Name: Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a avaliar a atividade proteolítica de PCSK9 em células HEK293 T usando ensaio de luciferase de alto rendimento. Este método permite leitura rápida e amplificável de eventos bioquímicos de baixa frequência.

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Os autores graças ao apoio generoso financiamento do NHLBI/NIH (K08 HL124068 e LRP HMOT1243), NCATS/NIH através da UCSF clínica e translacional ciência Instituto catalisador programa (UL1 TR000004), o Senado académico UCSF, a Fundação de Hellman, um Gilead Sciences Research Scholar Award, um prêmio Pfizer ASPIRE Cardiovascular (todos John S. Chorba) e do Howard Hughes Medical Institute (para Adri M. Galvan e Kevan M. Shokat).

1. local-dirigido Mutagenesis de Protease Vector
<ol><li>Design e ordem personalizada-sintetizados oligonucleotides instalar uma mutação de interesse usando uma modificação do padrão mutagenesis local-dirigido protocolos12. Norma primeiras demão demolhadas (sem purificação adicional) são perfeitamente aceitáveis. Nota: Uma abordagem geral para projetos cartilha envolve a criação de cartilhas parcialmente sobrepostas conforme indicado na tabela 1, usando uma calculadora de temperatura (Tm) derretimento específica para o polymerase de interesse.</li>
	<li>Criar reacções em cadeia do polymerase (PCR) para o mutagenesis local-dirigido no gelo, como indicado na tabela 2.</li>
	<li>Ciclo do PCRs conforme indicado na tabela 3.</li>
	<li>Executar 2-5 µ l de cada PCR em um gel de agarose a 1% e visualizar os produtos para confirmar uma amplificação bem sucedida. Nota: Um sucesso PCR irá mostrar uma única, proeminente banda de DNA no marcador do tamanho aproximado do modelo (~7.8 kB).</li>
	<li>Adicionar 0,5 µ l (por reação de 25 µ l) de DpnI e incubar as amostras a 37 ° C por 1h.</li>
	<li>Transforme a 2 µ l da reação em quimicamente competentes de Escherichia coli. Nota: Uma cepa de Escherichia coli de rápido crescimento irá reduzir os tempos de incubação, mas toda a tensão clonagem será aceitável.</li>
	<li>Placa das transformações em ágar Luria-Bertani (LB) contendo carbenicilina de 50-100 µ g/mL. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.</li>
	<li>Selecione 2-4 colônias para crescer em uma cultura em pequena escala (2-5 mL de meio LB com carbenicilina de 50-100 µ g/mL). Incube a cultura a 37 ° C a 220 rpm até que é turvo.</li>
	<li>Isole o plasmídeo de DNA das células usando um kit de purificação (ou seja, "miniprep") do DNA de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Quantificar a concentração de DNA eluted usando um spectrophotometer microvolume.</li>
	<li>Sequenciar o plasmídeo extensivamente usando um serviço de sequenciamento Sanger (como um núcleo ou instalações comerciais). Prepare as amostras de DNA de acordo com as especificações do serviço. Primers utilizados com sucesso em reações de sequenciamento prévia são anotados na tabela 4. Nota: Devido a amplificação por PCR do plasmídeo inteiro, o sequenciamento de toda região codificante PCSK9 é recomendado para cada mutante.</li>
</ol>2. alta produtividade baseada em Luciferase Proteolysis ensaio
<ol><li>
Chapeamento de célula (dia 0)
	<ol>
<li>Usar células de HEK293T baixa-passagem para experiências e uma cultura em de Dulbecco modificado médio águia (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). Executar tudo celular trabalho sob condições estéreis de um capuz de cultura de tecido até que esteja pronto a ensaiar a atividade de luciferase. Estime o número de poços e placas necessárias para o experimento, antecipando que transfections serão realizadas em triplicata para cada condição testada.</li>
		<li>Dissocia o HEK293T células de um frasco de pai, tratando-as com um volume mínimo de 0,05% ácido de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para cobrir as células. Inativar o tripsina-EDTA com 2 volumes de DMEM suplementado com 10% FBS e transferência das células para um tubo estéril. Contar as células usando um contador de célula automatizada (e coloração com trypan azul). Centrifugar o tubo a 500 x g por 5 min recuperar as células.</li>
		<li>Aspire o meio contendo tripsina e reconstituir as células em meio de cultura para uma concentração de 2 x 105 células/mL. Usando uma pipeta multicanal, transferi 100 µ l de células a cada poço de uma placa de 96 poços de branco (opaco baixo), que dá uma concentração final de semeadura de 2 x 104 células/poço. Nota: Para as experiências iniciais, pode ser útil propagar adicionalmente uma irmã, placa de 96 poços de clear-inferior, a fim de monitorar o crescimento celular e aderência durante o protocolo e a guia futuro de solução de problemas.</li>
		<li>Incube as celulas em 37 ° C e 5% CO2 por 24 h.</li>
		<li>Prepare um prato principal de plasmídeos em um formato de 96 poços. Dilua cada plasmídeo em tampão de eluição (Tris-HCl, pH 8,5) para 50 ng / µ l em um poço individual de uma placa de 96 poços.<ol>
<li>Prepare 4 poços cada para o controlo positivo (WT) plasmídeo8, plasmídeo de controlo negativo (S386A)8e buffer livre de plasmídeo (para transfections simulados). Se as drogas ou outros tratamentos à base de celular estão sendo planejados e, em seguida, preparem a placa mestra com o plasmídeo controlo positivo (WT) em cada poço, juntamente com 4 poços de cada o plasmídeo controlo negativo (S386A) e o buffer de plasmídeo-livre.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfecção (dia 1)
