opaco restringe seu uso para exame na vivo de implantes pela TPLSM.
Câmara anterior do olho fornece um espaço facilmente acessível para monitoramento direto de qualquer tecido enxertado em virtude da transparência das camadas da córnea. De vantagem, a base da câmara formada pela íris é rica em vasos sanguíneos e terminações nervosas autonômicas, permitindo rápida revascularização e reinervação dos enxertos19,20. Dr. Caicedo tem utilizado com sucesso este espaço anatômico para a manutenção e o estudo longitudinal de ilhotas pancreáticas nos últimos21. Aqui, nós mostramos que esta estratégia não só constitui uma abordagem válida para estudar a dinâmica dos timócitos dentro da estrutura do órgão nativo, mas também excepcionalmente permite estender o na vivo gravações longitudinais para o estudo do recrutamento de progenitor e egression de células T madura passos em mouse.

<table><tbody><tr><td>Vaporizador de isofluorano com isofluorano</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>VetFlo-1215</td><td></td></tr><tr><td>Escopo de dissecação com fonte de luz</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecção fina</td><td>WPI</td><td>500455</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecção média</td><td>WPI</td><td>501252</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação fina de ponta curva</td><td>WPI</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Vannas</td><td>WPI</td><td>503371</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>WPI</td><td>503243</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>WPI</td><td>500353</td><td></td></tr><tr><td>40 mm Agulhas 18G</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência descartável</td><td>Thermofisher</td><td>201C</td><td></td></tr><tr><td>Almofada térmica e lâmpada de calor</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>Infravermelho</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>VWR</td><td>83.813.360</td><td></td></tr><tr><td>Prato estéril de 60 mm</td><td>SIGMA</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 1x PBS pH(7,4)</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes estéreis</td><td>Kimberly-Clark</td><td>LD004</td><td></td></tr><tr><td>Medicamentos para o controle da dor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3035-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina ou Viscotears</td><td>Novartis</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>MZ FLIII</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de fixação da cabeça</td><td>Narishige</td><td>SG-4N-S</td><td></td></tr><tr><td>Máscara de gás</td><td>Narishige</td><td>GM-4_S</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de fluxo laminar</td><td>Telstar</td><td>BIO IIA</td><td></td></tr></tbody></table>

no vivo controle de timócitos na câmara anterior do olho a laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

O objetivo do método a ser apresentado é para mostrar, pela primeira vez, o transplante de recém-nascido thymi na câmara anterior do olho do isogénicas ratos adultos na vivo longitudinal monitoramento em tempo real da dinâmica de thymocytes´ dentro de um vascularizado segmento de timo. Após o transplante, laser, microscopia (LSM) através da córnea permite na vivo não invasiva imagens repetidas no nível celular resolução. Importante, a adiciona a maturação de células T intravital anterior modelos de imagem a possibilidade de recrutamento de células progenitoras contínua e gravações de egresso de células T maduras no mesmo animal. Vantagens adicionais do sistema são a transparência da área enxertada, permitindo monitoramento rápido macroscópico do tecido implantado, e a acessibilidade ao implante permitindo localizadas além de tratamentos sistémicos. A principal limitação, sendo o volume do tecido que se encaixa no espaço reduzido da câmara do olho que exige para o aparamento de lobo. Integridade do órgão é maximizada dissecando lobos do timo em padrões mostrados anteriormente para ser funcional para a produção de células T madura. A técnica é potencialmente adequada para interrogar um meio de clinicamente relevantes questões relacionadas com a função do Timo que incluem auto-imunidade, imunodeficiência e tolerância central; processos que permanecem mecanicamente mal definidos. A dissecação bem dos mecanismos orientadores timócitos migração, diferenciação e seleção deve levar a novas estratégias terapêuticas, visando o desenvolvimento de células T.

Timo de camundongos recém-nascidos foram isoladas a partir B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas ratos, conforme descrito no presente protocolo (etapas 1,1-1,9). Nestes ratos transgénicos, o promotor do frango beta actina direciona a expressão da variante da proteína fluorescente vermelha DsRed. MST sob a influência do realçador início imediato citomegalovírus (CMV), facilitando o rastreamento dos implantes.
Para evitar re...

O objetivo do protocolo é mostrar longitudinal intravital acompanhamento em tempo real de timócitos por laser, microscopia em implantes do timo na câmara anterior do olho do rato. A transparência da córnea e vascularização do enxerto permitem gravar continuamente recrutamento de células progenitoras e egresso de células T maduro.

