Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bioquímica do PCSK9, como quais drogas ou alterações genéticas afetam a função proteolítica do PCSK9. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma leitura rápida e amplificável de um evento bioquímico de frequência intrinsecamente baixa. As implicações desta técnica se estendem para a doença cardíaca aterosclerótica porque a função proteolítica PCSK9 é necessária para seu efeito final nos níveis séricos de colesterol.

Embora este método possa fornecer informações sobre o próprio PCSK9, ele também pode ser aplicado a outros sistemas bioquímicos, como outras proteases com atividade proteolítica intrinsecamente baixa. Para começar, aspire o meio de cada célula T HEK293. Lave com PBS e trate com o volume mínimo de 0,5% de tripsina-EDTA.

E incube a 37 graus Celsius por dois a cinco minutos para dissociar as células do frasco original. Adicione dois volumes de DMEM suplementado com 10% de FBS para inativar a tripsina-EDTA. Em seguida, pipeta o líquido no frasco para cima e para baixo várias vezes, desalojando as células aderentes e transferindo as células para um tubo estéril.

Em seguida, remova uma pequena alíquota de células. Pinte com um volume igual de Azul de Tripano e transfira as células coradas para uma lâmina e use um contador de células automatizado para contar as células. Centrifugar o tubo a 500 vezes G durante cinco minutos para recuperar as células.

Depois disso, aspire o meio e reconstitua as células e o meio de cultura até a concentração desejada. Usando uma pipeta multicanal e uma calha estéril, transfira 100 micrômetros das células em cada poço para uma placa branca de 96 poços. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas.

Em seguida, prepare a placa de plasmídeos para a concentração desejada para transfecção, incluindo quatro poços cada para o plasmídeo de controle positivo, plasmídeo de controle negativo e tampão livre de plasmídeo. Primeiro, prepare uma mistura mestre de reagente de transfecção de lipídios diluídos e uma mistura mestre de reagente de pré-complexação de DNA. Em seguida, usando uma pipeta multicanal e uma calha estéril, alíquota de 16,8 microlitros do reagente de pré-complexação de DNA diluído em cada poço de uma placa de poço profundo.

Depois disso, use a pipeta multicanal para transferir 3,2 microlitros de cada plasmídeo da placa mestre para cada poço da placa de poço profundo. Em seguida, use a pipeta para adicionar 20 microlitros da Mistura de Reagente de Transfecção de Lipídios Diluídos a cada poço da placa e misture bem. Cubra as placas e deixe-as descansar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos para formar complexos de DNA lipídico.

Depois disso, use a pipeta multicanal para remover suavemente o meio das células T 293 na placa de 96 poços. Em seguida, substitua o Medium por 95 microlitros de DMEM suplementado com 10% de FBS. Em seguida, use a pipeta multicanal para adicionar 10 microlitros da mistura de transfecção a cada poço apropriado.

Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Primeiro, prepare as soluções de estoque necessárias para fazer o reagente de ensaio de celenterazina de força dupla, incluindo ascorbato de sódio de três molares em PBS, cloreto de sódio cinco molares em água destilada, 10 miligramas por mililitro de BSA em PBS e dois milimolares de celenterazina em metanol acidificado. Em seguida, prepare reagentes de celenterazina suficientes para a leitura da luciferase.

Com um reagente separado para cada uma das células do meio. Em seguida, misture todos os reagentes esperados para a celenterazina. Filtrar a mistura através de um filtro de seringa de 0,22 micrómetros.

E então, após a filtração, adicione a celenterazina. Remova as células da incubadora 24 horas após a transfecção. Em seguida, use a pipeta multicanal para transferir 50 microlitros de meio condicionado de cada poço para uma placa branca fresca de 96 poços.

Use a pipeta multicanal para adicionar 50 microlitros de reagente de celenterazina não lítica de dupla força à placa contendo apenas meio condicionado. Em seguida, agite suavemente o prato no escuro por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, repita esta etapa adicionando o Reagente de Celenterazina Lítica de Força Dupla à placa que contém as células.

Após as incubações, meça a luminescência da placa somente média e da placa contendo células em um leitor de placas. Por fim, descarte as placas e salve os arquivos para posterior análise de dados. É importante incubar o reagente de luciferase com a placa somente média e a placa contendo células pelo mesmo período de tempo porque os dados dessas placas são comparados diretamente.

Neste protocolo, a Especificidade da Sequência de Clivagem da Protease PCSK9 nos Sítios de Substrato P6 a P6 Prime foi avaliada por um ensaio de luciferase. As mudanças na sequência de clivagem nas posições P6 e P4 a P1 Prime são mal toleradas pela protease. Mas as posições P5 e P2 Prime a P6 Prime são mais flexíveis para mudar.

Além disso, os resultados mostram que as sequências de clivagem ideais são essencialmente as mesmas que a sequência do tipo Wild. A atividade de clivagem relativa de uma biblioteca de recortes de missent encontrados na clínica foi comparada com a protease do tipo selvagem. Dos 84 recortes avaliados, mais da metade demonstrou mudanças significativas na atividade em comparação com a protease do tipo selvagem, sugerindo que alterações na atividade da protease são frequentemente observadas na população clínica.

Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo ou ensaios de captação de colesterol em hepatócitos, podem ser realizados para avaliar alterações na capacidade proteolítica de PCSK9 no efeito de PCSK9 no receptor de LDL.