Name: Humanizado NOD/SCID/IL2rγnula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a estababelecer camundongos humanizados hu-NSG para pesquisa do HIV usando células-tronco hematopoéticas CD34+. Este modelo permite estudar replicação viral, latência e terapia antirretroviral combinada.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health [conceder números R01AI29329, R01AI42552 e R01HL07470 para J.J.R.] e Instituto Nacional de câncer do institutos nacionais da saúde [número de concessão P30CA033572 para apoiar a cidade de Hope Integrative Genomics Farmacologia analítica e núcleos de análise Cytometry]. O reagente a seguir foi obtido através de NIH AIDS Programa de pesquisa e referência reagente, divisão de AIDS, NIAID, NIH: vírus HIV BaL.

Todos os cuidados com animais e os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos revisto e aprovado pela cidade de esperança Animal cuidados institucionais e Comissão de utilização (IACUC) realizada pelo investigador principal deste estudo (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Tecido do fígado fetal humano foi obtido de avançados recursos de Biociências (Alameda, CA), uma organização sem fins lucrativos, em conformidade com as regulamentações federais e estaduais. O fornecedor tem o seu próprio institucional Review Board (IRB) e está em conformidade com os requisitos de proteção do sujeito humano. PBMC humano é isolado de amostras de sangue periférico descartados de doadores saudáveis anônimos da cidade de Hope sangue doador Center (Duarte, CA), com nenhuma identificação em relação a idade, raça, sexo ou etnia. IRB #/ REF #: 97071/075546
1. general prática asséptica
<ol><li>Realizar experimentos de cultura de tecidos em armários designado fluxo laminar.</li>
	<li>Manter o meio de cultura de tecido e suplementos em condições estéreis e filtrar usando um antes de unidade de filtração de 0,22 µm para usar.</li>
	<li>Linfócitos humanos preparados em tubos estéreis de preservar e manter no gelo até injeção.</li>
	<li>Como resultado de severa deficiência imunológica, lidar com ratos NSG assepticamente. Use um vestido de cirurgia descartável, touca, máscara facial, tampas da sapata e luvas para evitar contaminação. Limpar a superfície da bancada, titular da irradiação e câmara de indução de anestesia com esterilizante de à base de dióxido de cloro (por exemplo, Clidox) antes e depois de experiências.</li>
	<li>Aplica a pomada à base de petróleo após retrô-orbital de sangramento para evitar os olhos secos.</li>
	<li>Mudar de antibiótico contendo dieta para prevenir a infecção devido a sangramento retrô-orbital.</li>
</ol>2. manipulação de vírus do HIV, infectados, roedores e amostras de sangue/tecido contendo vírus
Atenção: O HIV é um patógeno humano classe 3; as manipulação de regras devem ser seguidas exatamente.
<ol><li>Lidar com amostras contendo vírus de HIV em um designado BSL2 + / espaço de laboratório 3. Bloquear vírus contendo reagentes firmemente em um recipiente secundário durante o transporte. Desinfecte a superfície exterior de todos os recipientes limpando completa com 10% de lixívia e isopropanol antes do transporte.</li>
	<li>Manter todos os resíduos que contenham vírus no contentor de lixo designado com 2-3 camadas de sacos de resíduos de risco biológico. Antes da eliminação de resíduos, desinfecte pulverizando generosamente os resíduos com solução de nonilfenol etoxilado/iodo (por exemplo, Wescodyne) e autoclave.</li>
	<li>Utilize equipamento de protecção pessoal: touca, capa de rosto, protetor de cara antirespingo, tampas da sapata, vestido de cirurgia descartáveis e luvas de camada dupla.</li>
	<li>Lidar com roedores infectados com extrema cautela. Conduta injeções e coleções de sangue, enquanto os ratos estão sob anestesia (etapas 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3 e 8,1-8,2).</li>
</ol>3. isolamento de células-tronco hematopoiéticas
<ol><li>Prepare a solução de colagenase/dispase para a digestão do tecido.<ol>
<li>Dissolver o pó de colagenase/dispase para fazer a solução em uma concentração de 100 mg/mL e armazenar a solução-mãe de colagenase/dispase em 150 alíquotas µ l a-20 ° C.</li>
		<li>Para trabalhar a solução de colagenase, dilua 150 µ l de caldo de colagenase/dispase com 15 mL de RPMI 1640 suplementado com FCS de 10% e 1% penicilina/estreptomicina. Nota: A concentração final de colagenase/dispase para a digestão do tecido é de 1 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Com uma lâmina de barbear estéril, corte tecido hepático fetal (16-24 semanas de gestação) em pedaços pequenos (aproximadamente 2-3 mm3 no tamanho) seguido de digestão com solução de colagenase/dispase (1 mg/mL) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Ajuste o volume da solução de digestão para que todas as peças de tecido são totalmente submerso. Use o back-end do êmbolo da seringa para suavemente moer a amostra de tecido para facilitar a digestão.</li>
	<li>Passe a mistura de digestão através de um filtro de malha de nylon estéril de 70 µm para adquirir uma suspensão de célula única.</li>
