Name: Geração de Homo - e Heterografts entre melancia e cabaça para o estudo de MicroRNAs frio-responsivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprenda a criar homo- e heteroenxertos entre melancia e cabaça para estudar microRNAs responsivos ao frio. Este método eficiente e reprodutível oferece alta taxa de sobrevivência e insights valiosos sobre respostas ao estresse.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (31772191), o projeto de pesquisa para o interesse público na província de Zhejiang (2017C 32027), a chave de ciência projeto de melhoramento de plantas em Zhejiang (2016C 02051) e o programa nacional de o apoio de top-notch jovens profissionais (para lojas).

1. esterilização e germinação de sementes
<ol><li>Para a esterilização de superfície, mergulhe as sementes de cabaça num copo de 500 mL com água a 58 ° C, com agitação ocasional, até que a temperatura da água cai para 40 ° C.</li>
	<li>Enquanto isso, coloque 3 kg de solo de turfa em um saco de nylon e, para esterilizar, autoclave em 120 ° C/0.5 MPa por 20 min.</li>
	<li>Continue a embeber as sementes de cabaça para 4-5 h mais com nenhuma agitação.<ol>
<li>Uma vez que a água atinge a temperatura ambiente, lave as sementes 2 x - 3 x com água destilada.</li>
		<li>Escorra o excesso de água e permitir que as sementes germinar em um saco de gaze a 28 ° C em uma câmara de crescimento no escuro.</li>
		<li>Após a germinação, semear as sementes em potes de plástico (6 cm de diâmetro) enchidas com o solo de turfa esterilizado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando as mudas de cabaça desenvolveram dois cotilédones achatados, repita os passos 1.1-1.3 com sementes de melancia. Nota: Este tempo de gestão assegura que os tamanhos do descendente e porta-enxerto correspondem bem para enxertia bem sucedida.</li>
</ol>2. seedling crescimento e enxertia
<ol><li>Crescem as mudas em uma câmara de crescimento com um ciclo de 16-h /8-h luz escura, mantendo a temperatura a 28 ° C durante o dia (luz) e a 22 ° C durante a noite (escuro). Irriga as mudas, adicionando água 1 x por dia no final da tarde.</li>
	<li>Use o método de enxertia de corte22 para fazer heterografts quando as mudas da garrafa cabaça (porta-enxerto) estão na um fase verdadeiro-folha e os cotilédones da melancia (scion) surgiram (ainda não achatados).<ol>
<li>Cortar o hipocótilo das mudas melancia em 2-3 cm abaixo os cotilédones e folhas de topo das mudas no local imediatamente acima o verdadeiro cabaça.</li>
		<li>Use um palito para fazer um furo na parte superior das mudas aparado de cabaça. Insira as mudas de melancia aparada nos orifícios das mudas cabaça para fazer heterografts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um método semelhante como apresentada no passo 2.2 tornar stent. Nota: Combinações de Homo e heterografting sempre devem ser feitas simultaneamente (Figura 1), que, neste caso, resulta no seguinte: melancia/cabaça (WB, heterotópico), melancia/melancia (WW, homograft) e /bottle de cabaça cabaça (BB, homograft).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig1.jpg"> Figura 1: ilustração de combinações o enxerto e as estruturas de plantas enxertadas. WB = heterografting de melancia/garrafa cabaça; WW = homografting de melancia/melancia; BB = cabaça/garrafa cabaça homo-enxerto; WB-S = folhas descendente de heterografts de cabaça a melancia/garrafa que foram amostradas; WB-R = folhas de porta-enxertos das heterografts de cabaça de melancia/garrafa que foram amostradas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. postgrafting de gestão, tratamento pelo frio e amostragem
<ol><li>Wrap as mudas enxertadas com sacos de polietileno transparente para manter uma umidade relativamente elevada e mantê-las para a 7D sob condições ambientais de 16-h luz/8-h ciclos escuros, mantendo a temperatura a 28 ° C durante o dia (luz) e a 22 ° C, durante o noite (escuro).</li>
	<li>Descobri os sacos de polietileno transparente no dia 7. Deixe que as plantas crescem para um adicional 7-10 dias, sob as mesmas condições.</li>
	<li>Divida as mudas saudáveis e uniformes em dois grupos, um para tratamento pelo frio (estressado) e outro para o controle (não-forçado). Para o grupo de controle, deixe as mudas na câmara de crescimento mesmo (a 28 ° C) para um adicional 48 h, enquanto que para o grupo de frio-salientou, transferir as mudas para uma câmara de crescimento com uma temperatura constante a 6 ° C, com condições de claro/escuro, conforme descrito na etapa 2.1.</li>
