Name: Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a gerar mutantes de deleção em Escherichia coli por transdução P1 usando construtos de cassetes de resistência a antibióticos. Este método rápido e confiável facilita a análise de funções gênicas em microbiologia.

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Cepas de coleção de Keio foram obtidas a partir do projeto nacional de BioResource (NIG, Japão): Escherichia coli. Agradecemos seu apoio contínuo Dirk Linke (departamento de Biociências, Universidade de Oslo). Este trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa da Noruega jovem pesquisador grant 249793 (Jack C. Leo).

1. cepas e plasmídeos
<ol><li>
Estirpes bacterianas
	<ol>
<li>Use a e. coli as estirpes BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20e BL21ΔABCF21. Consulte Tabela de materiais para mais informações.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bacteriófagos
	<ol>
<li>Use o fago P1vir para a transdução geral. Armazenar a Praga como um estoque líquido com algumas gotas de clorofórmio (consulte a etapa 2.2). Para obter mais informações, consulte Tabela de materiais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmídeos
	<ol>
<li>Use os seguintes plasmídeos neste protocolo: pCP2022, pIBA2-YadA23e pEibD1024. Como plasmídeos de controle, use pASK-IBA2 e pET22b (ver Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Condições de crescimento
	<ol>
<li>Propaga as bactérias em um lisogenia caldo (LB) médio25 com agitação vigorosa (180 – 200 rpm) a 37 ° C ou 30 ° C, no caso de tensões que contém pCP20 e BL21ΔABCF.</li>
		<li>Executar o plasmídeo curando a 43 ° C.</li>
		<li>Para um meio sólido, suplemento LB com ágar de 1% (p/v).</li>
		<li>Para ágar superior, suplemento LB com 0,7% agar e 10 mM CaCl2 e autoclave a médio. Use meio de SOC para a recuperação após electroporation26.</li>
		<li>Use as seguintes concentrações de antibióticos: 100 μg/mL para o Amp e 25 μg/mL para Kan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparar um Phage lisado
<ol><li>
Infecção da estirpe dos doadores
	<ol>
<li>Crescer a tensão do doador JW4197 em 5 mL de LB suplementado com 10 mM CaCl2 e opcionalmente com Kan (25 µ g/mL) para uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Medir o valor de600 OD usando um espectrofotômetro.</li>
		<li>Fazer uma série de diluição de um stock de fago P1 existente no meio de LB: recomendado diluições são entre 10-3 a 10-7.</li>
		<li>Mix de 200 μL da suspensão bacteriana e 100 μL de uma diluição do fago determinado em um tubo de centrífuga de 15 mL ou equivalente. Prepare os tubos como muitos como diluições do fago. Incube os tubos por 20 min a 37 ° C, sem agitação.</li>
		<li>Adicionar ~ 3 mL de ágar superior fundido (~ 50 ° C) suplementado com 10 mM CaCl2 para os tubos, homogeneizar o conteúdo vortexing dos tubos em breve e despeje as misturas em placas LB escaldadas para fazer camadas mesmo.</li>
		<li>Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lisado preparação
	<ol>
<li>No dia seguinte escolha uma placa com um crescimento semi confluente de placas do fago. Em um prato semi confluente, aproximadamente metade da área de superfície da placa é evidente (Figura 3).</li>
		<li>Raspar a camada superior de ágar de tal uma placa usando um loop de inoculação ou uma ferramenta semelhante e coloque o ágar superior num tubo de centrífuga. Adicionar 1 a 2 mL de LB e uma gota de clorofórmio e vortex o tubo vigorosamente para ~ 1 min Add o clorofórmio em uma coifa.</li>
		<li>Centrifugar o tubo durante 15 minutos a 4.000 x g ou mais rápido para o agar e células bacterianas de Pelotas.</li>
		<li>Mova o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora fresco, evitando carregando ao longo de todos os restos da pelota. Adicione 2 gotas de clorofórmio e armazenar o lisado 4 e 10 ° c. Adicione clorofórmio em uma coifa. Não congele o fago lisado como isso irá resultar em uma redução significativa do número de partículas infecciosas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinação do título de lisado
	<ol>
<li>Cresce BW25113 em LB suplementado com 10 mM CaCl2 a 37 ° C até a cultura atinge uma OD600 ~ 1.0.</li>