	<li>Enriquece para CD34 + linfócitos usando um sistema de MACS por instruções do fabricante.</li>
	<li>Contar a porcentagem viável de linfócitos CD34 + enriquecido usando um hemacytometer28 e proceder a injeção colestase neonatais ratos NSG.</li>
	<li>Congelar o restante enriquecido CD34 + linfócitos no congelamento de mídia (por exemplo, CryoStor CS2) e preservar as células em um tanque de nitrogênio líquido. Sobre o uso futuro, recontar a porcentagem viável de descongelado CD34 + linfócitos antes da injeção. Com o uso de meios de congelamento, pós-degelo viabilidade é entre 80 a 90%.</li>
</ol>4. colestase injeção de linfócitos humanos CD34 + em camundongos NSG Neonatal
Nota: Ratos Neonatal NSG 2-3 dias do nascimento são mais adequados para este procedimento, como eles são fortes o suficiente para suportar a irradiação no metade-lethal dose, enquanto jovem suficiente para ter totalmente prejudicada sistemas imunitários. Sem anestesia é necessária para a injeção de HSC.
<ol><li>Coloque a ninhada inteira de ratos NSG neonatais (tipicamente 5-10 ratos, ambos os sexos) em uma gaiola de irradiação estéril em forma de torta e expor a uma dose total de 200-250 cGy radiação de raios gama de uma fonte de radiação do césio-137. Certifique-se a dose de radiação está dentro do intervalo, como perda de peso significativa ou até mesmo a morte pode ser observada quando os ratos NSG estão expostos a altas doses de irradiação. 12 Nota: A radiação é um perigo para a saúde, proteção pessoal contra a radiação deve ser tomada.</li>
	<li>Após a irradiação, injetar cada rato NSG neonatal com 5 x 105 viável humanas CD34 + linfócitos usando uma configuração de agulha/seringa (Figura 1). Diretamente, injete as células do fígado.</li>
</ol>5. enxertia validação através de Retro-Orbital de sangramento e análise de citometria de fluxo
<ol><li>A injeção de 10-12 semanas pós-HSC, anestesiamos ratos usando um aparelho de inalação de oxigênio/isoflurano. Ajuste o fluxo de oxigênio para manter a porcentagem de isoflurano em 4-5%. Anestesia leva 3-5 minutos, dependendo do mouse individual. Ratos anestesiados corretamente mostram um lento e padrão de respiração profunda e nenhuma reação à estimulação do dedo do pé-beliscar.</li>
	<li>Colete 50-100 µ l de sangue periférico de cada mouse através de de amostragem retrô-orbital28. Armazenar as amostras de sangue em K2EDTA ou tubos de colheita de sangue heparinizado para evitar a coagulação. Nota: Tubos de colheita de sangue são necessários ter revestimento anticoagulante para que o rato PBMCs podem ser isolados de sangue para análise de citometria de fluxo. EDTA é conhecido por inibir reações enzimáticas como a PCR e qRT-PCR; assim, se a jusante reações enzimáticas são necessárias, use um instrumento de coleta de sangue heparinizado.</li>
	<li>Centrifugar as amostras de sangue a 2.000 x g por 20 minutos a 4 ° C para as células do sangue de Pelotas.<ol>
<li>Transferi os sobrenadantes de plasma para novos tubos de microcentrifuga após centrifugação e loja a-80 ° C se a análise de citocinas é necessária.</li>
		<li>Lise os glóbulos vermelhos (hemácias) dentro o sangue centrifugado em temperatura ambiente por 10 minutos usando o tampão de lise de células vermelhas do sangue (Tabela de materiais). Nota: Se não exigidas, amostras de plasma lyse diretamente o sangue com a solução de Lise sem centrifugação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pelota restantes células de sangue depois da lise de RBC a 300 x g por 5 minutos a 4 ° C; Aspire o sobrenadante. Lave as pelotas de célula com 0.01% BSA contendo DPBS, centrifugar 300 x g por 5 minutos a 4 ° C e aspire o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.</li>
	<li>Bloco de células com 100 µ l de 1 x bloqueio cocktail (tabela 3 para receita) por 20 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Após o bloqueio, diretamente adicionar cada solução de anticorpo para a suspensão de células em uma concentração de 2 µ l/106 células e incubar a 4 ° C por 30 minutos. Anticorpos para validação de enxertia são: anti-humanos CD45 (leucócitos, RRID: AB_2732068), anti-humano CD3 (células-T, RRID: AB_396896), anti-humano CD4 (auxiliar as células-T, RRID: AB_397037), anti-humano CD8 (células T citotóxicas, RRID: AB_2722501), anti-humano CD14 (monócitos, RRID: AB_10373536) e anti-humanos CD19 (células-B, RRID: AB_10373382). Para painel de fluxo sugerido, por favor consulte tabela 4 e Tabela de materiais para números de catálogo, RRIDs e muito. Nota: Mancha do anticorpo em solução de bloqueio elimina a ligação não-específica dos anticorpos anti-humanos na direção de marcadores de superfície do mouse, como vários marcadores de superfície compartilhar homologia entre humanos e mouse.</li>
	<li>Isolar PBMCs humanos de doadores saudáveis e preparar manchada único fluxo cytometry controles de compensação usando purificada PBMCs humano... como alternativa, use microesferas de fluorescência-etiquetada como compensação controla29.</li>