	<li>As folhas do scion e o porta-enxerto de enxertos (Figura 1) da amostra. Congelar as amostras imediatamente em nitrogênio líquido e armazená-los a-70 ° C até o uso.</li>
</ol>4. Biblioteca preparação e arranjar em sequência do elevado-throughput
<ol><li>Transferi as amostras congeladas para um tubo de 2 mL microcentrifuga em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Adicione um talão de aço inoxidável (5 mm de diâmetro) para cada tubo contendo os tecidos.</li>
	<li>Homogeneizar os tecidos a um pó fino usando um homogeneizador de moinho do grânulo por 30 s.</li>
	<li>Para cada combinação de enxertia, tomar quantidades iguais (0,1 g) da amostra de solo de dez mudas e misturá-los num tubo de centrífuga de 10 mL. Adicione uma quantidade adequada de reagente de cloridrato de guanidium (Tabela de materiais) baseado nas sugestões do fabricante correspondente ao peso do tecido.<ol>
<li>Remover contaminações de DNA genômicas pela adição de RNA-livre de DNase I 150 U/mL a 37 ° C por 1h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinar o total número de quantidade de RNA em um sistema de eletroforese conta para garantir a integridade do RNA &gt; 7.0. Nota: Um RIN &gt; 7.0 assegura uma alta integridade das amostras do RNA.</li>
	<li>Prepare pequenas bibliotecas do RNA usando um kit comercial (Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Use 1 µ g de RNA total por amostra para iniciar.<ol>
<li>Degelo biblioteca normalização reagentes e adaptadores de acordo com as orientações do fabricante. Ligate RNAs pequeno com os adaptadores 5 ' e 3 ' e eluir e purificá-los. Em seguida, reverso transcrever o 5 ' e 3' ligada a RNAs pequeno, seguindo as orientações do fabricante.</li>
		<li>Execute a amplificação por PCR de acordo com o protocolo do fabricante. Avalie a qualidade e quantidade das bibliotecas de cDNA usando uma conta de eletroforese.</li>
		<li>Carregar de 1 µ l de uma biblioteca de RNA em um sistema de eletroforese conta para garantir o RIN &gt; 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sequencie as pequenas bibliotecas de RNA em um instrumento de sequenciamento de alto rendimento, conforme descrito em outro lugar23.</li>
</ol>5. miRNA e previsão de Gene alvo
<ol><li>Para cada combinação de enxertia, use o open source UEA sRNA bancada 2,4-planta versão24 para remover sequências de má qualidade e aparar sequências de adaptador do lê cru. Descartar as sequências que são menores do que 18 nt ou maior que 32 nt.</li>
	<li>Compare as sequências de "limpas" de alta qualidade para o banco de dados de código aberto Rfam 11.0 a reconhecer e remover leituras de tRNA, rRNA, snoRNA e outros snRNPs.</li>
	<li>Alinhe o restante lê para os genomas de referência usando uma sequência curta-leitura alinhamento ferramenta25. Não há incompatibilidade é permitida nesta etapa. Nota: A montagem do genoma "97103" melancia V126 foi usado para o alinhamento com as leituras de scion e o cabaça "HZ" genoma assembly V127 foi usada para leituras do rootstock.</li>
	<li>Compare o restante lê contra conhecidos miRNAs maduros no código-fonte aberto miRBase 22,028. Leituras que são homólogas ao conhecido miRNAs são classificadas como os miRNAs conservados.</li>
	<li>Compare as sequências que não combinam os precursores de miRNA conhecido com a sequência do genoma. Use o algoritmo de29 MIREAP para detectar potenciais miRNAs romance sob as configurações padrão.</li>
</ol>6. diferencial expressão e análise do Gene Ontology
<ol><li>Compare os níveis de expressão de miRNAs baseados suas contagens de leitura. os miRNAs com um P-valor (teste exato de Fisher) &lt; 0,05 e um registro absoluto2 valor &gt; 2 são considerados para ser diferencialmente expressos.</li>
	<li>Use do oligonucleotide antisentido alvo local seleção ferramenta (TargetFinder)30 para prever potenciais mRNAs complementares (miRNA genes-alvo) para os miRNAs diferencialmente expressos sob parâmetros padrão.</li>
	<li>Usar a ontologia de gene (ir) padrões de enriquecimento ferramenta analítica31 para revelar a ontologia de genes alvo miRNA (GO) sob um P- limite de valor de 0,05 de significância estatística.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar. Os dados de sequenciamento de RNA pequenos são depositados no GenBank sob o número de adesão SRP136842.

