Name: Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda um método baseado em molde para criar tecidos cardíacos tridimensionais sem andaime usando esferoides. Esta técnica eficiente produz tecidos com integridade estrutural e batimento síncrono para pesquisa em engenharia de tecidos cardíacos.

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Os autores reconhecem o seguinte fonte de financiamento: o fundo magia que questões de investigação Cardiovascular.

1. preparação dos Cardiomyocytes
<ol><li>Placas de 6 boas casaco com membrana basal matriz e cultura induzida por humanos células estaminais pluripotentes (hiPSCs) como descrito anteriormente17.</li>
	<li>Diferencie hiPSCs em hiPSC-CMs usando métodos anteriormente descritos,18.</li>
	<li>Pós-diferenciação d 16-18, suspender a aplicação do cardiomyocytes enxaguando cada poço com 2 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x sem cálcio ou magnésio, seguido de incubação com 1ml/bem de tripsina ou célula reagente de dissociação (ver tabela de de Materiais) por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Neutralizar o reagente de dissociação de tripsina ou célula (veja a Tabela de materiais) usando um volume igual de mídia de célula de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com B-27 (mídia de células RPMI/B-27). Pipete para cima e para baixo para afrouxar as células aderidas.</li>
	<li>Recolher o cardiomyocytes suspenso com uma pipeta sorológica de 10 mL e transfira para um tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente para obter um centrifugado.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 10 mL de RPMI/B-27 mídia de célula.</li>
	<li>Combinar a 20 µ l de suspensão de células com uma quantidade igual de solução de azul de Tripan 0,4% e misture delicadamente.</li>
	<li>Use um hemocytometer manual para contar e obter a concentração e a célula viabilidade da suspensão celular.</li>
</ol>2. preparação dos fibroblastos
<ol><li>Inicie uma cultura de uma linhagem de células humanas fibroblastos cardíacos (HCF) (tipo ventricular adulto) conforme descrito anteriormente,16.</li>
	<li>Suspender os HCFs incubando-os com uma quantidade adequada de tripsina ou célula reagente de dissociação (ver Tabela de materiais) durante 5 min à temperatura ambiente16. Para um balão de T175, utilizou-se 10 mL de reagente de dissociação de tripsina ou célula.</li>
	<li>Neutralizar o reagente de dissociação de tripsina ou célula (veja a Tabela de materiais) usando um volume igual de médio, então transferir a amostra para um tubo cónico de 50 mL e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente para obter uma pelota.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 10 mL de meio de crescimento do fibroblasto (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Combinar a 20 µ l de suspensão de células de HCF com uma quantidade igual de solução de azul de Tripan 0,4% e misture delicadamente.</li>
	<li>Use um contador de célula automatizada ou manual hemocytometer para contar e obter a concentração e célula viabilidade da nova suspensão celular.</li>
</ol>3. preparação de células endoteliais
<ol><li>Inicie uma cultura de uma linhagem de células endoteliais (HUVEC) de veia umbilical humana conforme descrito anteriormente,17. Suspender o HX incubando-os com uma quantidade adequada de tripsina ou célula reagente de dissociação (ver Tabela de materiais) para 3 min a temperatura da sala17. Neutralizar o reagente de dissociação de tripsina ou célula (veja a Tabela de materiais) usando um igual volume de meio, em seguida, transferir para um tubo cónico de 50 mL e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente para obter uma pelota. Nota: Para um balão de T175, 10 mL de reagente de dissociação de tripsina ou célula foi usado.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 10 mL de meio de cultura de células endoteliais (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Combinar a 20 µ l de suspensão de HUVEC e manchá-la com uma quantidade igual de solução de azul de Tripan 0,4% e misture delicadamente.</li>
	<li>Use um contador automatizado de células ou um hemocytometer manual para contar e obter a concentração e a célula viabilidade da suspensão celular.</li>
