Name: Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprenda a identificar fatores antivirais do hospedeiro e imunomoduladores virais usando ensaios de luminescência e fluorescência em células de insetos lepidópteros LD652. Este método permite estudar a replicação de arbovírus em condições controladas.

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D.G. foi suportado pelo financiamento do programa de estudiosos do Universidade do Texas Southwestern Medical Center dotado. Os autores Obrigado Michael Whitt (The University of Tennessee Health Science Center) e Sean Whelan (Harvard Medical School) para a prestação de VSV-DsRed e VSV-LUC. Os autores também agradecer Gary Luker (Faculdade de medicina de Universidade de Michigan) o dom gentil da estirpe VACV-FL-GFP.

1. geral mariposa dispar (LD652) celular e cultura de vírus
<ol><li>
Célula LD652 cultivo e chapeamento
	<ol>
<li>A cultura dispar L.-derivada LD652 células, manter uma monocamada de células em um meio de crescimento (Tabela de materiais), incubados a 27 ° C, sob atmosfera normal. Manter as células em pratos de tecido-cultura-Tratado de 10cm e passagem das células ao atingir 80% de confluência.</li>
		<li>A placa, desalojar aderente LD652 células da placa pipetando mídia repetidamente para a monocamada (estas células não exigem tripsinização para desalojar) e diluir a amostra em meios de crescimento para uma densidade aproximada de 1 x 105 células/mL. Pipete 1 mL da cultura/bem diluído de uma placa de 24. Sementes de um mínimo de tipo de replicar e três poços de tratamento para cada ponto de tempo (um máximo de oito tratamentos/placa).</li>
		<li>Permitir que as células a se contentar com um mínimo de 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de vírus vaccinia
	<ol>
<li>Para preparar as existências de VACV, amplificar o vírus em HeLa20 de células ou células de rim de macaco verde africano (BSC-1 ou BSC-40 células)20,21,22. Nota: Tensão VACV Western Reserve (VACV-WR) funciona bem em ensaios descritos aqui.</li>
		<li>Titule VACV tensão através do ensaio da chapa no BSC-1 ou BSC-40 células20,22. Nota: Todos os indicaram multiplicidade VACV de infecção (MOI) descrito aqui para LD652 infecções de célula baseiam-se em títulos obtidos de ensaios de placa BSC-40.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de vírus estomatite vesicular
	<ol>
<li>Para preparar ações VSV, amplifica o vírus no de células BHK23.</li>
		<li>Titule VSV pelo ensaio de placa na BSC-40 ou BHK célula monocamadas13,23. Nota: Todos MOIs de VSV descrito aqui para LD652 infecções de célula baseiam-se em títulos obtidos de ensaios de placa BSC-40.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. baseado em fluorescência VSV resgate ensaio usando co-infecção e imagem latente da viver-pilha
<ol><li>
A propagação e a infecção de células LD652
	<ol>
<li>Placa 40.000 LD652 células/poço de uma câmara de 8 poços.</li>
		<li>Para a imagem latente viver-pilha baseada em fluorescência, use cepas VSV codificação de proteínas fluorescentes. Os experimentos apresentados aqui usam VSV-DsRed17, uma estirpe VSV recombinante que expressa a proteína de DsRed livre que não está fundida a qualquer outra proteína VSV. Nota: VSV infecção de células LD652 não é citopático por 96 hpi e, assim, a morte celular não é um fator de confundimento, ao avaliar a replicação de VSV dentro deste prazo.</li>
		<li>Preparar o VSV-DsRed e VACV-FL-GFP em uma mídia livre de soro (SFM; Tabela de materiais) em um MOI de 1 e 25, respectivamente. Nota: VACV-FL-GFP é uma estirpe VACV recombinante que expressa uma fusão entre LUC e GFP24. Usar um MOI de 25 ou maior para as estirpes VACV garante que todas as células LD652 são infectados13. Se usando um vírus diferente coinfecting, o MOI terá de ser determinado empiricamente pelo usuário. Cada tratamento de infecção deve ser configurado em poços duplicados e incluem tratamentos infectados por simulação em que apenas SFM é adicionado às células.</li>
		<li>Incube as celulas em 0,2 mL de inóculo para 2 h a 27 ° C.</li>
		<li>Lave as células com 0,5 mL/bem de mídia de crescimento.</li>
		<li>Incube as celulas em 25 μM de corante de viabilidade celular (Tabela de materiais) em meios de crescimento por 45 min a 27 ° C.</li>
		<li>A mídia de aspirar e lavar os poços 1 x 0,5 ml/bem para remover o corante em excesso.</li>
		<li>Manter as células em 0,3 mL/bem dos meios de crescimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Viver a captura de imagem de célula
	<ol>
<li>Ligue um microscópio confocal 30 min de antecedência e carregar um prato de câmara de 8 poços. Nota: LD652 células podem ser fotografadas à temperatura variando entre 20 e 25 ° C, mas para condições ideais, a temperatura da sala deve ser ajustada a 27 ° C.</li>
		<li>Configure as definições de excitação/emissão adequadas para cada proteína marcador fluorescente para ser fotografada, bem como as configurações de imagem de contraste de fase.</li>
		<li>Ajuste a intensidade do laser para cada canal. Nota: Isto pode exigir a execução uma experiência piloto para determinar a gama de intensidades do sinal fluorescente observados ao longo do tempo a ser usado na experiência final.</li>