	<ol>
<li>Prepare a mistura de transfeccao em um formato de placa de 96 poços, usando placas de 96 poços profundos-bem. Execute os transfections em triplicado, certificando-se de preparar suficiente reagentes para contabilizar perdas de pipetagem e transferência. Nota: Os cálculos a seguintes preparem suficiente reagente para executar uma placa de 96 poços em triplicado (estimado conservadora para 420 poços).<ol>
<li>Faça uma mistura de mestre de um reagente de Transfeccao de lipídios diluídos, adicionando 50,4 µ l de reagente para 2050 µ l de soro reduzido médio. Faça uma mistura de mestre de um reagente de precomplexation do DNA, adicionando 33.6 µ l de reagente em 1730 µ l de soro reduzido médio.</li>
			<li>Usando uma pipeta multicanal, alíquota 16.8 μL de DNA precomplexation reagente mistura diluída em cada poço da placa de fundo-bem.</li>
			<li>Usando uma pipeta multicanal, alíquota µ l 3.2 (160 ng) de cada plasmídeo da placa de mestre para cada poço da placa de fundo-bem.</li>
			<li>Usando uma pipeta multicanal, alíquota 20 µ l da mistura de reagente de transfeccao lipídico diluídos a cada bem da placa e misturar o conteúdo de cada poço usando a pipeta multicanal. Cobrir as placas e deixá-los sentar-se à temperatura ambiente (RT) por 10-15 min para formar complexos de lipídios: DNA. Nota: Em cima do transfection, os componentes finais por bem será a seguinte: 40 ng de DNA e 0,12 µ l de reagente de transfeccao 0,08 µ l de reagente de pre-complexação de DNA e o conteúdo de cada bem será 10 µ l em volume total (médio reduzido-soro).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Suavemente, troca o médio sobre as células 293T nas placas de 96 poços, com uma pipeta multicanal, tomando cuidado para não perturbar as células. Substituir o medium aspirado com 95 ml de DMEM suplementado com 10% FBS. Nota: Este seria um momento apropriado para tratar as células com qualquer droga de interesse.</li>
		<li>Adicione 10 µ l da mistura de Transfeccao para cada apropriado bem através de uma pipeta multicanal. Agite suavemente a placa para misturar o conteúdo dos poços. Incube a placa a 37 ° C com 5% de CO2 por 24 h. Nota: O volume final dos poços vem a 105 µ l, para dar conta da evaporação mais 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensaio (dia 2)
	<ol>
<li>Prepare uma solução stock de reagentes coelenterazine: ascorbato de sódio 3 M [dissolvido em tampão fosfato salino (PBS), preparado fresco], 5m NaCl, 10 mg/mL albumina de soro bovino (BSA; dissolvido em PBS, preparado fresco) e coelenterazine de 2mm (dissolvido em metanol acidificado contendo 200 µ l de 3 N HCl / 10 mL). Nota: O coelenterazine de 2 mM pode ser armazenado por 2 semanas, quando é mantida a-80 ° C e na ausência de luz.</li>
		<li>Prepare 2 reagentes de x coelenterazine para a leitura de luciferase, com um reagente separado cada para as células e o meio, de acordo com a tabela 5. Misture todos os reagentes de salvar o coelenterazine primeiro, filtrar a mistura através de um filtro de seringa 0,22 µm e em seguida, adicione o coelenterazine. Protege os reagentes da luz até que estejam prontos para serem adicionados às placas. Nota: Devido à perda de solução de filtragem, fazer bastante reagente para dar conta tanto a perda de filtração, bem como de transferências. A tabela 5 mostra a concentração final dos reagentes de 2 x (bem como a quantidade de solução para adicionar para ler uma placa de 96 poços com um reagente).</li>
		<li>Remova as células a incubadora 24 h após o transfeccao. Usando uma pipeta multicanal, transferi 50 µ l de meio condicionado de cada poço a uma placa de 96 poços (opaca) fresca, com fundo branco.<ol>
<li>Rotule as placas sobre se eles contêm médio ou células. Se mais de uma placa de 96 poços foi transfectada, rotule as chapas a fim de assegurar que cada placa contendo meio é emparelhada com sua placa mãe de células.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 µ l de reagente de coelenterazine não-lítica de 2x para a placa contendo apenas meio de condicionado. Delicadamente, rock ou agitar a placa na ausência de luz, por 5-10 min no RT</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 µ l de reagente de coelenterazine lítica x 2 para a placa que contém as células. Delicadamente, rock ou agitar a placa na ausência de luz, por 5-10 min no RT</li>
		<li>Após a incubação, leia a luminescência da placa somente médio em um leitor de placa. Em seguida, leia a luminescência da placa que contém a célula no leitor de placa mesmo.</li>
		<li>Descartar as placas e salvar os arquivos para análise de dados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. análise de dados
<ol><li>Realizar uma análise inicial de dados usando o software de planilha eletrônica. Crie uma planilha contendo os resultados de célula e as placas de médio.</li>
	<li>Inspecione manualmente os dados as chapas de célula para identificar mal transfectados poços. Poços que mostram &lt; 5% - 10% da leitura do plasmídeo controlo negativo (S386A) deve ser considerado como mal transfectadas, tornando a interpretação desses dados suspeito.</li>