		<li>Prepare uma série de diluição do fago lisado em LB (por exemplo, 10-6– 10-9). Nota: Tenha cuidado para pipetar amostra do topo do lisado para evitar a transferência de clorofórmio para as diluições.</li>
		<li>Mix de 200 μL da suspensão bacteriana e 100 μL de uma diluição do fago determinado em um tubo de centrífuga de 15 mL ou equivalente. Prepare os tubos como muitos como diluições do fago. Incube os tubos por 20 min a 37 ° C, sem agitação.</li>
		<li>Adicionar ~ 3 mL de ágar superior fundido (~ 50 ° C) suplementado com 10 mM CaCl2 para os tubos, homogeneizar o conteúdo vortexing dos tubos em breve e despeje a mistura em placas LB escaldadas para fazer camadas mesmo.</li>
		<li>Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.</li>
		<li>No dia seguinte contar o número de placas (regiões claras na esteira da bacteriana) por cada placa e calcular o título do lisado, usando a seguinte fórmula: <img alt="Fórmula do título viral: Título (pfu/mL) = Σplacas/Σdiluições × fator de plaqueamento." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> Exemplo: Em placas com as diluições 10-7, 10-8e 10-9, existem 231, 27 e 2 placas, respectivamente. Como 100 μL de cada diluição foi utilizado para a infecção, e porque o título é expresso como formadoras de placa unidades (pfu) / mL, o fator do chapeamento é 10. Estes números são inseridos na fórmula: <img alt="Cálculo do título viral usando unidades formadoras de placa (pfu), fórmula, gráfico de análise de dados de virologia." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> Assim, o título é aproximadamente 2 x 1010 do fago infecciosas partículas/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 transdução
<ol><li>
Preparando as células destinatários
	<ol>
<li>Crescer o destinatário estirpe BL21ΔABCF em LB suplementado com uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Use um espectrofotômetro para medir o valor de600 OD.</li>
		<li>Calcule o volume do fago lisado necessário para a realização de uma multiplicidade de valor de infecção (MOI) de 0,5. Para calcular o MOI, estime o número de bactérias baseada o OD600 da cultura. Suponha que um valor de600 OD de 1.0 corresponde ~ 109 UFC/mL. Calcule o volume necessário com base do título conhecido do lisado. Exemplo (com base do título calculado no exemplo após etapa 2.3.6): <img alt="Fórmula de cálculo do título de fago V = (número de fagos) / (título de lisado) com conversão em μL." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3">
</li>
		<li>Adicione o CaCl2 para a cultura de estirpe destinatário a 10 mM e misture. Tome 1 mL da cultura para a transdução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizando a transdução
	<ol>
<li>Adicionar o volume apropriado do fago lisado a 1 mL de cultura destinatário (incluindo CaCl2 a 10 mM), conforme calculado no passo 3.1.2 e misture delicadamente. Nota: Tenha cuidado para pipetar amostra do topo do lisado para evitar transferir clorofórmio à mistura.</li>
		<li>Estaticamente, incubar a mistura por 20 min a 37 ° C.</li>
		<li>Pare a infecção pela adição de citrato de sódio, pH 5,5 a 100 mM.</li>
		<li>Centrifugar as bactérias (5.000 x g por 2 min) e remover o sobrenadante e, em seguida, resuspenda-los em 1 mL de fresco LB suplementado com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5.</li>
		<li>Lave as células mais duas vezes como na etapa 3.2.4 para garantir a remoção do fago livre e cálcio.</li>
		<li>Ressuspender as bactérias em 1 mL de fresco LB suplementado com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5. Incube a bactéria a 30 ° C, durante 1 h com agitação (&gt; 100 rpm).</li>
		<li>Recolher as bactérias por centrifugação (5.000 x g por 2 min) e Resuspenda-los em ~ 100 μL de LB com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5.</li>
		<li>Espalhar as bactérias em uma placa LB suplementado com Kan a 25 µ g/mL e citrato de sódio de 10 mM, pH 5,5 e crescer a bactéria a 30 ° C até colônias aparecem (~ 24 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selecionando as transductants
	<ol>