</ol>4. criação de esferoides gota de suspensão
<ol><li>Coloque o enforcamento gota dispositivo que contém 850 microporos (cada um com um diâmetro de 350 µm) em placas de 6 boas estéril.</li>
	<li>Isolar os três tipos de células, como descrito acima: hiPSC-CMs, HCFs e HX. Combiná-los em uma proporção de 70% de iPSC-CMs, 15% HCFs e HX de 15% em um tubo cónico de 50 mL com mídia de células RPMI/B-27 com uma concentração de 2.475.000 células por mL.</li>
	<li>Dispense a 4 mL de suspensão de célula (2.475.000 células / mL) a cada poço de penhora ultra baixo pendurado sistema da gota, (com um diâmetro de micropore de 350 µm), sentado em uma placa de 6.</li>
	<li>Esferoides formarão espontaneamente dentro de 12 h de dispensar a suspensão de células para o enforcamento dispositivo de gota. Continue a cultura para um total de 72 h (3-d), a 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2para a maturação dos esferoides.</li>
	<li>Após 72 h da cultura, colher os esferoides através dos poros na parte inferior do enforcamento descarta sistema colocando o dispositivo em um prato com médio e rodando-o suavemente para liberar os esferoides de enforcamento dispositivo de gota.</li>
</ol>5. 3-d Patch criação usando o molde líquido romance
<ol><li>A base, placa quadrada de fundo, fundo líquido e 10 lado em camadas, as redes são montadas para criar o romance molde com o auxílio de um par de Pinças esterilizadas. Primeiro, empilhar e alinhe a base, a placa de fundo quadrado e inferior a net usando os bornes de canto. Em seguida, pilha e as redes de 10 lado alternando as direções para criar uma rede de pinos de aço fino de camada.</li>
	<li>Irrigue o enchimento da base com PBS ou meio para reduzir a tensão superficial e, em seguida, transferir o molde montado sobre a base de enchimento.</li>
	<li>Molhe a cavidade do molde líquido com PBS ou médio no mesmo método. Encher lentamente os esferoides na cavidade pressuposta do tamanho desejado (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, ou 6 x 6 x 1 mm). Nota: Certifique-se que 120% do volume previsto de esferoides é alimentado na cavidade, para que os agregados de células estão em conexão apertada e permanecer estáticos.</li>
	<li>Montar a rede top e top placa quadrada sobre os bornes de canto e fixe as rolhas e tubos de exploração para evitar um fiasco dos esferoides.</li>
	<li>Transferi o sistema de molde líquido enchido para uma placa de 6 com 6 mL de RPMI/B-27 mídia de célula ou em um recipiente estéril com suficiente médio para cobrir o molde todo montado.</li>
	<li>Incube a placa com o sistema de molde preenchido num agitador balançando 6 7-10 dias a 3.000-4.000 x g. Nota: A duração da incubação é decidida pelo tamanho dos patches cardíacos. Com manchas maiores, o tempo de incubação precisará ser aumentada para maturação de remendo cardíaca.</li>
</ol>6. remoção do Patch do romance molde líquido
<ol><li>Remover o sistema de molde da mídia e coloque-o sobre o tapete de manipulação esterilizado em um prato de 10 cm estéril.</li>
	<li>Remova o tubo de exploração, rolhas, a placa superior do quadrado e net top. Cuidadosamente retire as redes de lado em camadas, um a um com um par de Pinças esterilizadas. Após a descanulação, um remendo cardíaco intacto é obtido no topo do líquido do fundo.</li>
	<li>Buscar o fundo líquido com o patch usando pinça estéril e transferir o líquido do fundo em um prato de 35 mm com 5 mL de RPMI/B27 mídia. Afrouxe delicadamente o patch do fundo líquido agitando lentamente na net no prato, ou com um raspador de pilha de estéril. Após o desprendimento do fundo líquido, o tecido cardíaco pode ser cultivado com RPMI/B27 mídia.</li>
	<li>Continue a incubar o patch cardíaco 3D flutuante no prato 35mm. Batendo síncrono funcional pode ser observado logo em 24 h após a remoção do molde.</li>
	<li>Depois de remover o patch do molde líquido, observe que sua forma é mantida com a integridade e a intensidade de espancamento síncrona aumenta com o tempo. Nota: Os patches cardíacos baseada em molde líquidos 3D exibiram integração elétrica do componente cardiospheres após a descanulação. Observamos uma surra frequência variando de 60 a 80 batimentos por minuto que persistiu por mais de 60 dias.</li>
</ol>