	<li>Calcule a luminescência do fundo de cada prato dos poços de simulação-transfectadas. Subtrai o fundo de cada prato dos valores de matrícula. Nota: Este valor pode ser insignificante dependendo do leitor de placa usado.</li>
	<li>Processo os dados calculando a proporção de atividade do luciferase a médio em comparação com a actividade do luciferase global para cada poço. Porque a placa de células contém ambos condicionados médio além de células, e a placa somente médio contém a mesma quantidade de meio condicionado como a placa de células, é apropriado usar a seguinte equação: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq1.jpg"> Aqui, RLU = unidades de luminescência relativa, a leitura de fundo-subtraído do leitor de placa.</li>
	<li>Calcule o médio luciferase secretado do controle positivo (WT) e os poços de controlo negativo (S386A).</li>
	<li>Avalie a qualidade geral do experimento calculando um Z-fator13: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq2.jpg"> Nota: Os valores activos de controlo positivo (WT) e valores de inativos dos poços de controlo negativo (S386A). Valores mais próximos de 1 indicam uma maior qualidade experimental. Considere-se repetir o experimento ou otimizando o fluxo de trabalho, se o valor for inferior a 0.</li>
	<li>Transferi os dados do programa de planilha para software de análise de dados científicos.</li>
	<li>Normalize a atividade de luciferase secretada para os valores médios do controle positivo (WT) e o controlo negativo (S386A), definindo o controle positivo como 1 e o controlo negativo como 0.</li>
	<li>Limpe os dados para outliers usando o método de remoção (GOLEADA), regressão e aberrante, definindo a taxa máxima descoberta falsa para 1%.</li>
	<li>Avalie as diferenças estatisticamente significativas, comparando os dados para cada condição mutante (ou mutante) para a média da atividade WT (normalizada para um valor de 1). Executar múltiplas unpaired t-testes, corrigindo para comparações múltiplas, usando o método Holm-Sidak e o α = 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9a+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li>
<li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variations+in+PCSK9%2C+low+LDL%2C+and+protection+against+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li>
<li>Ridker, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Efficacy+and+Safety+of+Bococizumab+in+High-Risk+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients.</a> New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).</li>
<li>Sabatine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolocumab+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+with+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease.</a> New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).</li>
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<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+Cost-effectiveness+Analysis+of+PCSK9+Inhibitors+Based+on+the+Results+of+the+FOURIER+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial.</a> Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).</li>
<li>Pettersen, D., Fjellström, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulators+of+PCSK9+-+A+literature+and+patent+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).</li>
<li>Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+processing+analyses+of+the+single-turnover+PCSK9+protease+reveal+its+substrate+sequence+specificity+and+link+clinical+genotype+to+lipid+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).</li>
<li>Maxwell, K. N., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+expression+of+Pcsk9+in+mice+results+in+a+low-density+lipoprotein+receptor+knockout+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).</li>
<li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NARC-1%2FPCSK9+and+its+natural+mutants%3A+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+%28LDL%29+receptor+and+LDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li>
<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biophysical+studies+of+PCSK9+and+its+mutants+linked+to+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8, 91(2008).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
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<li>Chorba, J. S., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9+%28PCSK9%29+active+site+and+cleavage+sequence+differentially+regulate+protein+secretion+from+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).</li>
<li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+%28PC%29+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and%2For+PC5%2F6A%3A+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os procedimentos experimentais descritos acima apresentam um método para superar a intrinsecamente baixa atividade de protease a single-volume de negócios PCSK9 e avaliar sua função proteolítica de forma robusta. O conceito-chave do ensaio depende de conversão de um evento único-volume de negócios em uma leitura enzimaticamente amplificada. Os pontos fortes do ensaio incluem o prazo relativamente curto e facilidade de uso do repórter do luciferase, bem como sua capacidade de expansão para abordagens de alto rendimento. A...