No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da imunologia sobre os mecanismos de autoimunidade, imunodeficiência, tolerância central e involução de timo. A principal vantagem dessa técnica é que permite o registro longitudinal in vivo do recrutamento progenitor e a egressão madura de células T nos segmentos de timo de camundongos vascularizados e enxertados. Embora este método possa fornecer uma visão sobre o desenvolvimento e a função do timo, também pode ser aplicado a outros tecidos, como ilhotas pancreáticas ou glomeruli renal.Para isolar o timo, coloque o rato em toalhas de papel absorvente estéreis na posição dorsal vertical em um capô de fluxo laminar e pulverize e limpe o abdômen do rato com 70% de etanol. Faça uma incisão superficial em forma de V no abdômen inferior para expor a cavidade torácica e use um par de tesouras dissecando 10 centímetros em linha reta para fazer uma incisão de 0,5 a um centímetro no peito ao longo da linha média ventral. Dobre a pele sobre cada lado do peito para expor a cavidade torácica e faça duas incisões laterais adicionais de 0,5 a um centímetro através do diafragma e da caixa torácica para acessar o mediastino superior na cavidade torácica anterior.O timo deve aparecer como dois lóbulos pálidos bem acima do coração. Coloque as pontas de força curvas sob o timo e puxe verticalmente para extrair o órgão completo, impedindo a dobra traseira da caixa torácica com um par de fórceps retos. Em seguida, submergir o timo isolado em um prato estéril de 60 mililitros contendo PBS estéril frio no gelo e usar um bisturi para cortar o istmo conjuntivo para separar os lóbulos timímicos.Antes do transplante, marque e pese cada rato receptor e coloque o primeiro animal em uma posição lateral lateral recumbent com um olho diretamente exposto à lente de um microscópio dissecando. Usando uma tesoura Vannas, extireta um dos lobos timímicos isolados de até um milímetro de largura seguindo um padrão em ziguezague para garantir que cada segmento contenha algum córtex timiático e tecido medulla. É fundamental aparar o timo antes da implantação, pois peças grandes podem não ser maltratadas corretamente.Em seguida, a partir da base da córnea da área cirúrgica, use a ponta de uma agulha de calibre 18 de 40 milímetros para fazer uma pequena incisão em camadas externas de córnea para que a ponta de um par de tesouras dissecando possa ser introduzida. Use a tesoura para fazer uma incisão flanco de 5 a 10 milímetros diretamente ao redor da base da córnea enquanto usa fórceps de ponta plana para manter firmemente a córnea aberta para evitar o resealing. Agarrando o epitélio córnea cortado com as fórceps de ponta plana, mantenha a abertura na córnea ao inserir um segmento timêmico através da abertura.É importante inserir a peça de timo rapidamente através da abertura da córnea para evitar o resealing espontâneo antes do tecido ser introduzido. Tenha cuidado para preservar a integridade do tecido nesta etapa. Pressione suavemente na superfície dos olhos para deslizar o segmento de tecido introduzido para uma posição lateral em relação à pupila para preservar a função do olho.E use fórceps planos para pressionar ambos os lados da abertura da córnea firmemente um contra o outro por três a cinco segundos para promover a auto-vedação. Se o transplante for realizado em ambos os olhos, vire o rato para o lado lateral oposto para uma segunda implantação como apenas demonstrado. Quando a cirurgia estiver completa, devolva o rato a uma gaiola vazia pré-aquecida com uma lâmpada de calor com monitoramento até a recumbência total.No ponto de tempo experimental apropriado, coloque um mouse receptor anestesiado em uma plataforma de microscópio de estágio fixo em uma posição lateral lateral reclinável em uma almofada de calor com um olho voltado para cima. E insira a cabeça do mouse em um suporte de cabeça estereotaxic. Ajuste o botão para conter a cabeça do rato na posição lateral lateral para permitir o acesso direto do objetivo do microscópio ao olho segurando o enxerto de timo e puxe as pálpebras enquanto segura o olho na margem da córnea com um par de pontas de pinça cobertas por um tubo de polietileno ligado a uma articulação universal sólida UST-2.Adicione algumas gotas de soro fisiológico estéril ou lágrimas artificiais entre a córnea e a lente antes de colocar o objetivo do microscópio 5X no olho do mouse e localizar o timo no campo do microscópio. Em seguida, mude para um objetivo de imersão de água de maior resolução com uma longa distância de trabalho e selecione o modo de aquisição no software de microscópio. Inicie o modo de scanner de ressonância e selecione o modo de imagem XYZT.Ligue o laser de argônio e ajuste a potência para 30% para excitação de fluorescência. Selecione uma linha laser de excitação apropriada e defina o controle do divisor de feixes óptico para os comprimentos de onda de emissão apropriados usando a detecção de reflexão simultaneamente para detectar backscatter e delinear a estrutura tecidual. Colete a emissão no comprimento de onda selecionado e defina uma resolução de 512 por 512 pixels.Em seguida, clique ao vivo para iniciar a imagem, ajustando os níveis de ganho conforme necessário. Concentre-se na parte superior do implante timiço e selecione começar a definir o início da pilha Z. Em seguida, concentre-se no último plano no timo implantado que pode ser visualizado e selecione a extremidade para definir a extremidade da pilha Z usando um tamanho de passo Z de cinco micrômetros.Defina o intervalo de tempo para a aquisição de cada pilha Z por 1,5 a dois segundos e selecione a opção de aquisição até o intervalo para imagens contínuas. Em seguida, clique em iniciar a gravação. Aqui, imagens de campo brilhante e fluorescência da mesma área do implante de timo que pode servir para um duplo acompanhamento macroscópico do crescimento tecidual e estudos de involução e continuação são mostrados.A imagem de campo brilhante também facilita a visualização da vascularização do tecido implantado, permitindo o estudo único da dependência da fisiologia do timo no suprimento de sangue ao longo do tempo. Este modelo permite a visualização da transmigração celular da torrente sanguínea para o timo implantado, o rastreamento dos contatos entre as células progenitoras GFP-positivas que entram no implante timiço com epiteliais e células estrômicas residentes rotuladas pela RFP durante processos de diferenciação e seleção, bem como o monitoramento das células imunes egressivas do timo ao tímumo em vasos sanguíneos periféricos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar para minimizar a exposição tecidual para o enxerto ideal e também para limitar o tamanho da incisão no olho para permitir excisão de fragmentos ilesos através da córnea enquanto reduz a fibrose durante a cicatrização.Após esse procedimento, outros métodos como tratamentos de controle localizado e incisão de outros tecidos no olho contralateral podem ser realizados de modo a responder perguntas adicionais sobre disfunções imunológicas ligadas a infecções, determinantes de involução e mecanismos de tolerância ao transplante. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da imunologia explorarem o desenvolvimento de células T, incluindo recrutamento de progenitores, dinâmica de olho de timo e passos maduros de egressão de células T in vivo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós apresentamos o passo-a-passo para a geração de quimeras neonatal, bem como a dissecação e preparação do timo ex vivo de imagens por 2-Photon Microscopia.

Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

Nós desenvolvemos novas ferramentas de laboratório e protocolos para aquisição de imagens intravital do timo. Nossa técnica deve ajudar na identificação de "nichos" dentro do timo, onde o desenvolvimento de células T ocorre.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Recentes avanços em 2-fotão microscopia permitiram em tempo...

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Este vídeo descreve a imagem de células T CD8 infiltrantes de tumor residentes marcadas com anticorpos acoplados fluorescentemente em fatias de tumor de pulmão humano. Essa técnica permite análises em tempo real da migração de células T CD8 por meio de microscopia confocal.

Análise em tempo real da migração de células T residentes em diferentes regiões tumorais usando microscopia confocal

Uma nova abordagem combinando transplantação intra-ocular e microscopia confocal permite longitudinal, não-invasivo de imagem em tempo real, com uma única célula de resolução dentro dos tecidos...

Transplante para a câmara anterior do olho para longitudinal, não-invasivo<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging com uma única célula de resolução em tempo real

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Este protocolo descreve um método de imagem residente tumor infiltrando T CD8 células rotulado com anticorpos fluorescente acoplados dentro de fatias de tumor de pulmão humano. Esta técnica permite análises em tempo real de migração de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

Este protocolo descreve técnicas como de alta resolução de imagem como tomografia de coerência óptica de domínio espectral e digitalização laser Oftalmoscopia pode ser utilizado em pequenos roedores, usando um sistema de plataforma de imagem oftálmica, para obter informações sobre espessura da retina e microglial celular distribuição, respectivamente.

Na Vivo Imagem de Cx3cr1gfp/gfp repórter ratos com a tomografia de coerência óptica espectral-domínio e digitalização Laser Oftalmoscopia

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

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