	<li>Analisar as amostras de sangue periférico usando um citômetro de fluxo e quantificar a percentagem de células humanas CD45 +, CD3 + células humanas, CD14 + células humanas e CD19 + células humanas totais periféricas das células do sangue.<ol>
<li>Para a infecção de HIV a jusante e estudos de latência, calcule a porcentagem de células T CD4 + e CD8 + células T dentro das células CD3 +. Nota: Normalmente, uma relação CD4:CD8 entre 1,5 e 2,5 é observada antes da infecção de HIV30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. análise da infecção pelo HIV de hu-NSG ratos e Plasma carga Viral usando qRT-PCR
<ol><li>Propagar ações virais de HIV BaL em PBMC humano de doadores saudáveis, colheita de cada pós-infecção dia 10 e titula-se usando p24 ELISA kit31.</li>
	<li>Ratos de hu-NSG selecionar com mais de 20% humano CD45 + células no sangue periférico para a infecção pelo HIV.</li>
	<li>ANESTHETIZE ratos hu-NSG usando um aparelho de inalação de oxigênio/isoflurano (etapa 5.1).</li>
	<li>Depois de confirmar o animal é anestesiado, injetar o vírus HIV BaL na dose de 200 ng de p24 por rato por via intraperitoneal. Nota: Seja extremamente cauteloso com a agulha, não reutilizar agulhas e descartar imediatamente após o uso em recipiente ponto designado. Desinfecte o local da injeção após administração de vírus.</li>
	<li>Três semanas pós-infecção, anestesiar os ratos hu-NSG e coletar sangue periférico por meio retrô-orbital sangramento usando heparinizado tubos capilares e tubos de colheita.</li>
	<li>Plasma separado e as células do sangue por centrifugação a 2.000 x g por 20 minutos.</li>
	<li>Lisar hemácias. Block e mancha restantes células com anticorpos para análise de citometria de fluxo (seção 5.3-5.8). Nota: Análise de citometria de fluxo deve centrar-se em comparar a proporção de CD4:CD8 antes e após a infecção. Espera-se uma diminuição significativa na contagem de células CD4 +, como o CD4 antígeno serve como um receptor de co para a entrada viral.</li>
	<li>Utilização de amostras de plasma para analisar o HIV viral carregam usando qRT-PCR. Isole o RNA viral de amostras de plasma utilizando um kit mini do RNA viral. Executar qRT-PCR com primers específicos HIV-1 LTR e sonda define (detalhes de sequência na tabela 5), usando o protocolo do fabricante.</li>
</ol>7. oral administração de carrinho e validação de Viral supressão (opcional)
Nota: Este passo é opcional para as investigações sobre o prognóstico do HIV, virologia ou fisiopatologia relacionados com infecção durante a fase aguda da infecção. tratamento de carrinho de hu-NSG infectados pelo HIV é usado para recapitular a latência de HIV entre pacientes humanos, recebendo o carrinho. Ratos infectados pelo HIV com êxito hu-NSG recebem carrinho durante 4 semanas. O regime de carrinho consiste tenofovir disoproxil fumarato (TDF; 300 mg/cápsula), emtricitabina (FTC; 200 mg/cápsula) e raltegravir (RAL; 400 mg/cápsula). A dose de carrinho para o tratamento de camundongos infectados pelo HIV hu-NSG é ajustada de acordo com o corpo de superfície (tabela 1, equação 1, tabela 2)32.
<ol><li>Calcule a quantidade de cada medicação necessária para cada gaiola durante uma semana de tratamento, levando em consideração o volume da garrafa de água, o número de ratos em cada gaiola e uma ingestão média diária de água de 4 mL por rato. Nota: O ponto-chave nesta etapa é garantir que cada rato adquire sua dose diária dentro de 4 mL de água potável.</li>
	<li>Triture todos os três medicamentos com doses ajustadas em pó fino e dissolver a mistura do pó em água adoçada (por exemplo, Medidrop Suralose). Altere a garrafa de água semanalmente com cocktail fresco dissolvido carrinho fornecido em água adoçada. Nota: O pó de drogas não podem dissolver imediatamente, agitar vigorosamente para obter uma suspensão homogênea antes de retornar a garrafa para a gaiola de exploração.</li>
	<li>Coletar amostras de sangue periférico através de retro-orbital hemorragia a cada duas semanas e analisar os dois a relação de CD4:CD8 usando citometria de fluxo (seção 5.3-5.8) e a carga viral do plasma usando qRT-PCR (secção 6.6). Nota: Normalmente após 4 semanas de tratamento, a carga viral do plasma diminui para abaixo do limite de detecção e uma relação de CD4:CD8 típico é restaurada.</li>
</ol>8. validação de rebote Viral em cima do carrinho de retirada (opcional)
Nota: Este passo é fundamental para validar o modelo de latência, como rebote viral após retirada do carrinho fornece evidência direta de um reservatório de latência. Também é recomendável para servir como um experimento de controle para investigações terapêuticas em HIV suppressants de rebote.
<ol><li>Plano para a retirada do carrinho depois cargas virais de plasma das amostras de sangue periférico estão abaixo do limite de detecção e a relação CD4:CD8 é restaurada para um intervalo entre 1,5 e 2,5.</li>
	<li>Colete amostras de sangue periférico retrô-orbital sangrar a cada 2 semanas após a retirada do carrinho. Acompanhar de perto a mudança de cargas virais de plasma (secção 6.6) bem como a relação de CD4:CD8 (seção 5.3-5.8).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores divulgar sem conflitos de interesse.