PCSK9 metas o receptor de LDL (LDL-R) para degradação, aumentando o LDL colesterol (LDL-C) e conduzir a doença aterosclerótica do coração1,2. Terapêutica alvo PCSK9 robustamente abaixar o LDL-C e melhorar resultados cardiovasculares para pacientes, mesmo quando adicionado a uma terapia agressiva hipolipemiantes com estatinas3,4. Terapias actualmente aprovadas limitam-se a abordagens baseadas em anticorpos, no entanto e sofrem com a falta de rentabilidade5,6. Para resolver este problema, alternativas terapêuticas menos onerosos, um meio para identificar pacientes propensos a obter maiores benefícios, ou ambos, são necessários.
Abordagens da pequeno-molécula poderiam alvo PCSK9 intracelular, fornecer uma melhor via de administração e reduzir custos, tornando-o "Santo Graal" nesta zona7. No entanto, PCSK9 provou difícil de drogas por pequenas moléculas. Como uma protease, direcionamento função proteolítica do PCSK9 é uma estratégia atraente, como autoproteólise é a etapa limitante de PCSK9 maturação8 e é necessário para o seu máximo efeito no LDL-R9. Até à data, no entanto, esta estratégia não teve êxito, provavelmente devido a bioquímica exclusiva do PCSK9: PCSK9 apenas se fende10, realizando uma reação de single-volume de negócios, e depois autoclivagem, o PCSK9 prodomínio permanece ligado no sítio activo como um autoinibidor11, impedindo a leitura de qualquer atividade de protease mais.
Este artigo apresenta um método para avaliar PCSK9 função proteolítica na moda do elevado-throughput8. Através do mutagenesis local-dirigido, investigadores podem usar este teste para investigar os efeitos da codificação SNPs encontrados na clínica para avaliar os efeitos na proteólise, a etapa limitante de maturação PCSK9. Além disso, este método será útil no design de telas de alta produtividade para identificar moduladores de PCSK9 proteólise, que são antecipadas para, finalmente, interromper a apresentação de PCSK9 ao LDL-r (e modulam hipercolesterolêmicos efeito do PCSK9) . Por último, este protocolo pode ser adaptado para outras proteases com intrinsecamente baixa atividade, desde que i) um par de substrato-protease específico pode ser encontrado, e ii) uma âncora intracelular adequada pode ser estabelecida para o substrato.