<ol><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like%2C+High-Resolution%2C+3-Dimensionally+Printed+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li>
<li>Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Microscale+Devices+to+3D+Printing%3A+Advances+in+Fabrication+of+3D+Cardiovascular+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues.</a> Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).</li>
<li>Tandon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+systems+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering.</a> Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).</li>
<li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Medicine%2FCardiac+Cell+Therapy%3A+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li>
<li>Lux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+of+large-scale+cardiac+patches+based+on+a+perfusable+starter+matrix+by+cyclic+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation.</a> Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).</li>
<li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstitution+of+embryonic+cardiomyocytes+in+a+collagen+matrix%3A+a+new+heart+muscle+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system.</a> The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).</li>
<li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).</li>
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<li>Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+human+heart+fibroblasts+in+culture%3A+a+comparative+study+of+growth%2C+proliferation+and+collagen+production+in+human+and+rabbit+cardiac+fibroblasts+and+their+response+to+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1.</a> Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).</li>
<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick%2C+vascularized+myocardial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li>
<li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+number+per+spheroid+and+electrical+conductivity+of+nanowires+influence+the+function+of+silicon+nanowired+human+cardiac+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).</li>
<li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li>
<li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes%3A+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O significado deste método reside na sua reprodutibilidade e a eficácia do tecido cardíaco resultante em várias camadas. No campo da engenharia de tecido cardíaco, uma das metas do atuais é identificar um método para construir batendo, várias camadas e funcionais patches cardíacas em 3D. Nós relatamos um método eficiente e reprodutível de criação de várias camadas de tecidos cardíacos por sementeira directa manual de esferoides compostas de fibroblastos, células endoteliais e cardiomyocytes num romance molde líquido. O m...

O objetivo da engenharia de tecido cardíaco atual é desenvolver uma terapia para substituir ou reparar a estrutura e função do tecido lesado do miocárdio1. Métodos para criar modelos 3D de tecido cardíaco, exibindo as propriedades contráteis e eletrofisiológicas importantes do tecido cardíaco nativo tem sido rápida expansão2,3. Uma variedade de estratégias foram explorados e utilizados em estudos de4,5. Esses métodos variam o uso do específico hidrogel bioativos naturais e sintéticas, tais como gelatina, colágeno, fibrina e peptídeos6, a bio-tinta deposição tecnologias2 e bioprinting tecnologias7.
Ficou demonstrado que métodos livre de andaime podem produzir tecidos comparáveis como métodos baseados em biomateriais, sem os inconvenientes de incorporação de material estrangeiro andaimes8. Oren Caspi et al demonstraram que a incorporação de vários tipos de células permite a geração de tecido cardíaco engenharia humano altamente vascularizado9. Chin et al desenvolveram um método de impressão 3D para criação de remendo cardíaca de esferoides. Resultante de patches são compostas de cardiomyocytes, fibroblastos e células endoteliais em uma relação de 70:15:1510. Esferoides foram mostrados para ser eficazes "blocos de construção" da criação de tecido cardíaco andaime-livre, como eles são resistentes contra hipóxia e possuem integridade mecânica suficiente para implantação de11,12. Estudos anteriores têm demonstrado vários métodos de fabricação para criação de esferoide, incluindo o uso do enforcamento soltar método, girador frascos13, microfluidic sistemas14e superfícies não-aderente cultura não revestidos ou revestidos com micromoldes de agarose15. Neste protocolo, usamos o enforcamento gota dispositivo, que contém microporos para centenas de esferoides de condensação de uma só vez.
Este estudo apresenta uma nova e eficiente método de andaime-livre para a criação de tecido cardíaco, que inclui a semeadura manualmente os esferoides em uma cavidade do molde quadrado e incubando o tecido num agitador para maturação. Em condições habituais de cultura estática, difusão de oxigênio é limitada aos aspectos exteriores da construção de tecido, resultando em necrose central. No entanto, com o molde líquido, todos os esferoides semeados no molde estão imersos na mídia com um constante movimento fluídico, permitindo a maior difusão de nutrientes e oxigênio. Além disso, este método baseado em molde permite a criação simultânea de patches de tecido de diferentes tamanhos, com o mínimo de esforço manual e o tecido resultante pode ser facilmente removido do molde. Este novo método permite a criação eficiente e reprodutível de patches cardíacas andaime-livre, em várias camadas.

