Geração de células NK humana primárias e expandida de Knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9
14 de junho de 2018
Aqui, apresentamos um protocolo para modificar geneticamente as células assassinas naturais humano primário ou expandido (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Usando este protocolo, geramos humanas células NK deficientes para transformar o receptor 2 do fator de crescimento – b (TGFBR2) e hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1).
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia celular NK sobre o papel e a função de genes e vias específicas que regulam a função das células efetoras. A principal vantagem desta técnica é sua alta taxa de sucesso em comparação com abordagens dependentes de DNA, facilitando um nocaute altamente eficiente de um dos genes clinicamente mais relevantes na terapia com células NK. As implicações dessa técnica se estendem à imunoterapia de tumores sólidos e tumores cerebrais que expressam TGF-beta como meio de escape imunológico.
Para a transdução primária de células NK, incubar três vezes 10 às cinco células NK recém-isoladas por mililitro de meio RPMI suplementado com 100 UI por mililitro de IL2 por frasco T75 por quatro dias, substituindo o meio em dias alternados e no dia anterior à transdução. Para transdução de células NK expandidas, estimule as células NK primárias no dia zero com células alimentadoras K562 que expressam IL21 ligadas à membrana irradiada em uma proporção de um para um, substituindo o meio em dias alternados e no dia anterior à transdução. No dia da eletroporação, encher um frasco T25 com oito mililitros de meio de cultura fresco suplementado com 100 UI por mililitro de IL2 por condição celular experimental e colocar os frascos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de CO2.
Enquanto o meio está se equilibrando, adicione três a quatro vezes 10 às sextas células por condição por 26 microlitros de mistura de transdução em um tubo cônico e peletize as células por centrifugação. Em seguida, lave as células três vezes em 12 mililitros de PBS estéril por lavagem para remover todo o FBS das suspensões celulares. Enquanto as células estão sendo lavadas, ressuspenda cada RNA CRISPR e tracrRNA para concentrações finais de 200 micromolares.
Misture 2,2 microlitros de cada RNA CRISPR com um volume de 200 micromolares de tracrRNA por amostra e aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente e armazene os complexos CRISPR RNA/tracrRNA a 20 graus Celsius negativos até seu uso. Para formar os complexos de ribonucleoproteínas, adicione a endonuclease Cas9 ao complexo CRISPR RNA/tracrRNA correspondente apropriado com turbilhão de 30 a 60 segundos e incube os complexos de ribonucleoproteínas Cas9 resultantes à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos.
Após a última lavagem, adicione todo o volume de suplemento de eletroporação do kit de solução Nucleofector P3 e ressuspenda cada pellet celular em 20 microlitros da solução primária P3 4D-Nucleofector tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Adicione imediatamente cinco microlitros de cada complexo de ribonucleoproteína à suspensão celular apropriada e adicione um microlitro de 100 micromolares Cas9 intensificador de eletroporação à mistura de células do complexo de ribonucleoproteína Cas9. Transfira 26 microlitros da solução de células de ribonucleoproteína Cas9 para poços individuais de uma tira de nucleocubeta e bata suavemente na tira para garantir que as amostras cubram o fundo de cada poço.
Em seguida, inicie o programa EN138 do sistema 4D-Nucleofector No final da transdução, deixe as células descansarem por três minutos. Em seguida, adicione 80 microlitros do meio de cultura pré-equilibrado a cada cubeta e transfira suavemente as amostras para um frasco por condição a 37 graus Celsius de incubação.
Após 48 horas de cultivo, extrair o DNA genômico de cinco vezes 10 para as cinco células transduzidas para triagem de deleção gênica de acordo com protocolos padrão. Em seguida, estimule o resto das células transduzidas com células alimentadoras frescas que expressam IL21 ligadas à membrana na proporção de um para um e extraia o RNA após cinco dias de co-cultura de acordo com protocolos padrão para análise de expressão gênica por PCR quantitativo. A análise de citometria de fluxo revela que o programa EN138 resulta na maior porcentagem de viabilidade celular e eficiência de transdução dos programas do sistema Nucleofector disponíveis.
Por exemplo, usando os RNAs guia fornecidos comercialmente, o HPRT1 humano é nocauteado com sucesso em células NK humanas expandidas. Além disso, as ribonucleoproteínas Cas9 contendo RNA2 guia, RNA1 guia mais RNA2 guia e RNA3 guia exibem um nocaute bem-sucedido do gene do ectodomínio do receptor TGF-beta dois, enquanto o RNA1 guia sozinho não induz nenhuma deleção de inserção detectável por T7E1. De fato, o uso do programa EN138 para eletroporação da ribonucleoproteína Cas9 resulta em uma redução de 60% na expressão de mRNA do receptor TGF-beta dois em células transduzidas por meio deste programa.
Além disso, a co-cultura das células transduzidas com TGF-beta e uma linha celular de meduloblastoma primário humano não afeta significativamente a citotoxicidade das células NK em comparação com as células transduzidas não tratadas com TGF-beta, confrontando uma falta correspondente de função do receptor dois de TGF-beta nas células modificadas por ribonucleoproteína Cas9 no nível da proteína. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cinco horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de projetar vários RNAs guia diferentes para encontrar o melhor resultado de edição de genes.
Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento de DNA ou ensaio de mutação T7E1, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a eficiência da edição de genes ou como determinar possíveis mutações genéticas fora do alvo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunoterapia contra o câncer explorarem o potencial de uso de células NK editadas por genes no tratamento do câncer. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a edição de genes de células NK humanas primárias.
Para obter mais informações sobre a expansão das células NK após esse processo, consulte nosso artigo anterior da Jove. Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano pode ser extremamente perigoso e que precauções universais de saúde e segurança devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para modificar geneticamente células natural killer (NK) humanas usando Ribonucleoproteínas Cas9 (Cas9/RNPs). O método permite a geração de células NK deficientes em TGFBR2 e HPRT1, facilitando a pesquisa em biologia de células NK e imunoterapia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Edição Genética
Fundamentos
- As células natural killer (NK) desempenham um papel crucial na resposta imunológica.
- Compreender as funções dos genes nas células NK pode aprimorar abordagens de imunoterapia.
- Os métodos atuais para edição genética em células NK têm limitações.
- Este protocolo visa melhorar a eficiência da eliminação genética em células NK.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para modificar células NK.
- Investigar os papéis de genes específicos na função das células NK.
- Explorar implicações para imunoterapia direcionada a tumores sólidos.
Métodos Utilizados
- Isolamento e cultura de células NK primárias em meio RPMI.
- Transdução de células NK usando IL2 e células alimentícias.
- Eletroporação para introdução de Cas9/RNPs nas células NK.
- Avaliação da eficiência e funcionalidade da eliminação genética.
Principais Resultados
- Geração bem-sucedida de células NK deficientes em TGFBR2 e HPRT1.
- Alta taxa de sucesso na eliminação genética em comparação com métodos tradicionais.
- Possíveis aplicações no aprimoramento da terapia de células NK para tumores.
- Insights sobre os mecanismos de fuga imunológica em tumores.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem robusta para modificação de células NK.
- Os resultados contribuem para a compreensão da biologia e terapia das células NK.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para aplicações clínicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Efficient genome editing of primary human NK cells addresses a critical bottleneck in immunotherapy development, enabling mechanistic interrogation of immune evasion pathways such as TGF-beta signaling. This DNA-free Cas9/RNP approach improves target validation confidence by reducing procedure-associated apoptosis and increasing knockout efficiency, supporting de-risking of NK cell-based therapeutics. The method enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation by generating functionally modified NK cells that retain expansion capacity and cytotoxic potential.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in primary human NK cells to clarify roles of TGFBR2 and HPRT1 in effector cell regulation.
- Operational Value: Provides a high-success-rate alternative to viral transduction, minimizing apoptosis and improving yield of genetically modified NK cells.
- Predictive Value: Supports assessment of gene knockout impact on TGF-beta sensitivity, informing mechanistic de-risking of immunotherapy candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates knockout NK cells suitable for functional assays, including cytotoxicity and gene expression analysis via RT-PCR and flow cytometry.
- Operational Value: Enables standardized preparation of edited NK cells using defined electroporation parameters (EN138 program) for reproducible transduction efficiency.
- Scalability: Supports post-electroporation expansion using irradiated mbIL21-expressing feeder cells, facilitating scale-up for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Produces TGFBR2-deficient NK cells with reduced sensitivity to TGF-beta, modeling immune escape mechanisms in solid and brain tumors.
- Preclinical Continuity: Allows co-culture with tumor cell lines (e.g., medulloblastoma) to evaluate functional resistance to immunosuppressive cytokines.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of gene-edited NK cell persistence and function after modification, supporting go/no-go decisions in immunotherapy development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation through gene knockout, enabling screening-ready cell products, and informing preclinical assessment of immunomodulatory resistance.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of gene roles in NK cell effector function, particularly in TGF-beta-mediated immune suppression pathways.
- Screening: Generates assay-ready NK cells with quantifiable outputs (viability, transduction efficiency, gene expression) for compound or condition comparison.
- Analytics: Delivers measurable endpoints including mRNA reduction (60% for TGFBR2), viability rates, and cytotoxicity shifts for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects genetic modification to functional outcomes in tumor co-culture models, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for NK cell editing that can be applied across multiple genetic targets and therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling efficient, DNA-free knockout in primary human NK cells.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization through defined electroporation conditions and feeder cell-based expansion.
- Strategic Value: Reduces biological risk in NK cell therapy development by clarifying gene function and immune escape mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunotherapy targets through mechanistic de-risking of TGF-beta resistance pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary NK cell isolation, culture, and electroporation techniques.
- Dependent on access to Nucleofector 4D system, Cas9 protein, and synthetic guide RNAs.
- Necessitates standardization of guide RNA design and validation across targets to ensure editing efficiency.
- Involves optimization of cell-to-complex ratios and incubation timing for RNP formation and delivery.
- Limited by primary NK cell donor variability and expansion potential post-electroporation.