		<li>Usando o objectivo X 10, capturar as imagens de contraste e fluorescência de fase de cada bem cada 1 – 5 h para a duração da infecção até certo ponto o tempo desejado (ex., 48 – 72 hpi). Nota: É importante capturar vários campos de visão em cada poço para estimar com precisão as taxas de infecção em toda a cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de imagem
	<ol>
<li>Use o software de análise de imagem para análise automatizada de imagem dos canais apropriados fluorescentes (EG., 405 nm, 488 nm, 568 nm).</li>
		<li>Para calcular a porcentagem de células que são infectadas, dividir o número total de células fluorescentes, indicando infecção VSV (ex., células DsRed positivo para infecções de VSV-DsRed) pelo número total de células viáveis, rotulado por tintura de viabilidade celular para cada campo de visão em todos os tratamentos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. general infecção Viral protocolo para ensaios de salvamento baseados em luminescência VSV nas células LD652
<ol><li>
Preparação do inóculo
	<ol>
<li>30 min antes da infecção, descongelar as existências de VSV-LUC16 (um recombinante VSV estirpe que manifesta a sua enciclopédia vagalume luciferase proteína não fundida a qualquer outra proteína VSV). Se a análise para resgate de VSV-LUC durante co-infecção VACV, também descongele o vírus VACV-WR no gelo. Nota: Outros vírus (além de VACV-WR) podem resgatar VSV-LUC durante a co-infecção, mas isto terá que ser determinado empiricamente por cada usuário.</li>
		<li>Preparar o inóculo diluindo VSV-LUC na presença ou ausência de VACV-WR em SFM tal que um MOI de 10 e 25, respectivamente, é alcançado quando adicionando um volume total de inóculo de 0,2 mL/bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Infecção das células
	<ol>
<li>Aspire maduro LD652 mídia cuidadosamente para evitar perturbar a monocamada e inocular 0,2 mL de vírus/poço. Este tempo é definido como 0 hpi. Adicione SFM estéril para poços adicionais para servir como "simulação infectados" tratamentos de controle negativo.</li>
		<li>Incube as celulas em inóculo para 2 h a 27 ° C.</li>
		<li>No hpi 2, remover o inóculo por aspiração e substituir com 1ml/bem LD652 meios de crescimento.</li>
		<li>Permitir que a infecção proceder hpi 24-72.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. luciferase ensaio
<ol><li>
Preparação de lisados celulares
	<ol>
<li>Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de fosfato salino de Dulbecco (DPBS) / bem.</li>
		<li>Usando o êmbolo de uma seringa de 1 mL, raspe as células em DPBS.</li>
		<li>Transferir as células para um tubo de microcentrifugadora e centrifugar 400 x g por 20 min a 4 ° C.</li>
		<li>Enquanto isso, preparar a 1 diluição x 5 x repórter do lysis (RLB) em estéril H2O.</li>
		<li>Após a centrifugação, Aspire o DPBS sem perturbar o centrifugado.</li>
		<li>Ressuspender em 150 µ l de 1 a cada x RLB.</li>
		<li>Congelamento e descongelamento das amostras 1 x usando uma incubação de 5 min em um freezer-80 ° C, seguido de um rápido degelo em água à temperatura ambiente. Armazene os lysates a-80 ° C até que esteja pronto para analisar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensaio do luciferase
	<ol>
<li>Descongele os lysates no gelo.</li>
		<li>Adicionar 20 μL de lisado num poço de uma microplaca de 96 poços de preto ou branco sólido.</li>
		<li>Adicione 100 µ l de reagente de ensaio do luciferase a cada poço.</li>
		<li>Imediatamente, medir a intensidade da luz usando um luminómetro (configurações apropriadas para luminometers específico terá que ser determinado empiricamente pelo usuário).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise do ensaio de luciferase
	<ol>
<li>Normalize a LU sinais para cada tratamento para leituras de LU obtidos de tratamentos controle (Representante resultados). Depois de pelo menos três experimentos independentes foram realizados, a média de que Lu obtido de cada grupo de tratamento/controle pode ser analisada por testes estatísticos adequados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunoblot
<ol><li>Use lysates extraído para os ensaios LUC para SDS-PAGE e immunoblotting subsequente, usando instrumentação e reagentes apropriados.</li>
</ol>6. título de VSV de culturas de células de LD652
<ol><li>Placa LD652 células conforme item 1.1.</li>
	<li>Viral infectar as células de acordo com a etapa 3.</li>
	<li>Nos pontos de tempo desejado, colete os sobrenadantes em tubos estéreis microcentrifuga.</li>
	<li>As células com 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C de pelotas e transferir os sobrenadantes para tubos novos.</li>
	<li>Armazenar os sobrenadantes a-80 ° C ou proceder com titulação pelo ensaio de placa no BSC-40 células. Nota: Se titulada VSV de culturas de células LD652 que continha VACV, é aconselhável adicionar 100 μg/mL arabinoside de citosina (AraC) para os meios de cultura de BSC-40 dentro 2 hpi, para impedir que partículas residuais de VACV formando placas em monocamadas de BSC-4013. AraC é um inibidor da polimerase de DNA viral que bloqueia a replicação de DNA VACV25 mas não afeta a replicação de VSV.</li>