Ratos imunodeprimidos incorporados com células/tecidos humanos apresentam características fisiológicas de humanos e são um enorme valor para estudos de patologia, fisiopatologia e Imunologia sobre doenças específicas de humanos. Entre várias cepas de ratos imunodeprimidos, o assentimento. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modelo é o mais imunodeficientes devido à sua falta de imunidade inata e adaptativa, bem como retirada do mouse específicas citocinas sinalização3<su...

Porque estabelecer modelos animais apropriados para doenças humanas é a chave para encontrar uma cura, modelos animais apropriados tempo foram perseguidos e melhorados ao longo do tempo. Foram desenvolvidas múltiplas variedades de imunocomprometidos murino modelos que permitem a enxertia de células humanas e/ou tecidos e a subsequente execução de funções humanizada1,2. Tais modelos de rato humanizado são críticos para investigações de doenças de humanos específicos3,4,5.
Adquirida síndrome da imunodeficiência (AIDS) resultantes de infecção com o vírus de imunodeficiência humana (HIV) é um exemplo. Antes da criação de modelos de rato humanizado, limitações éticas e técnicas limita-se a estudos animais pré-clínicos de HIV/AIDS para primatas não-humanos3. No entanto, as despesas elevadas e requisitos para tratamento especializado para tal animal dificultam estudos de HIV/AIDS em configurações acadêmicos típicos. HIV, principalmente, infecta células humanas CD4 + T e impacto sobre o desenvolvimento e respostas imunes de outras células imunes humanas tais como as células B, macrófagos e células dendríticas6; Portanto, pequenos modelos animais transplantados com sistema de imunológico humano funcional estão em alta demanda.
Um grande avanço veio em 1988, quando os ratos CB17 -scid com uma mutação Prkdcscid foram desenvolvidos e mostrou a enxertia bem sucedida do sistema imunológico humano1. Os resultados de mutação Prkdcscid em funções de células T e B defeituosa e um ablated sistema imune adaptativo em camundongos, possibilitando a enxertia de periférico humano sangue células mononucleares (PBMC), células-tronco hematopoiéticas (linfócitos), e os tecidos hematopoiéticos fetais7,8. No entanto, níveis baixos de enxertia frequentemente são observados neste modelo; causas possíveis são 1) residual atividade imune inata modulada através de assassinas naturais (NK)-células e 2) o desenvolvimento de estágio final de rato - e B-células T (leakiness)5. O desenvolvimento posterior do diabético não-obesos (ASSENTIMENTO)-modelo de ratoscid alcançado dramática para baixo-regulação da atividade de células NK; assim, é capaz de suportar um nível mais alto e mais sustentável enxertia de de componentes do sistema imunológico humano9. Ainda mais inibem ou impedem o desenvolvimento da imunidade inata, modelos de rato tendo truncamento ou nocaute total da interleucina-2 receptor γ-cadeia (Il2rg) no (ASSENTIMENTO) - fundoscid foram estabelecidas. Il2rg, também conhecido como comum do cytokine receptor γ-cadeia, é um componente indispensável de várias citocinas receptores10,11,12,13. Cepas como NOD. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) e NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) apresentam interrupção robusta de rato citocinas sinalização e ablação completa do desenvolvimento de células NK, em Além de grave comprometimento da imunidade adaptativa14,15,16.
Três modelos de rato humanizado, tendo um scid , mutação e nocaute Il2rg são frequentemente empregados na pesquisa de HIV/AIDS: o modelo BLT (medula óssea/fígado/Timo), o modelo PBL (leucócitos de sangue periférico) e o modelo SRC (SCID repovoamento celular) 3. o BLT modelo é criado através de cirurgia transplante de fígado fetal humano e Timo sob a cápsula do rim de rato acompanhado com injeção intravenosa de linfócitos feto fígado3,17,18. O modelo do rato de BLT oferece eficácia de enxertia alta, desenvolvimento de células hematopoiéticas humanas em todas as linhagens e o estabelecimento de um forte sistema imunológico humano; Além disso, as células T são educadas em um timo humano autólogo e prova HLA-restrito imune respostas4,5,17,19. No entanto, a exigência de procedimentos cirúrgicos continua a ser a grande desvantagem do modelo BLT. O modelo do rato do PBL é estabelecido pela injeção intravenosa com células linfoides periféricas humanas. O modelo PBL oferece conveniência e rende bem sucedida enxertia de células T, mas sua aplicação é limitada devido à insuficiente da B-pilha e enxertia de células mieloides, níveis baixos de enxertia globais e o aparecimento de grave enxerto doença contra o hospedeiro (GVHD)3 ,20. O modelo do rato do SRC é estabelecido através de injeção de linfócitos humanos em ratos adultos jovens ou recém-nascidos do SCID. Ele exibe a eficiência da enxertia média acima de 25% (avaliada como sangue periférico CD45 porcentagem) e suporta o desenvolvimento de múltiplos-linhagem de linfócitos injetados e a elaboração de um sistema imune humano inato. No entanto, a limitação do modelo SRC é que a resposta de células T é mouse H2-restrito em vez de humano HLA-restrito14,21.
O modelo do rato do SRC é considerado um modelo fácil e confiável para HIV/AIDS pequenos animais estudos pré-clínicos, exemplificado pela enxertia consistente de um sistema imunológico humano e desenvolvimento bem sucedido hematopoiético. Nós anteriormente relatado o estabelecimento de um modelo de mouse NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) e descreveu a sua aplicação na replicação do HIV e latência estudos22,23,24. Este modelo de rato hu-NSG apresenta níveis elevados de hospedagens de medula óssea, susceptibilidade à infecção pelo HIV e recapitulação da infecção pelo HIV e patogênese. Além disso, o modelo do rato do hu-NSG responde adequadamente à terapia antiretroviral combinatória (carrinho) e recapitula rebote viral do plasma após retirada do carrinho, confirmando o estabelecimento de um HIV latência reservatório25,26 ,,27. Este reservatório de latência do HIV é secundado pela produção da replicação vírus HIV ex vivo induzida por humanos células CD4 + T-isoladas de ratos infectados e tratados com carrinho hu-NSG a descansar.
Aqui, descrevemos o protocolo detalhado para a criação do modelo do mouse hu-NSG de ratos NSG neonatais, incluindo os procedimentos relacionados ao tratamento de infecção e carrinho de HIV para desenvolvimento de latência. Esperamos que este protocolo para oferecer um novo conjunto de abordagens em estudos com animais HIV sobre virologia de HIV, latência e tratamento.