Neste protocolo, descrevemos em detalhe um método altamente eficiente e reprodutível para tornar homo e heterografts entre melancia e cabaça. Esse método, que exige nenhum equipamento específico, é muito fácil de operar e normalmente tem uma taxa de sobrevivência muito alta de enxertia. O método também pode ser usado para fazer enxertos para outras abóboras, tais como entre melancia, pepino e abóbora.
É interessante notar que o tamanho relativo (idade) do porta-enxerto e descendente é fundamen...

Enxertia tempo foi empregado como uma técnica agrícola para melhorar a produção agrícola e tolerância a estresses bióticos e abióticos1,2,3. Em sistemas de heterografting, porta-enxertos elite podem aumentar a absorção de água e nutrientes das plantas, reforçar a resistência a patógenos de solo e limitar os efeitos negativos da toxicidade do metal4,5, que podem conferir os enxertos uma reforçada vigor de crescimento e maior tolerância a estresses ambientais. Em muitos casos, heterografting também pode afetar as qualidades de frutos em plantas hortícolas, levando ao sabor da fruta melhorada e maior conteúdo de compostos relacionados com a saúde6,7. Verificou-se que a transferência de longa distância de fitohormônios, RNAs, peptídeos e proteínas entre o porta-enxerto e o scion é um mecanismo fundamental de modulação do crescimento e desenvolvimento reprogramação de scion plantas8,9 ,10. Enxertia tem sido amplamente utilizada em estudos de longa distância de sinalização e transporte em relação à adaptação ambiental11. Experimentos de enxerto são especialmente poderosos para a deteção inequívoca de moléculas transmitidas em tecido ou seiva vascular e ativação ou supressão de alvos moleculares devido ao sinal de transmissão12a receber.
RNAs não-codificantes, uma grande classe de RNA que exercem funções reguladoras importantes nas células, têm sido relatados para desempenhar um papel em facilitar a adaptação da planta ao estresse abiótico13. os miRNAs são endógenos pequeno não-codificantes RNAs de cerca 20-24 nt. estudos revelaram o papel regulador dos miRNAs em vários aspectos das atividades da planta, tais como atirar em crescimento, lateral raiz formação14,15,16, absorção de nutrientes, metabolismo de sulfato e homeostase17e respostas bióticos e abióticos stress18. Recentemente, a expressão de miRNAs e seus genes-alvo foram relacionados com tolerância de estresse em mudas de pepino heterografted19de sal. Nos enxertos intervariety de uva, as respostas de miRNA expressão ao estresse de seca foram encontradas para ser dependente do genótipo20.
O desenvolvimento rápido e diminuindo o custo da tecnologia de sequenciamento do elevado-throughput forneceram uma grande oportunidade para o estudo dos regulamentos de miRNA em plantas agrárias. Melancia (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), uma colheita importante Cucurbitácea crescido em todo o mundo, é suscetível a baixas temperaturas. Cabaça (Lagenaria siceraria [Molina] Cuatrec.) é uma Cucurbitácea mais clima-resistente comumente usada pelos agricultores para enxertar com melancia. O objetivo principal do estudo atual é estabelecer um padrão, eficiente e um método conveniente para fazer heterografts entre melancia (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) e cabaça (Lagenaria siceraria [Molina] Cuatrec). Este protocolo também fornece um esquema experimental detalhado e procedimentos analíticos para o estudo do Regulamento de miRNA expressões após a enxertia, que é útil para revelar os mecanismos subjacentes vantagens heterografting.
Os materiais de planta utilizados neste estudo incluem a cultivar de melancia e a cabaça landrace. Cultivar de melancia é um cultivar comercial com alto rendimento, mas suscetível a baixas temperaturas. Cabaça landrace é um popular porta-enxertos para enxertia com melancia, pepino e cabaça, devido à sua excelente tolerância de temperaturas baixas21.