</ol>7. variações de VSV baseada em luminescência resgatar ensaios em células de LD652: RNAi e experimentos de transfeccao Plasmideo
<ol><li>
Preparação do dsRNA por nocaute mediada por RNAi de viral ou hospedar transcrições
	<ol>
<li>Primeiras demão gene-específicas do projeto de cauda na extremidade 5' com a sequência do promotor T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) para o alvo ou o vírus coinfecting (por exemplo, VACV) ou transcrições de mRNA dispar L. de interesse. Estas primeiras demão deve produzir um produto PCR do bp 400 – 600 por nocaute eficaz mediada por RNAi. Ver Gammon et al 13 para sequências da primeira demão costumava abaixo knockdown VACV ou dispar L. transcrições por RNAi mediada por dsRNA nas células LD652. Nota: Dispar L. mRNA transcritos podem ser identificados de publicou dispar L. bancos de dados de transcriptoma26,27,28.</li>
		<li>Gerar um DNA modelo através de RT-PCR (síntese do cDNA: 1 ciclo de 50 ° C por 30 min; PCR: 40 ciclos de 94 ° C por 15 s, 50 ° C por 30 s e 68 ° C por 45 s cada).</li>
		<li>Purifica o produto do PCR usando um kit de purificação de PCR.</li>
		<li>Usando o produto do PCR purificado como um modelo, em vitro transcrever e purificar dsRNA usando um em vitro transcrição e purificação kit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfecção de dsRNA ou plasmídeo em células LD652
	<ol>
<li>Semente de 1 x 105 células/poço de uma placa de 24 e deixar que as células se contentar com pelo menos 1 h.</li>
		<li>Para cada poço a transfected, dilua 4 µ l de reagente de transfeccao em 100 μL de SFM. Encube por até 15 min. à temperatura ambiente. Isto pode ser escalado para fazer uma mistura de mestre para todos os transfections a ser executada.</li>
		<li>Dilua até 1 μg de dsRNA ou total plasmídeo com 100 μL de SFM para cada poço a transfected. Encube por até 15 min. à temperatura ambiente. Nota: Anteriormente encontramos que um transfection de 1 μg de dsRNA/105 LD652 células é suficiente para > nocaute de 80% de qualquer viral ou hospedar transcrições13, mas dsRNA doses necessárias para modificado experimental set-ups/condições terá que ser determinada empiricamente.</li>
		<li>Combinar a transfeccao reagente e dsRNA/shRNA DNA as diluições com uma proporção de 1:1 (p. ex., 100 μL de dsRNA diluído é misturado com 100 µ l de reagente de transfeccao diluído) e incube por 20 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Enquanto isso, lavar os poços com 1ml/bem de SFM e em seguida, adicione 500 μL de SFM a cada poço.</li>
		<li>Adicionar lentamente o dsRNA reagente de transfeccao (ou plasmídeo) mistura gota a gota em cada poço.</li>
		<li>Incube o reagente de transfeccao com as células por 5h.<ol>
<li>Para RNAi experimentos envolvendo a derrubada de transcrições codificado por um vírus coinfecting (por exemplo, VACV), substituir o reagente de transfeccao após o período de incubação de 5-h transfecção com inóculo de vírus contendo VSV-LUC (com ou sem VACV ou outro vírus coinfecting) (passo 3). Posteriormente, substitua o inóculo de vírus contendo VSV-LUC com crescimento completa mídia 2 hpi. Ensaios LUC (etapa 4) então podem ser executados em lysates extraído em vários pontos de tempo para determinar se o nocaute de coinfecting transcrições de vírus leva a uma perda de resgate VSV-LUC.</li>
			<li>Para RNAi experimentos envolvendo RNAi de dispar L. transcrições, substituir a mistura de transfeccao com mídia de crescimento completo e permitir nocaute para ensue para 24 h antes da infecção com VSV-LUC (passo 4). Ensaios LUC (etapa 4) então podem ser executados em lysates extraído em vários pontos de tempo para determinar se o nocaute de dispar L. transcrições promove resgate VSV-LUC.</li>
			<li>Para os experimentos envolvendo transfections de vetores de expressão do plasmídeo expressando candidato imunomoduladores, substituir o reagente de transfeccao e permitir a expressão da proteína durante 24 h antes da infecção com VSV-LUC (passo 4). Ensaios LUC (etapa 4) então podem ser executados em lysates extraído em vários pontos de tempo para determinar se a expressão de proteínas de imunomoduladores candidato promove resgate VSV-LUC. Nota: As transfeccao condições descritas aqui usando 1 μg/poço de resultado de DNA do plasmídeo em eficiências de Transfeccao de 40 – 60%13.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui descrevemos simples fluorescência e luminescência-ensaios - based para a tela para condições que resgatar a replicação de VSV em culturas de células de lepidópteros restritivas. A infecção abortiva de VSV nas células lepidópteros cria uma excelente relação sinal-ruído quando a análise de expressão gênica VSV. Por exemplo, eram os sinais de LU detectados em lysates do única infecções VSV-LUC ~ 1,000-fold superior em mock-infectados lisados, contudo estes sinais mudaram somente aproximadamente dupla um longo tempo de ...