<table><tbody><tr><td>Fibroblastos cardíacos humanos (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 Consiste em meio basal</td><td>Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF meio de cultura</td></tr><tr><td>Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM+Bullet Kit&nbsp;</td><td>Meio de cultura</td> <td>Lonza</td><td>CC5035</td> HUVEC</tr><tr><td>E8 media&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1517001</td><td>meio de cultura HiPSC</td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>Meio RPMI de reagente de dissociação de tripsina e célula</td></tr><tr>O meio<td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>com suplemento B-27 é um meio de cultura hiPSC-CM</td></tr><tr><td>suplemento B-27 (50x)</td>O meio RPMI <td>17504044</td> <td>Thermo Fisher</td><td>com suplemento B-27 é um meio de cultura hiPSC-CM</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solução, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Novo molde de rede&nbsp;</td><td>TissueByNet Co.,Ltd</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>Placa suspensa</td><td>Kuraray Co.,Ltd</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 poços&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table>

um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Este protocolo descreve um romance e método baseado no molde líquido fácil criar tridimensional (3D) cardíaca os tecidos sem material adicional do andaime. Cardiomyocytes de tronco-derivado de células pluripotentes induzidas pelo homem (iPSC-CMs), fibroblastos cardíacos humanos (HCFs) e células endoteliais da veia umbilical humana (HX) são isoladas e usadas para gerar uma suspensão de células com 70% iPSC-CMs, HCFs 15% e 15% HX. Eles são co cultivados em um sistema de fixação ultra baixo "gota de suspensão" que contém microporos para centenas de esferoides de condensação de uma só vez. As células agregam e formam espontaneamente esferoides surra após 3 dias de co-cultura. Os esferoides são colhidas, semeados em uma cavidade do molde de romance e cultivadas num agitador na incubadora. Os esferoides tornar-se um tecido maduro funcional, aproximadamente 7 dias após a semeadura. Os tecidos resultantes de várias camados consistem de esferoides fundidos com integridade estrutural satisfatória e comportamento batendo síncrono. Este novo método tem um potencial promissor como um método reprodutível e de baixo custo para criar tecidos projetados para o tratamento da insuficiência cardíaca no futuro.

Em nossos experimentos, utilizamos uma suspensão de células de iPSC-CMs de 70% e 15% HCFs HX de 15% na mídia de células RPMI/B-27 com uma concentração de 2.475.000 células por mL. Depois de criar a suspensão de eritrócitos, demitiremos 4 mL de suspensão de célula para cada poço de penhora ultra baixo pendurado o sistema de entrega, conforme descrito na etapa 4.3 do protocolo. O uso do enforcamento gota sistema resultou na formação espontânea de centenas de bater esferoides após 3 dias de ...