<table><tbody><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DNase livre de RNA I</td><td>Takara</td><td>D2270A</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Kit de preparação de amostra de RNA pequeno Illumina</td><td></td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bionalyser</td><td>Agilent</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>DNA Polimerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>UEA sRNA workbench versão 2.4-planta&nbsp; (software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Banco de dados Rfam 11.0&nbsp;( website)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://rfam.janelia.org</td></tr><tr><td>miRBase 22.0( website)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://www.mirbase.org/</td></tr> <tr><td>MIREAP(software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td></tr> <tr><td>TargetFinder&nbsp;( software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://targetfinder.org/</td></tr></tbody></table>

geração de homo - e heterografts entre melancia e cabaça para o estudo de micrornas frio-responsivo

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) são endógenos pequeno não-codificantes RNAs de cerca 20-24 nt, conhecida por desempenhar um papel importante no desenvolvimento da planta e adaptação. Há uma acumular evidências mostrando que as expressões de determinados miRNAs são alteradas quando o enxerto, uma prática agrícola comumente utilizada pelos agricultores para melhorar a tolerância das culturas a estresses bióticos e abióticos. Cabaça é uma colheita inerentemente resistentes às alterações climáticas, em comparação com muitos outras abóboras grandes, incluindo melancia, tornando-o um dos porta-enxertos mais utilizados para o último. O recente avanço das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento tem proporcionado grandes oportunidades para investigar os miRNAs frio-responsivo e suas contribuições para vantagens heterotópico; ainda, os procedimentos experimentais adequados são um pré-requisito para esta finalidade. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a geração eficiente de homo e heterografts entre o frio-suscetíveis de melancia e a cabaça tolerante ao frio, além de métodos de amostragem de tecido, geração de dados e análise de dados. Os métodos apresentados são também úteis para outros sistemas de planta-enxerto, para interrogar miRNA regulamentos sob vários estresses ambientais, tais como calor, seca e salinidade.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Figura 2: fenótipos de vários enxertos em temperatura ambiente e condições de frio-salientou. (um) este painel mostra homo e heterografted mudas à temperatura ambiente como o controle. (b) este painel mostra homo e heterografted mudas após 48 h de tratamento pelo frio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg" target="_blank"...

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para eficientemente tornando homo - e heterografts entre melancia e cabaça, além de métodos de amostragem de tecido, geração de dados e análise de dados, para a investigação de microRNAs frio-responsivo.

Geração de Homo - e Heterografts entre melancia e cabaça para o estudo de MicroRNAs frio-responsivo

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na resposta do miRNA à capacidade de estressar em enxertos vegetais, como como o miRNA é regulado sob estresse frio em enxertos de cabaça de garrafa de melancia. A principal vantagem dessa técnica é que é um método altamente eficiente e reprodutível para fazer homo e heteroenxertos. Não requer nenhum equipamento específico, é muito fácil de executar, e normalmente resulta em uma taxa de sobrevivência muito alta de enxerto.Através deste método, pode fornecer insights sobre a resposta do miRNA ao estresse frio no sistema de enxerto de cabaça de garrafa de melancia. Também pode ser aplicado a outros organismos modernos para revelar os mecanismos do transporte miRNA local e de longa distância. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de enxerto são difíceis de aprender.Esta etapa exigiu habilidades avançadas e são fundamentais para a sobrevivência das plantas enxertadas. Para começar, mergulhe as sementes de cabaça de garrafa em um béquer de 500 mililitros de 58 graus Celsius de água. Mexa as sementes ocasionalmente até que a temperatura da água caia para 40 graus Celsius.Enquanto a água esfria, coloque três