<table><tbody><tr><td>Kit de microesferas CD34, humano</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-046-703</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS2</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07932</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji </td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>Encomende criadores em vez de camundongos experimentais</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-806-3204</td><td>Encomende através de instalações para animais, item restrito</td></tr><tr><td>Desinfetante Clidox</td><td>Fisher Sicentific</td><td>NC9189926</td><td></td></tr><tr><td>Wescodyne</td><td>Fisher Sicentific</td><td>19-818-419</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 80508 seringa/agulha</td><td>Hamilton</td><td>80508</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de coleta de sangue feito sob medida (K2EDTA)</td><td>BD Bioscience</td><td>367843</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de coleta de sangue (Heparina)</td><td>BD Bioscience</td><td>365965</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar (Heparinizado)</td><td>Fisher Sicentific</td><td>22-362574</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA mini kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix</td><td>Thermofisher</td><td>4444434</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 P24 ELISA (kit de 5 placas)</td> <td>PerkinElmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>IgG de soro humano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506-100MG</td><td></td></tr><tr><td>IgG de soro de camundongo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5381-10MG</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)</td><td>BD Biosciences</td><td>564586</td><td>RRID: AB_2732068, LOTE 6347696</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)</td><td>BD Biosciences</td><td>557851</td><td>RRID: AB_396896, LOTE 6021877</td></tr><tr><td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)</td><td>BD Biosciences</td><td>558116</td><td>RRID: AB_397037, LOTE 6224744</td></tr><tr><td>BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)</td><td>BD Biosciences</td><td>563795</td><td>RRID: AB_2722501, LOTE 6210668</td></tr><tr><td>APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)</td><td>ThermoFisher</td><td>MHCD1427</td><td>RRID: AB_10373536, LOT 1684947A</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)</td><td>ThermoFisher</td><td>MHCD1904</td><td>RRID: AB_10373382, LOTE 1725304B</td></tr></tbody></table>