Este protocolo descreve um método baseado em molde líquido para criar tecidos cardíacos livre de andaime tridimensionais com integridade estrutural satisfatória e comportamento batendo síncrono.

Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Este protocolo descreve um método novo e fácil baseado em molde para a criação de tecido cardíaco tridimensional, que usa esferoides como uma ferramenta para a criação de tecido cardíaco livre de andaimes. Em nossos experimentos, três tipos de células, cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, fibroblastos cardíacos humanos e células endoteliais da veia umbilical humana foram isolados e usados para gerar uma suspensão celular. Com 70% de cardiomiócitos, 15% de fibroblastos e 15% de células endoteliais, em tubo cônico de 50ML.Em seguida, dispensamos a suspensão celular em cada poço de um sistema de gota suspensa de fixação ultrabaixa, o que resultará na formação espontânea de centenas de esferóides batendo após três dias. Os esferóides são então colhidos e assentados em uma nova cavidade de molde. O tecido é então mantido em um recipiente estéril com meio, em um agitador na incubadora por vários dias.O molde é posteriormente removido, resultando em um remendo de tecido livre de andaimes com integridade mecânica. O dispositivo de gota suspensa é um poço de fixação ultra baixo reutilizável com 850 microporos, cada um com um diâmetro de 350 mícrons. A gota de suspensão é compatível com as placas padrão de seis poços.Depois de fazer a suspensão celular, dispensamos quatro mililitros de suspensão celular contendo 10 milhões de células, para cada poço do sistema de gota suspensa. Os dispositivos são cultivados a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Após 72 horas, observa-se a formação espontânea de esferóides batedores, com diâmetro médio de 350 mícrons.Os esferóides são colhidos colocando o dispositivo de gota suspensa em outro prato com meio e girando suavemente para liberar os esferóides e permitir que eles flutuem pelos poros na parte inferior do sistema de gota suspensa. Este é um esquema do novo molde para criação de tecido cardíaco tridimensional, livre de andaimes. Inclui o tapete de manuseio, a base de enchimento e o novo molde.O novo molde é composto por uma base, uma placa quadrada inferior, uma rede inferior, 10 camadas de redes laterais feitas com pinos finos de aço inoxidável. Uma rede superior, uma placa quadrada superior, os tubos de retenção e os pinos de rolha. O sistema Novel Mold pode criar diferentes tamanhos de tecidos, incluindo dois por dois milímetros, quatro por quatro milímetros e seis por seis milímetros.A placa quadrada inferior da base e a rede inferior são empilhadas e alinhadas usando os postes de canto. 10 camadas de redes laterais são então empilhadas em direções alternadas para criar uma rede de pinos finos de aço inoxidável, com o auxílio de um par de pinças estéreis. A base de enchimento é então lavada com solução tampão de fosfato 1X, ou PBS, para reduzir a tensão superficial antes de assentar os esferoides no novo molde.Depois de umedecer a nova cavidade do molde no mesmo metano, os esferóides são assentados na cavidade pressuposta do tamanho desejado. Ao assentar, o excesso de meio é drenado através do molde da rede, permitindo que os esferoides se encham e assumam a forma da cavidade predefinida. A rede superior e a placa quadrada superior são então montadas nos postes de canto e os pinos de rolha e os tubos de retenção são fixados, para evitar a lavagem dos esferóides.O novo sistema de molde preenchido é transferido para uma placa de seis poços, com seis milímetros de meio suplementado com B-27, e então mantido na incubadora em um agitador oscilante por sete a dez dias, a 30 a 40 RPM. A duração da incubação pode ser alterada, dependendo do tamanho do adesivo cardíaco. Após a incubação, o sistema é retirado e o tubo de retenção, as rolhas, a placa quadrada superior e a rede superior são removidos.As redes laterais em camadas são então cuidadosamente deslizadas uma a uma, tomando cuidado para não romper o tecido. Após a remoção de todas as redes laterais, um adesivo cardíaco intacto é obtido no topo da rede inferior. O batimento síncrono funcional é observado dentro de 24 horas.Este novo método baseado em molde é um método eficiente e fácil de criar tecidos cardíacos tridimensionais livres de andaimes, com o mínimo de esforço manual. Os tecidos multicamadas resultantes consistem em esferóides fundidos com integridade estrutural satisfatória e comportamento de batimento síncrono. Este novo método baseado em molde apresenta uma alternativa econômica e escalável aos métodos atuais de biofabricação de tecidos projetados.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de substratos biomiméticos de cultura de células cardíacas feitos de dois materiais poliméricos distintos usando litografia de força capilar.  Os métodos descritos fornecem uma técnica escalável e econômica para projetar a estrutura e a função dos tecidos cardíacos macroscópicos para aplicações in vitro e in vivo.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