generating-homo-heterografts-between-watermelon-bottle-gourd-for

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Ambiente

Este vídeo descreve a microinjeção, um método comum de criação de cepas transgênicas de C. elegans. No exemplo, veremos a microinjeção usada para introduzir um complexo de ribonucleoproteína (RNP) para edição de genes baseados em CRISPR.

Microinjeção de gônadas: um método de entrega de compostos diretamente na linha germinativa de C. elegans

Usando o conjunto de DNA, vectores de múltiplos CRISPR podem ser construídos em paralelo numa única reacção de clonagem, tornando a construção de um grande número de vectores CRISPR uma tarefa simples. Tomate raízes peludas são um excelente sistema modelo para validar vetores CRISPR e gerar materiais mutantes.

De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

Este protocolo descreve as etapas para a clonagem de vários RNAs de guia único em um vetor de guia de RNA concatemer, que é de uso particular na criação de knockouts multi-genes usando a tecnologia CRISPR / Cas9. A geração de knockouts duplos em organoides intestinais é mostrada como uma possível aplicação deste método.

Um protocolo para múltiplo knockout de genes em ratos Organoids Intestinal Pequeno Usando um CRISPR-concatemer

Aqui nós apresentamos protocolos para coletando e microinjecting precellular milho ocidental embriões repele com a finalidade de realizar ensaios funcionais-genômica como germline transformação e edição de CRISPR/Cas9-genoma.

Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

Este objetivo deste protocolo é produzir axolotos quiméricos com membros dianteiros haploides derivados de tecido doador mutagenizado de Cas9 usando técnicas de enxerto de tecido embrionário.

Geração de Axolotis Quiméricos com Membros Haploides Mutantes através de enxerto embrionário

Apresentamos um protocolo detalhado para o sistema de silenciamento de microRNA baseado em vírus de batata X (PVX) para caracterizar funcionalmente microRNAs endógenas (miRNAs) na batata. As moléculas de mímica alvo (TM) de miRNA de interesse são integradas ao vetor PVX e transitavelmente expressas na batata para silenciar a família miRNA ou miRNA alvo.

Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata.

Um protocolo de injeção à base de agrobacterium (agroinjeção) é apresentado para a inoculação do vírus do mosaico de rabo-de-raposa e do vírus do mosaico de cana-de-açúcar em mudas de milho. A inoculação dessa forma leva à infecção viral, silenciamento genético induzido por vírus de genes marcadores e superexpressão viral de GFP.

Agroinoculação direta de Mudas de Milho por Injeção com Vírus mosaico de rabo-de-cavalo recombinante e clones infecciosos do vírus do mosaico de cana-de-açúcar

Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

Este protocolo descreve microinjeção e eletroporação in vivo para edição do genoma mediada por CRISPR regionalmente restrita no oviduto de camundongos.

Modelos de camundongos com engenharia genômica somática usando microinjeção e eletroporação in vivo

Este estudo desenvolveu um fluxo de trabalho para a geração e manutenção de linhagens mutantes estáveis para o caracol de maçã de água doce, Pomacea canaliculata. Os protocolos incluem a coleta de zigotos, sua microinjeção com os componentes do sistema CRISPR/Cas9 para induzir a edição do genoma, cultura ex ovo de embriões e genotipagem após cruzamentos controlados.

O Caracol Maçã Dourada Pomacea canaliculata: De Zigotos a Linhagens Mutantes Estáveis

Aprenda a criar homo- e heteroenxertos entre melancia e cabaça para estudar microRNAs responsivos ao frio. Este método eficiente e reprodutível oferece alta taxa de sobrevivência e insights valiosos sobre respostas ao estresse.

Geração de Homo - e Heterografts entre melancia e cabaça para o estudo de MicroRNAs frio-responsivo

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