humanizado nod/scid/il2rγnula (hu-nsg) mouse modelo para estudos de latência e a replicação do hiv

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Normas éticas e desafios técnicos para a pesquisa em patologia humana, imunologia e desenvolvimento terapêutico colocaram modelos animais pequenos em alta demanda. Com uma estreita semelhança genética e comportamental aos seres humanos, animais pequenos, tais como o rato são bons candidatos para modelos de doenças humanas, através do qual podem ser instauradas respostas e sintomas parecidos com os humanos. Além disso, o fundo genético de rato pode ser alterado para acomodar demandas diversas. O NOD/SCID/IL2rγnula (NSG) é uma das variedades mais amplamente utilizado de rato imunocomprometidos; permite enxertia com células-tronco hematopoiéticas humanas e/ou tecidos humanos e o desenvolvimento posterior do sistema imunológico humano funcional. Este é um marco fundamental na compreensão do prognóstico e fisiopatologia das doenças de humanos específicos tais como HIV/AIDS e auxiliando a busca de uma cura. Neste documento, nós relatamos um protocolo detalhado para a geração de um modelo de mouse NSG humanizado (hu-NSG) pelo transplante de células-tronco hematopoiéticas para um rato NSG neonatal condicionada por radiação. O modelo do rato do hu-NSG mostra desenvolvimento multi linhagem de células-tronco humanas transplantadas e susceptibilidade à infecção viral do HIV-1. Ele também recapitula a principais características biológicas, em resposta à terapia anti-retroviral combinatória (carrinho).

