Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco

Este protocolo descreve um método novo e fácil baseado em molde para a criação de tecido cardíaco tridimensional, que usa esferoides como uma ferramenta para a criação de tecido cardíaco livre de andaimes. Em nossos experimentos, três tipos de células, cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, fibroblastos cardíacos humanos e células endoteliais da veia umbilical humana foram isolados e usados para gerar uma suspensão celular. Com 70% de cardiomiócitos, 15% de fibroblastos e 15% de células endoteliais, em tubo cônico de 50ML.

Em seguida, dispensamos a suspensão celular em cada poço de um sistema de gota suspensa de fixação ultrabaixa, o que resultará na formação espontânea de centenas de esferóides batendo após três dias. Os esferóides são então colhidos e assentados em uma nova cavidade de molde. O tecido é então mantido em um recipiente estéril com meio, em um agitador na incubadora por vários dias.

O molde é posteriormente removido, resultando em um remendo de tecido livre de andaimes com integridade mecânica. O dispositivo de gota suspensa é um poço de fixação ultra baixo reutilizável com 850 microporos, cada um com um diâmetro de 350 mícrons. A gota de suspensão é compatível com as placas padrão de seis poços.

Depois de fazer a suspensão celular, dispensamos quatro mililitros de suspensão celular contendo 10 milhões de células, para cada poço do sistema de gota suspensa. Os dispositivos são cultivados a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Após 72 horas, observa-se a formação espontânea de esferóides batedores, com diâmetro médio de 350 mícrons.

Os esferóides são colhidos colocando o dispositivo de gota suspensa em outro prato com meio e girando suavemente para liberar os esferóides e permitir que eles flutuem pelos poros na parte inferior do sistema de gota suspensa. Este é um esquema do novo molde para criação de tecido cardíaco tridimensional, livre de andaimes. Inclui o tapete de manuseio, a base de enchimento e o novo molde.

O novo molde é composto por uma base, uma placa quadrada inferior, uma rede inferior, 10 camadas de redes laterais feitas com pinos finos de aço inoxidável. Uma rede superior, uma placa quadrada superior, os tubos de retenção e os pinos de rolha. O sistema Novel Mold pode criar diferentes tamanhos de tecidos, incluindo dois por dois milímetros, quatro por quatro milímetros e seis por seis milímetros.

A placa quadrada inferior da base e a rede inferior são empilhadas e alinhadas usando os postes de canto. 10 camadas de redes laterais são então empilhadas em direções alternadas para criar uma rede de pinos finos de aço inoxidável, com o auxílio de um par de pinças estéreis. A base de enchimento é então lavada com solução tampão de fosfato 1X, ou PBS, para reduzir a tensão superficial antes de assentar os esferoides no novo molde.

Depois de umedecer a nova cavidade do molde no mesmo metano, os esferóides são assentados na cavidade pressuposta do tamanho desejado. Ao assentar, o excesso de meio é drenado através do molde da rede, permitindo que os esferoides se encham e assumam a forma da cavidade predefinida. A rede superior e a placa quadrada superior são então montadas nos postes de canto e os pinos de rolha e os tubos de retenção são fixados, para evitar a lavagem dos esferóides.

O novo sistema de molde preenchido é transferido para uma placa de seis poços, com seis milímetros de meio suplementado com B-27, e então mantido na incubadora em um agitador oscilante por sete a dez dias, a 30 a 40 RPM. A duração da incubação pode ser alterada, dependendo do tamanho do adesivo cardíaco. Após a incubação, o sistema é retirado e o tubo de retenção, as rolhas, a placa quadrada superior e a rede superior são removidos.

As redes laterais em camadas são então cuidadosamente deslizadas uma a uma, tomando cuidado para não romper o tecido. Após a remoção de todas as redes laterais, um adesivo cardíaco intacto é obtido no topo da rede inferior. O batimento síncrono funcional é observado dentro de 24 horas.

Este novo método baseado em molde é um método eficiente e fácil de criar tecidos cardíacos tridimensionais livres de andaimes, com o mínimo de esforço manual. Os tecidos multicamadas resultantes consistem em esferóides fundidos com integridade estrutural satisfatória e comportamento de batimento síncrono. Este novo método baseado em molde apresenta uma alternativa econômica e escalável aos métodos atuais de biofabricação de tecidos projetados.