<table><tbody><tr><td>Tubos de PCR</td><td>EUA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start</td><td>New England Biolabs</td><td>M0493L</td> Mistura de solução de desoxinucleotídeo <td>de DNA polimerase de alta fidelidade</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>dNTPs (para PCR)</td></tr> <tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td><td>Autores</td><td>n / a</td><td>Disponível dos autores</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A</td><td>Autores</td><td>n/a</td><td>Disponível dos autores</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-201-100</td><td>Para géis de DNA</td></tr><tr><td>E-Gel Imager System com Base de Luz Azul</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4466612</td><td>Para geração de imagens de géis de DNA</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Para géis de DNA</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Para tampão de gel de DNA</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>Para tampão de gel de DNA</td></tr><tr><td>Solução de ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Millipore Sigma</td><td>3690</td><td>EDTA, para buffer de gel de DNA</td></tr><tr><td>1 kb Escada de DNA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D010</td><td>Escada de DNA</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>Placas de ágar LB com 100 &micro; g / mL de carbenicilina</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td>LB-Carb placas</td></tr><tr><td>One Shot Mach1 T Resistente a fagos quimicamente competentes E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C862003</td><td>Células quimicamente competentes</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>LB</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-5</td><td>Antibiótico seletivo</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmídeo Mini Kit I</td><td>Omega BioTek</td><td>D6942-02</td><td>Kit Miniprep de Purificação de DNA</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Espectrofotômetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Células 293T Coleção</td><td>Americana de Cultura de Tecidos (ATCC)</td><td>CRL-3216</td><td>Células HEK 293T</td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td>DMEM, célula de mamífero mídia</td></tr><tr><td>Fetal Bovino Sera</td><td>Axenia Biologix</td><td>F001</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td>Tripsina, para dissociação celular</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Countess contador de células automatizado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td>Contagem automatizada de células</td></tr><tr><td>Lâminas para câmara de contagem de células</td><td>Countess ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Lâminas para contagem de células</td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Tecidos CELLSTAR, Brancas, Brancas, com Tampa</td><td>Grenier Bio-One</td><td>655083</td><td>Placa de 96 poços branca, fundo branco</td></tr><tr><td>Placa PCR de 96 poços TempPlate não contornada Placa PCR de 96 poços, natural</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9596</td><td>Placa de 96 poços para placa de plasmídeo mestre</td></tr><tr><td>Nunc 2.0mL DeepWell Placas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>278743</td><td>placa de 96 poços profundos</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>Reagente de transfecção de lipídios, Reagente Lf3K</td></tr><tr><td>P3000 Reagente</td><td>de pré-complexação de DNA</td><td>L3000008</td><td>ThermoFisher Scientific</td>, fornecido com</tr><tr><td>meio de soro reduzido Lf3K OptiMEM I</td> Meio de soro reduzido <td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Meio de soro reduzido para transfecção</td></tr> <tr><td>(+)-L-ascorbato de sódio</td><td>Millipore</td><td>Sigma A4034</td><td>Ascorbato de sódio</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Albumina, soro bovino, fração V, baixo teor de metais pesados</td><td>Millipore Sigma</td><td>12659</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Metanol (HPLC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4524</td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>VWR</td><td>JT9535-2</td><td>Concentrado HCl</td></tr><tr><td>Coelenterazina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>CZ2.5</td> Filtro de seringa de <td>substrato de luciferase</td></tr><tr><td>, estéril</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-720-3</td><td>Filtro estéril, PVDF, 0,22 &micro; </td></tr><tr><td>Pipeta Multicanal Pipet-Lite L12-200XLS+</td><td>Pipeta</td><td>Multicanal 17013810</td> Rainin <td>Pipeta Multicanal</td></tr><tr><td>Pipet-Lite L12-20XLS+</td><td>Pipeta</td><td>Multicanal 17013808</td><td></td>Rainin</tr><tr><td>Pipeta Multicanal Pipet-Lite L12-10XLS+</td><td>Pipeta</td><td>Multicanal 17013807</td><td>Rainin Reservatório</td></tr> de <tr><td>reagentes</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Calha para reagentes</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td>Tubos de 15 mL</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>tubos de 50 mL</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas Spark</td><td>Tecan</td><td>N/a</td><td>Leitor de placas</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2016 para Mac</td><td>Software de planilha</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v7</td><td>Software de análise de dados científicos</td></tr></tbody></table>