A capacidade de um vírus de forma produtiva replicar em um host específico em parte rege-se pela disponibilidade de fatores de célula do hospedeiro que suportam entrada viral e replicação1. A gama de vírus-host também pode ser ditada pela capacidade de um vírus para contador celular antiviral as defesas que caso contrário iria impedir a replicação viral2,3. É o resultado dessas interações vírus-hospedeiro complexo que, finalmente, decidir se um vírus serão capaz de completar o seu ciclo de vida em um host específico. Dadas as consequências potencialmente patogénicas para o host se segue de replicação viral, é fundamental para desenvolver estratégias experimentais para promover nossa compreensão das interações vírus-hospedeiro chave que pode desequilibrar a balança entre abortivo e produtivo infecções. Elucidar as características moleculares da interação vírus-hospedeiro será fundamental para o desenvolvimento de novas e alternativas estratégias terapêuticas antivirais.
Com o advento do RNA de interferência (RNAi)4,5 e as ferramentas de edição do genoma (EG., CRISPR-Cas9, zinco dedo nucleases, TALENs)6,7, tornou-se viável experimentalmente para alterar a expressão de fatores celulares em todo o genoma escalas e explorar o impacto dessas alterações na replicação do vírus. Com efeito, foram realizadas numerosos RNAi e telas do genoma-edição-baseado em tipos de células do hospedeiro de invertebrados e vertebrados que têm revelado novas facetas do vírus-anfitrião interações8,9,10, 11 , 12. essas telas geralmente empregam vírus codificação repórteres, como luciferase de vaga-lume (LUC) ou proteínas fluorescentes (EG., GFP, DsRed), que fornecem um meio conveniente de avaliar quantitativamente a expressão de gene viral como uma leitura para a replicação viral9,12. Esta estratégia permite que os pesquisadores identificar os fatores do hospedeiro que ou promovem ou antagonizar a replicação viral, como evidenciado pela aumenta ou diminui, respectivamente, em repórter viral sinaliza9,12. No entanto, na maioria dos casos, estas telas foram realizadas usando vírus que são bem adaptados para o tipo de célula do hospedeiro em que eles estão sendo estudados. Enquanto esta estratégia pode ser importante para a compreensão coevolutionary relações entre patógenos virais e seus hospedeiros naturais, isso levanta preocupações fundamentais em relação a seu uso em descobrir fatores antiviral do hospedeiro. Nestes casos, um aperfeiçoamento no repórter vírus sinal em cima de RNAi "knockdown" está sendo procurado, ou a inativação de um fator celular que normalmente impede a replicação viral. Primeiro, se um vírus já é capaz de robustamente replicar na célula hospedeira, sendo examinada sob condições de controlo, a gama dinâmica da tela (ou seja, a capacidade de distinguir entre o fundo e sinais de maior repórter viral) pode ser limitada. Em segundo lugar, esta questão é ainda mais agravada pelas situações em que o vírus está bem adaptada para a célula hospedeira e eficaz na luta contra vias de defesa de anfitrião que estão a ser alvo na tela.
Devido as preocupações acima de interação vírus-hospedeiro tradicionais métodos de rastreio, desenvolvemos um novo paradigma para o estudo de interações vírus-hospedeiro que exploram infecções naturalmente abortivo arbovírus em células de insetos lepidópteros. Esta estratégia deriva de uma observação que o arbovírus humana estudada, VSV, sofre uma infecção abortiva em células derivadas de gypsy moth (L. dispar)13. VSV é naturalmente transmitida por insectos frequentes (ou seja, areia moscas) para hospedeiros mamíferos e tem sido demonstrado experimentalmente para infectar uma grande variedade de invertebrados e vertebrados hospedeiros em celulares cultura e na vivo14. 11-kb sentido negativo single-stranded RNA genoma de VSV codifica cinco mRNAs subgenomic que cada um foram traduzidos para as proteínas que compõem o vírion envelopada. No entanto, sistemas de genética reversos VSV permitiram a criação de replicação competente cepas codificação LUC ou proteínas fluorescentes, além de cinco natural VSV gene produtos15,16,17. Porque estas proteínas repórter não são incorporadas o vírion VSV, eles fornecem uma leitura conveniente para expressão de gene VSV que ocorre após a entrada. Usando cepas VSV codificação GFP ou LUC, anteriormente mostramos que a expressão gênica VSV é severamente restringido aquando da entrada das células LD652 e que títulos VSV não aumentam por infecção pós de 72 horas (hpi). Em contraste, a co-infecção de LD652 células com VSV e o poxvírus mamíferos, vírus vaccinia (VACV), conduz a aumentos logarítmicos na expressão gênica VSV e títulos por este ponto de tempo. VACV sofre a expressão de gene inicial, replicação do DNA e tarde expressão gênica em infecções de células LD652, mas o ciclo de replicação VACV é abortivo, finalmente, devido à incompleta do virion morfogênese18. O genoma de DNA ~ 192 kb grande de VACV codifica proteínas > 200, muitos dos quais exibem propriedades immunomodulatory que promovem a replicação viral através da supressão de respostas imunes do anfitrião19. Portanto, formulamos a hipótese que o "resgate" de replicação VSV nas células LD652 por co-infecção VACV foi provavelmente mediado por VACV imunomoduladores que inibiu dispar L. respostas normalmente restringir a replicação de VSV. Em apoio isso, o tratamento de células LD652 com inibidor anfitrião RNA polimerase II actinomicina D também resgata a replicação do VSV nas células LD652, indicando que as respostas do hospedeiro dependente de transcrição bloqueiam VSV replicação pós-entrada13.