A geração de alinhados tecido do miocárdio é um requisito fundamental para a adaptação dos avanços recentes em biologia de células-tronco para fins clinicamente úteis. Descrevemos aqui uma abordagem impressão microcontact para o controlo preciso da forma e função celular. Usando populações altamente purificadas de células-tronco embrionárias derivadas progenitores cardíacos, nós, então, gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio.

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Nestes estudos, que fornecem metodologia para novos, neonatal, andaimes cardíacas murinas para uso em estudos de regeneração.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa

Este protocolo descreve a bioprinção 3D do tecido cardíaco sem o uso de biomateriais. Os remendos cardíacos bioprinted 3D apresentam integração mecânica de esferóides componentes e são altamente promissores na regeneração do tecido cardíaco e como modelos 3D de doenças cardíacas.

Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

O presente protocolo gera tecidos cardíacos projetados em forma de malha contendo células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para permitir a investigação da terapia de implantação celular para doenças cardíacas.

Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

Aqui, descrevemos uma metodologia fácil de usar para gerar matrizes microtissue cardíacas auto-montadas em 3D compostas de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Esta técnica de necessidade de células fáceis de usar e baixas para gerar microtissues cardíacas pode ser implementada para modelagem de doenças e estágios iniciais do desenvolvimento de medicamentos.

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

Os tecidos projetados dependem fortemente de redes vasculares adequadas para fornecer nutrientes e gases vitais e remover resíduos metabólicos. Neste trabalho, um protocolo de semeadura passo a passo de células endoteliais e células de suporte cria redes vasculares altamente organizadas em uma plataforma de alta produtividade para estudar o desenvolvimento do comportamento da embarcação em um ambiente 3D controlado.

Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

O objetivo deste protocolo é explicar e demonstrar o desenvolvimento de um modelo microfluido tridimensional (3D) de tecido cardíaco humano altamente alinhado, composto por cardiomiócitos derivados de células-tronco co-cultivados com fibroblastos cardíacos (CFs) dentro de um hidrogel biomimético, à base de colágeno, para aplicações em engenharia de tecido cardíaco, triagem de medicamentos e modelagem de doenças.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

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Criação de modelos cardíacos de silicone específicos do paciente com aplicações em planos pré-cirúrgicos e treinamento prático

Um método reprodutível é apresentado para gerar tecidos miocárdicos 3D combinando scaffolds de escrita eletrospinning (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogéis de fibrina com cardiomiócitos e fibroblastos derivados de hiPSC. Essa técnica oferece controle preciso sobre a arquitetura do andaime e pode ser aplicada em testes pré-clínicos de medicamentos e modelagem de doenças cardíacas.

Geração de tecido miocárdico humano 3D usando escrita eletrogiratória por fusão de andaimes de policaprolactona e células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprenda um método baseado em molde para criar tecidos cardíacos tridimensionais sem andaime usando esferoides. Esta técnica eficiente produz tecidos com integridade estrutural e batimento síncrono para pesquisa em engenharia de tecidos cardíacos.

Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco

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