um ensaio de luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de pcsk9 a protease single-volume de negócios

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisina/kexin tipo 9 (PCSK9) é uma protease de single-volume de negócios que regula os níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) de soro e, consequentemente, as doenças cardiovasculares. Embora PCSK9 proteólise é necessária para seu efeito completo hipercolesterolêmicos, a avaliação da sua função proteolítica é desafiador: PCSK9 só é conhecido para decompor-se, submete-se apenas um único volume de negócios e após proteólise, retém seu substrato em seu sítio ativo como um inibidor de auto. Os métodos apresentados aqui descrevem um ensaio que supera esses desafios. O ensaio centra-se na proteólise intermolecular em um contexto de baseada em célula e decote bem sucedida de ligações para a atividade de luciferase secretada, que pode ser facilmente lido para fora no meio de condicionado. Através de etapas sequenciais de mutagénese, transfecção transiente e uma leitura de luciferase, o ensaio pode sonda PCSK9 proteólise em condições de perturbação genética ou molecular de forma de alta produtividade. Este sistema é adequado para ambos avaliação bioquímica de missense clinicamente descobertos single-nucleotide polimorfismos (SNPs), bem como quanto a triagem de inibidores da pequeno-molécula de proteólise PCSK9.

O ensaio de proteólise de alto rendimento depende de superar três grandes desafios. Primeiro, para superar a saída intrinsecamente baixa de uma protease de PCSK9 single-volume de negócios, uma protease PCSK9 falta o inibitório prodomínio é usado, com a sequência de clivagem na cauda do prodomínio ligada a um luciferase que pode ser secretada14. Em segundo lugar, para satisfazer a necessidade da protease de dobrar em complexo com sua inibitório prodomínio, que os do...