As observações acima sugerem que a natureza naturalmente restritiva de LD652 células à infecção VSV pode fornecer um fundo relativamente baixo, quando o rastreio para as condições que aumentam os sinais codificados VSV repórter (ou seja, aqueles que inibem o anfitrião defesas antivirais). Aqui, nós fornecemos os métodos para usando fluorescência ou ensaios baseados em LUC a tela para as condições que aliviar a restrição de VSV nas células lepidópteros. Primeiro, mostramos como estes ensaios podem ser usados para identificar fatores de imunomoduladores virally codificado que quebre a restrição de VSV também experiências de co-infecção ou por meio de expressão ectópica de fatores virais de candidato. Como exemplo, ilustramos como usamos estas técnicas de triagem para identificar proteínas codificadas poxvírus de A51R como uma nova família de fatores de imunomoduladores que resgatar a replicação de VSV, na ausência de outros fatores de poxvírus13. Em segundo lugar, ilustramos como RNAi triagem em infecções de célula restritivas VSV-LD652 pode ser usado para identificar diretamente fatores do hospedeiro eucarióticas envolvidos em arbovírus restrição13.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultura de tecidos com 6 poços</td><td>CELLTREAT</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de tecidos com 24 poços</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de tecidos de 10 cm</td><td>Corning</td><td>C430167</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Insect Medium</td><td></td><td>Sigma G8142</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 420</td><td>Sigma</td><td>14420C</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td></td></tr><tr><td>Meio</td><td></td><td></td><td>de crescimento 1:1 mistura de Grace's Insect Medium e EX-Cell 420 Serum-Free Medium também contendo 1% de solução antibiótica-antimicótica e 10% de soro fetal bovino</td></tr><tr><td>Solução Antibiótica-Antimicótica (100&vezes;)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina (DPBS)</td> <td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Soro livre de mídia (SFM)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td></td></tr><tr><td>Citosina arabinosídeo</td><td>Sigma</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro DMSO (Dimetil Sulfóxido)</td> <td>Corning</td><td>25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Repórter tampão de lise 5x</td><td>Reagente</td> de ensaio de luciferase Promega <td>E3971</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>E1483</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-FLAG de camundongo</td><td>Wako</td><td>014-22383</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de luciferase anti-vaga-lume</td><td>de coelho Abcam ab21176</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-actina de camundongo</td><td>Sigma</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-VSV M</td><td>N/A</td><td>N/A Dr</td><td>. John Connor (Universidade de Boston)</td></tr><tr><td>Rato anti-VACV I3L</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dr. David Evans (Universidade de Alberta)</td></tr><tr><td>Prato com câmara de 8 poços</td><td>Lab-Tek II</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Corante de viabilidade celular</td><td>Thermo Fisher</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar leitor de microplacas</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>Olympus</td><td>v1.18</td><td>cellSens software</td></tr><tr><td>Eppendorf 5702 centrífuga ventilada</td><td>Eppendorf</td><td>22628102</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc Sistema de imagem infravermelha</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>Odyssey Fc</td><td></td></tr><tr><td>LD652 células</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dr. Basil Arif (Recursos Naturais Canadá)</td></tr> <tr><td>Células BSC-40</td><td>ATCC</td><td>CRL-2761</td><td></td></tr><tr><td>Células BHK</td><td>ATCC</td><td>CCL-10</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Células BSC-1</td><td>ATCC</td><td>CCL-26</td><td></td></tr><tr><td>in vitro kit de transcrição e purificação</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação PCR</td><td>Qiagen</td><td>Rolamento 28104</td><td></td></tr></tbody></table>

arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores antiviral viral de imunomoduladores e host

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Interferência do RNA - e genoma de edição com base em plataformas de triagem têm sido amplamente utilizados para identificar fatores de célula do hospedeiro que restringem a replicação do vírus. No entanto, essas telas geralmente são realizadas em células que são naturalmente permissivas ao patógeno viral sob estudo. Portanto, a replicação robusta de vírus em condições de controle pode limitar a gama dinâmica dessas telas. Além disso, estas telas podem ser incapazes de identificar facilmente os caminhos de defesa celular que restringem a replicação do vírus, se o vírus é capaz de combater as defesas antivirais e adaptado para o host. Neste artigo, descrevemos um novo paradigma para explorar interações vírus-hospedeiro com o uso de telas o centro na naturalmente abortiva infecções por arbovírus, tais como o vírus da estomatite vesicular (VSV). Apesar da capacidade de VSV para replicar em uma ampla gama de inseto frequentes e hospedeiros mamíferos, VSV sofre uma infecção pós-entrada, abortiva em uma variedade de linhas de células derivadas de insetos lepidópteros, como a mariposa cigana (mariposa dispar). No entanto, essas infecções de VSV abortiva podem ser "resgatadas" quando as defesas antivirais de célula do hospedeiro estão comprometidas. Descrevemos como VSV cepas codificação genes repórter conveniente e restritivas dispar L. linhagens celulares podem ser emparelhadas com telas de configuração para identificar fatores do hospedeiro envolvidos na restrição de arbovírus. Além disso, mostramos também a utilidade dessas ferramentas de triagem na identificação dos fatores virally codificados que resgatar replicação VSV durante co-infecção ou por meio de expressão ectópica, incluindo aqueles codificada pelo vírus de mamíferos. A restrição natural de replicação de VSV nas células dispar L. fornece uma alta relação sinal-ruído quando rastreio para as condições que promovem o resgate VSV, permitindo assim o uso de simplista da luminescência e fluorescência-ensaios - based para monitorar as mudanças na replicação de VSV. Essas metodologias são valiosas para a compreensão da interação entre respostas antivirais hospedeiro e fatores de evasão imune viral.

