Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ecologia de doenças transmitidas por vetores, como: qual o papel do microbioma vetorial na dinâmica do patógeno e como os microbiomas vetoriais se formam e variam? As principais vantagens dessa técnica são que ela permite alta replicação, alta resolução e identificação, permitindo ao usuário caracterizar com precisão o microbioma vetorial sob diferentes condições ecológicas e ambientais. A demonstração visual desse método é importante, pois as etapas de configuração do sequenciamento do microbioma são difíceis de aprender e existem muitos produtos e técnicas diferentes disponíveis, mas poucos recursos disponíveis para aprender essas etapas.

Comece este procedimento com a coleta de ticks, conforme descrito no protocolo de texto. Para remover os contaminantes da superfície dos carrapatos, adicione 500 microlitros de peróxido de hidrogênio e vore por 15 segundos. Repita esta lavagem com etanol a 70% e, em seguida, água bidestilada

Coloque os carrapatos em um novo tubo de PCR e deixe-os secar ao ar. Neste tubo, interrompa mecanicamente os tecidos do carrapato esmagando os carrapatos com um mortal e pilão. Purifique o DNA de carrapatos individuais, seguindo as instruções fornecidas em um kit de extração de DNA disponível comercialmente.

Eluir até um volume final de 100 microlitros. A criação de um controle negativo na etapa de extração é fundamental para diferenciar posteriormente os contaminantes suspeitos dos micróbios vetores verdadeiros. O uso de técnica estéril durante a etapa de extração e etapas posteriores de PCR também é necessário para minimizar o impacto da contaminação comum no sequenciamento 16S.

Configure o PCR amplicon em uma reação de 27,5 microlitros contendo cinco microlitros de cada primer em um micromolar e 12,5 microlitros de mistura de PCR disponível comercialmente. Também inclui cinco microlitros de DNA extraídos de carrapatos individuais a uma concentração de cinco nanogramas por microlitro. Mova os tubos para um termociclador e execute o programa listado no protocolo de texto.

Assim que a PCR for concluída, visualize o produto da PCR carregando de quatro a seis microlitros por amostra em um gel de agarose a 1,5%. Procure uma banda em 460 pares de bases para confirmar a amplificação. Usando um novo tubo de PCR para cada amostra, combine o produto de PCR com água bidestilada para obter um total de 60 microlitros.

Para amostras com baixas concentrações de DNA, realize a PCR amplicon em triplicata para reduzir o viés de amplificação e agrupar as amostras para concentrar. Leve as esferas paramagnéticas à temperatura ambiente e vortexe-as bem antes de usar. Adicione 48 microlitros de esferas paramagnéticas a 60 microlitros da amostra e incube por cinco minutos.

Coloque os tubos em um rack magnético por cinco minutos até que a solução fique clara. Em seguida, remova o sobrenadante. Com tubos no rack magnético, adicione 500 microlitros de etanol a 80% recém-preparado.

Imediatamente após adicionar etanol a todos os tubos, pipetar o líquido, não remover os grânulos. Repita a adição e remoção de etanol mais uma vez. Seque as amostras ao ar para remover o excesso de etanol, deixando os tubos abertos no rack magnético por cinco minutos ou até que pequenas rachaduras sejam visíveis nos grânulos.

Agora, adicione 20 microlitros de tampão TE e incube as amostras do ímã em temperatura ambiente. Após cinco a 10 minutos, coloque os tubos de volta no ímã. Uma vez que os grânulos e o líquido estejam separados, transfira os sobrenadantes para um novo tubo para obter o produto de PCR limpo.

Atribua combinações exclusivas de primers a cada amostra, selecionando primers diretos ou reversos ou ambos de um kit de índice de biblioteca disponível comercialmente. Para anexar os primers ou índices duplos às amostras, prepare uma reação de PCR contendo 2,5 microlitros de cada primer, 12,5 microlitros de PCR Master Mix disponível comercialmente, cinco microlitros de água bidestilada e 2,5 microlitros de produto amplicon limpo. Mova os tubos para um termociclador programado conforme detalhado no protocolo de texto.

Assim que a PCR for concluída, visualize o produto da PCR carregando de quatro a seis microlitros por amostra em um gel de agarose a 1,5%. Procure uma banda com 550 pares de bases para confirmar a amplificação antes de realizar o procedimento de limpeza como antes. Para realizar a quantificação precisa de cada produto purificado com código de barras, execute qPCR em cada amostra e padrão em triplicado e execute cada amostra em três ou mais níveis de diluição.

Prepare reações de qPCR de 10 microlitros contendo seis microlitros de qPCR Master Mix, dois microlitros de água bidestilada e dois microlitros da amostra ou padrão. Mova a placa qPCR para um instrumento de PCR em tempo real programado conforme descrito no protocolo de texto e execute a execução. Após a quantificação, crie a biblioteca combinada adicionando volumes iguais de todas as bibliotecas individuais em um único tubo.

Depois de diluir e desnaturar a biblioteca combinada e o controle de sequenciamento, carregue a mistura combinada na célula de fluxo de sequenciamento. Limpe completamente a célula de fluxo antes de carregar para obter uma ótica ideal. Em seguida, carregue a célula de fluxo no sequenciador e execute a análise de sequência do amplicon.

As curvas de rarefação para normalização da contagem de sequências são mostradas aqui. Essas curvas indicam que a rarificação para 2000 sequências por amostra deve ser suficiente para capturar toda a diversidade de unidades taxonômicas operacionais observadas. Após a filtragem rarefeita e de qualidade, as leituras de sequência, a saída de diversidade alfa e beta é executada.

Aqui é mostrado um gráfico de análise de coordenadas de princípio gerado automaticamente que descreve como a composição do microbioma do carrapato difere com base no tratamento. Além disso, a visualização dos micróbios presentes em cada amostra, mostrada aqui no nível do filo, é criada automaticamente para todas as amostras. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a técnica estéril para minimizar o efeito da contaminação microbiana, que pode afetar criticamente a interpretação dos dados da sequência.

Após este procedimento, outros métodos, como coloração histológica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: onde estão localizados os micróbios observados dentro do vetor? Após seu desenvolvimento, esse método abriu caminho para pesquisadores no campo da ecologia molecular explorarem o papel das interações microbianas dentro do vetor e investigarem como isso pode afetar a transmissão de patógenos.