Este protocolo apresenta um método para avaliar a atividade proteolítica de uma protease de baixa atividade intrinsecamente, único volume de negócios em um contexto celular. Especificamente, esse método é aplicado para avaliar a atividade proteolítica de PCSK9, um motor essencial do metabolismo lipídico, cuja atividade proteolítica é necessária para sua função final hipercolesterolêmicos.

Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bioquímica do PCSK9, como quais drogas ou alterações genéticas afetam a função proteolítica do PCSK9. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma leitura rápida e amplificável de um evento bioquímico de frequência intrinsecamente baixa. As implicações desta técnica se estendem para a doença cardíaca aterosclerótica porque a função proteolítica PCSK9 é necessária para seu efeito final nos níveis séricos de colesterol.Embora este método possa fornecer informações sobre o próprio PCSK9, ele também pode ser aplicado a outros sistemas bioquímicos, como outras proteases com atividade proteolítica intrinsecamente baixa. Para começar, aspire o meio de cada célula T HEK293. Lave com PBS e trate com o volume mínimo de 0,5% de tripsina-EDTA.E incube a 37 graus Celsius por dois a cinco minutos para dissociar as células do frasco original. Adicione dois volumes de DMEM suplementado com 10% de FBS para inativar a tripsina-EDTA. Em seguida, pipeta o líquido no frasco para cima e para baixo várias vezes, desalojando as células aderentes e transferindo as células para um tubo estéril.Em seguida, remova uma pequena alíquota de células. Pinte com um volume igual de Azul de Tripano e transfira as células coradas para uma lâmina e use um contador de células automatizado para contar as células. Centrifugar o tubo a 500 vezes G durante cinco minutos para recuperar as células.Depois disso, aspire o meio e reconstitua as células e o meio de cultura até a concentração desejada. Usando uma pipeta multicanal e uma calha estéril, transfira 100 micrômetros das células em cada poço para uma placa branca de 96 poços. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas.Em seguida, prepare a placa de plasmídeos para a concentração desejada para transfecção, incluindo quatro poços cada para o plasmídeo de controle positivo, plasmídeo de controle negativo e tampão livre de plasmídeo. Primeiro, prepare uma mistura mestre de reagente de transfecção de lipídios diluídos e uma mistura mestre de reagente de pré-complexação de DNA. Em seguida, usando uma pipeta multicanal e uma calha estéril, alíquota de 16,8 microlitros do reagente de pré-complexação de DNA diluído em cada poço de uma placa de poço profundo.Depois disso, use a pipeta multicanal para transferir 3,2 microlitros de cada plasmídeo da placa mestre para cada poço da placa de poço profundo. Em seguida, use a pipeta para adicionar 20 microlitros da Mistura de Reagente de Transfecção de Lipídios Diluídos a cada poço da placa e misture bem. Cubra as placas e deixe-as descansar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos para formar complexos de DNA lipídico.Depois disso, use a pipeta multicanal para remover suavemente o meio das células T 293 na placa de 96 poços. Em seguida, substitua o Medium por 95 microlitros de DMEM suplementado com 10% de FBS. Em seguida, use a pipeta multicanal para adicionar 10 microlitros da mistura de transfecção a cada poço apropriado.Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Primeiro, prepare as soluções de estoque necessárias para fazer o reagente de ensaio de celenterazina de força dupla, incluindo ascorbato de sódio de três molares em PBS, cloreto de sódio cinco molares em água destilada, 10 miligramas por mililitro de BSA em PBS e dois milimolares de celenterazina em metanol acidificado. Em seguida, prepare reagentes de celenterazina suficientes para a leitura da luciferase.Com um reagente separado para cada uma das células do meio. Em seguida, misture todos os reagentes esperados para a celenterazina. Filtrar a mistura através de um filtro de seringa de 0,22 micrómetros.E então, após a filtração, adicione a celenterazina. Remova as células da incubadora 24 horas após a transfecção. Em seguida, use a pipeta multicanal para transferir 50 microlitros de meio condicionado de cada poço para uma placa branca fresca de 96 poços.Use a pipeta multicanal para adicionar 50 microlitros de reagente de celenterazina não lítica de dupla força à placa contendo apenas meio condicionado. Em seguida, agite suavemente o prato no escuro por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, repita esta etapa adicionando o Reagente de Celenterazina Lítica de Força Dupla à placa que contém as células.Após as incubações, meça a luminescência da placa somente média e da placa contendo células em um leitor de placas. Por fim, descarte as placas e salve os arquivos para posterior análise de dados. É importante incubar o reagente de luciferase com a placa somente média e a placa contendo células pelo mesmo período de tempo porque os dados dessas placas são comparados diretamente.Neste protocolo, a Especificidade da Sequência de Clivagem da Protease PCSK9 nos Sítios de Substrato P6 a P6 Prime foi avaliada por um ensaio de luciferase. As mudanças na sequência de clivagem nas posições P6 e P4 a P1 Prime são mal toleradas pela protease. Mas as posições P5 e P2 Prime a P6 Prime são mais flexíveis para mudar.Além disso, os resultados mostram que as sequências de clivagem ideais são essencialmente as mesmas que a sequência do tipo Wild. A atividade de clivagem relativa de uma biblioteca de recortes de missent encontrados na clínica foi comparada com a protease do tipo selvagem. Dos 84 recortes avaliados, mais da metade demonstrou mudanças significativas na atividade em comparação com a protease do tipo selvagem, sugerindo que alterações na atividade da protease são frequentemente observadas na população clínica.Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo ou ensaios de captação de colesterol em hepatócitos, podem ser realizados para avaliar alterações na capacidade proteolítica de PCSK9 no efeito de PCSK9 no receptor de LDL.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