Como um exemplo de aplicativos de imagem ao vivo-celular para monitorar o resgate VSV sobre co-infecção VACV, LD652 células foram banhadas em um prato de 8 poços septado e mock-infectado ou infectadas com VSV-DsRed (MOI = 1) na presença ou ausência de VACV-FL-GFP (MOI = 25). Porque VSV-DsRed expressa DsRed como livre de proteínas e não é fundido para proteínas estruturais de VSV (figura 1A), só é detectado após a expressão de gene e entrada VSV inicia. Todas ...

Aqui, apresentamos os protocolos para identificar imunomoduladores 1) vírus-codificado que promovem a replicação de arbovírus e fatores do hospedeiro 2) eucariota que restringem a replicação de arbovírus. Esses métodos baseados em fluorescência e luminescência permitem aos investigadores para rapidamente obter leituras quantitativas de replicação de arbovírus em simplistas ensaios com baixa relação sinal-ruído.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia viral, tais como, quais fatores do hospedeiro restringem a replicação do arbovírus e, por sua vez, quais proteínas de evasão imunológica codificadas por vírus superam esses mecanismos de restrição do hospedeiro. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite usar ensaios simplistas de luminescência e espaço fluorescente para definir as condições celulares que permitem que os arbovírus se repliquem em uma infecção abortiva em células de insetos lepidópteros. Como há uma replicação mínima de arbovírus em células de lepidópteros, torna-se relativamente simples detectar condições que permitam a replicação do arbovírus.Para começar, mantenha as células LD652 em placas tratadas com cultura de tecidos de 10 centímetros e passe as células quando atingirem 80% de confluência. Pipetar repetidamente o meio sobre a monocamada celular para desalojar as células e, em seguida, diluir a amostra em meio de crescimento até uma densidade aproximada de 100 mil células por mililitro. Depois disso, transfira um mililitro da cultura diluída para cada poço de uma placa de 24 poços.Em seguida, deixe as células assentarem por