Análise de citometria de fluxo é frequentemente realizado para validar a pureza de linfócitos isolados, avaliar níveis de enxertia, perfil respostas imunes à infecção viral, vistoria e eficácia do carrinho. Um painel de anticorpos típica contém anticorpos fluorescente etiquetados individuais de 4-6; assim, um citômetro de fluxo com vários lasers e uma ampla seleção de filtros é crucial para alcançar resultados precisos.
Para val...

Este protocolo fornece um método para estabelecer ratos humanizados (hu-NSG) através da injeção de colestase de células estaminais hematopoiéticas em camundongos NSG neonatais condicionada por radiação. O mouse hu-NSG é suscetível à infecção pelo HIV e terapia anti-retroviral combinatória (carrinho) e serve como um modelo fisiopatológico apropriado para investigações de latência e a replicação do HIV.

Humanizado NOD/SCID/IL2rγnula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Essas questões podem ajudar a responder a questões-chave na pesquisa sobre HIV/AIDS, como o mecanismo molecular e o prognóstico da infecção pelo HIV, e como e onde o reservatório de latência é estabelecido. A vantagem dessa técnica é que ela não é invasiva, e estabeleceu um camundongo hu-NSG que deve tratar um desenvolvimento de várias linhagens sobre células-tronco humanas transplantadas que são suscetíveis à infecção pelo HIV e são receptivos ao cART. Comece filtrando uma amostra digerida, humana, fetal, hepática, pasta através de uma amostra estéril, de 70 micrômetros, nylon, coador de malha para obter uma única suspensão celular, e enriqueça para CD34+HSCs por classificação celular ativada magnética de acordo com as instruções do fabricante.Após a contagem, suspenda o HSC em duas vezes dez a sete células viáveis por concentração mililitro em DPBS frescos no gelo. Em seguida, coloque um ninhado de rato humano neonatal inteiro NOD/SCID/gama ou NSG em uma gaiola de irradiação estéril, em forma de torta, e trate os animais com 200 a 250 centígrados de raios gama de uma fonte de radiação césio-137. Em seguida, carregue as células em uma seringa padrão, Hamilton 80508 50-microliter e

humanized-nodscidil2rnull-hu-nsg-mouse-model-for-hiv-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

O vídeo demonstra uma técnica para gerar um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada baseada em células-tronco contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV). O tecido do timo fetal humano e as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) projetadas são implantados na cápsula renal de um camundongo gravemente imunocomprometido. As HSCs, que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) contra o HIV, são misturadas em uma mistura de proteínas gelatinosas que promove sua...

Construindo um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada contra o HIV

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.

Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

Aqui estão três abordagens experimentais para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV em camundongos humanizados. O primeiro permite o estudo de eventos de infecção crônica, enquanto os dois últimos permitem o estudo de eventos agudos após infecção primária ou reativação viral.

Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados

Desenvolvemos um protocolo para a geração e avaliação de um modelo de camundongo NOG infectado por vírus humanizado e humano com base no transplante de células-tronco, exposição intravaginal do vírus da imunodeficiência humana e RNA PCR digital de gota digital Quantificação.

Camundongos NOG humanizados para exposição intravaginal ao HIV e tratamento da infecção pelo HIV

Este protocolo descreve um novo método para administrar medicamentos antirretrovirais combinacionais orais que suprimem com sucesso a replicação do RNA do HIV-1 em camundongos humanizados.

Tratamento Antirretroviral Combinacional Oral em Camundongos Humanizados Infectados pelo HIV-1

Este protocolo descreve a geração de camundongos do sistema imunológico humano (HIS) para estudos de imuno-oncologia. Instruções e considerações sobre o uso deste modelo para testes de imunoterápicos humanos em tumores humanos implantados neste modelo são apresentadas com ênfase na caracterização da resposta do sistema imune humano ao tumor.

Testando imunoterápicos contra o câncer em um modelo humanizado de camundongo com tumores humanos

Este protocolo descreve como a combinação da infecção por EcoHIV com camundongos Tmem119-EGFP oferece um sistema biológico valioso para investigar alterações microgliais e reservatórios virais em modelos de roedores de distúrbios neurocognitivos associados ao HIV.

Identificação de células infectadas por EcoHIV em camundongos transgênicos manipulados por microglia

Aprenda a estababelecer camundongos humanizados hu-NSG para pesquisa do HIV usando células-tronco hematopoéticas CD34+. Este modelo permite estudar replicação viral, latência e terapia antirretroviral combinada.

Humanizado NOD/SCID/IL2rγ^nula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV

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