O vídeo demonstra o ensaio de luciferase usado para quantificar proteínas marcadas com luciferase. O ensaio usa uma enzima luciferase projetada composta por um grande fragmento que se liga ao pequeno fragmento, que é conjugado com uma proteína de interesse. As subunidades ligadas formam uma enzima ativa que, na presença do substrato, libera um sinal luminescente. Este sinal é então quantificado usando um luminômetro.

O ensaio de luciferase: um ensaio de alto rendimento para medir sinais luminescentes usando biorepórteres baseados em sistema de nanoluciferase projetados

Este vídeo demonstra um ensaio para rastrear a atividade proteolítica de proteases usando peptídeos fluorogênicos. A protease reconhece seu local de clivagem no peptídeo, clivando-o e separando o supressor do fluoróforo, permitindo sua emissão de fluorescência. O sinal de fluorescência é detectado e analisado para verificar a eficiência de clivagem de diferentes variantes de peptídeos.

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Este vídeo demonstra o procedimento de medição da atividade da γ-secretase em células humanas geneticamente modificadas usando um sistema induzível por tetraciclina. O processo envolve a indução da expressão do gene APP com tetraciclina, geração de peptídeos β amilóide e ativação da produção de luciferase. A bioluminescência resultante da reação luciferase-substrato é então medida, refletindo a atividade da γ-secretase.

Ensaio de luciferase para medir a atividade da γ-secretase em células humanas

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De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Um método é descrito para a análise de degradação de proteínas utilizando radiolabeled e proteínas luciferase de fusão em Xenopus extrato do ovo e sua adaptação para high-throughput screening para modulares de degradação de proteínas.

Reconstituição de β-catenina degradação na<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrato de ovo

Este relatório descreve protocolos para medir as taxas de degradação de proteínas mal dobradas por ensaios baseados em western blot ou fluorescência. Os métodos podem ser aplicados à análise de outras proteínas mal dobradas e para triagem de alto rendimento.

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Medida quantitativa da proteína precursora amiloide γ-Secretase-mediada e clivagem de entalhe em plataformas de ensaio baseada em célula Luciferase Reporter

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Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios

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