arbovirus-infections-as-screening-tools-for-identification-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Novos fatores hospedeiro envolvidos na infecção viral podem ser identificados através de células baseado em perda de todo o genoma da função de triagem RNAi.

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

O Virochip é um microarray pan-viral projetado para detectar simultaneamente todos os vírus conhecidos, bem como novos vírus, com base em homologia de seqüência conservada. Aqui demonstramos como executar um ensaio Virochip para analisar amostras clínicas para a presença de vírus conhecidos e desconhecidos.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

Três ensaios, incluindo o efeito citopático (CPE) baseado em ensaio, o ensaio de dose-resposta e (TOA) ensaio de Tempo-de-adição ter sido desenvolvido, optimizado e validado e utilizado para identificar novos medicamentos antivirais contra o vírus da febre catarral (VFC), bem como para determinar o possível mecanismo de ação-de-(MOA) para antivirais recentemente identificados.

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

Os ensaios in vitro para medir a replicação do vírus tem sido melhorada pelo desenvolvimento de vírus de RNA recombinantes que expressam luciferase ou outras enzimas capazes de bioluminescência. Aqui detalhamos uma triagem gasoduto de alto rendimento, que combina essas linhagens recombinantes de sarampo e vírus chikungunya para isolar os antivirais de amplo espectro de bibliotecas químicas.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

Aqui, apresentamos um protocolo que examina etapas específicas da entrada viral para identificar e avaliar novos agentes antivirais.

No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

O objetivo do protocolo é demonstrar as técnicas utilizadas para investigar a doença viral, isolando e quantificando o vírus Zika, de múltiplos órgãos em um camundongo após a infecção.

Isolamento e quantificação do vírus Zika de múltiplos órgãos em um mouse

O objetivo do protocolo é ilustrar os diferentes ensaios relativos à entrada viral que podem ser utilizados para identificar os inibidores da entrada viral do candidato.

Uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16

Neste trabalho, descrevemos os protocolos usados em ensaios baseados em enzimas cílicas e virais para triagem de inibidores da replicação do vírus Zika em um formato de triagem de alto rendimento.

Ensaios antivirais de alta produtividade para tela para inibidores da replicação do vírus Zika

Os imunoensaios de fluorescência multiplex estão se tornando uma referência para testes sorológicos. Sua aplicação, no entanto, é limitada pela complexidade e pelos demorados processos de acoplamento de analitos de esferas. Este relatório apresenta um protocolo de acoplamento de esferas de microesferas multiplex semiautomatizado e reprodutível que é comparável ao método padrão, reduzindo consideravelmente o tempo de resultados.

Um ensaio sorológico multiplex para a detecção de respostas de anticorpos a arbovírus

Este artigo descreve a metodologia para gerar partículas pseudotipadas de SARS-CoV-2 usando um sistema repórter de luciferase e seu uso para identificar inibidores de entrada. Esses protocolos são demonstrados usando dois diferentes inibidores de entrada, uma proteína de fusão humana recombinante ACE2-Fc e o composto de pequenas moléculas arbidol.

Procedimentos para a Identificação de Inibidores de Entrada do SARS-CoV-2 como Potenciais Antivirais Utilizando Pseudovírus Baseados em MLV

Aprenda a identificar fatores antivirais do hospedeiro e imunomoduladores virais usando ensaios de luminescência e fluorescência em células de insetos lepidópteros LD652. Este método permite estudar a replicação de arbovírus em condições controladas.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

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