<li>Uma vez que as colónias têm crescido na placa de seleção, restreak-los na LB + Kan para colônias única e crescer a 30 ° C até colônias única aparecem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. extirpando a gaveta de Kan
<ol><li>
A transformação com plasmídeo de recombinação
	<ol>
<li>Fazer o electrocompetent de estirpe BL21ΔABCF Kan-resistente.<ol>
<li>Crescer a tensão de uma única colônia em fresco LB (5 mL), suplementado com Kan (25 µ g/mL) a 30 ° C até que o OD600 ~0.5-0,7.</li>
			<li>A partir daqui, execute as etapas a seguir a 4 ° C ou em gelo. Centrifugar as bactérias (5.000 x g durante 10 minutos) e remover o sobrenadante.</li>
			<li>Lave o centrifugado com água destilada gelada duas vezes, repetindo o passo anterior de centrifugação e, finalmente, resuspenda o pellet de células em 100 µ l de gelado 10% de glicerol.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Arrefecer cubetas de eletroporação de 1 mm no gelo.</li>
		<li>Adicionar 1 pg de plasmídeo (pCP20) para a suspensão de eritrócitos, misture-os delicadamente a suspensão e transferi-lo para uma cubeta de eletroporação de refrigeração.</li>
		<li>Definir o electroporator para 1,8 kV e electroporate as células.</li>
		<li>Resgate de células transformadas, adicionando 1 mL de meio SOC e fazê-los crescer por 1h a 30 ° C.</li>
		<li>Placa de 100 µ l de células na LB + Amp placas e crescer as células a 30 ° C durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Indução da recombinação
	<ol>
<li>Palheta simples colônias do LB + Amp placa e inocular fresco LB, omitindo todos os antibióticos.</li>
		<li>Crescem as células à temperatura não-permissivo (43 ° C) durante a noite para induzir a expressão de recombinase FLP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seleção de recombinantes
	<ol>
<li>Fazer diluições em série e 50 µ l de uma diluição de6 105-10 em placas não-seletivo da placa e cultivá-lo durante a noite a 30 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. verificação da exclusão Gene
<ol><li>
Verificação da perda do plasmídeo e recombinação de sucesso
	<ol>
<li>Colônia de raia única dos pratos preparados na etapa 4.3.1 na LB Kan, LB + Amp e placas LB sem antibióticos, nesta ordem. Para ajudar as estrias, usar uma grade de Colônia (ver arquivo complementar 1). Crescem as placas a 30 ° C até colônias aparecem (~ 24 h).</li>
		<li>Pegue 10 – 20 clones que têm crescido na placa não-seletivo, mas não conseguiram crescer na mídia seletiva para posterior verificação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verificação suplementar por PCR de colônia
	<ol>
<li>Realizar uma colônia PCR com primers flanqueando o tamA sequência de código (consulte a Tabela de materiais).</li>
		<li>Prepare uma mistura PCR a mestre. A quantidade de mistura necessária depende do número de colónias a ser testado (Veja o exemplo na tabela 1). Misture os reagentes no gelo, adicionar o polymerase última.</li>
		<li>Homogeneizar a mistura de mestre de PCR e, em seguida, diluir 20 µ l em tubos de uma tira PCR. Pegue uma pequena quantidade de cada colônia para ser exibido usando uma ponta de pipeta estéril e adicioná-lo para um tubo. Lembre-se de incluir a estirpe de destinatário original para comparação. Opcionalmente, também inclua a estirpe do doador.</li>
		<li>Executar uma reação de PCR (ver tabela 2 para o programa utilizado).</li>
		<li>Prepare um gel de agarose a 1%.<ol>
<li>Para um gel 50 mL, medir 0,5 g de agarose e adicionar 50 mL de tampão TAE (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM e 1 mM EDTA, pH 8.0). Aqueça a mistura em um forno de microondas até dissolver toda da agarose.</li>
			<li>Uma vez que a agarose dissolveu, arrefecer a solução para cerca de 50 ° C e adicione 5 μL de DNA coloração tintura. Misture a solução bem e despeje em uma bandeja de gel em uma câmara de fundição. Insira uma ou mais linhas de pentes bem assim há poços suficientes para todas as amostras, bem como marcadores de tamanho molecular. Permitir que o gel definir por 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uma vez concluída a execução PCR, adicione 4 µ l de 6 x tintura do carregamento de DNA de cada amostra. Colocar o gel na câmara de eletroforese e adicionar tampão TAE até os poços estão cobertos.</li>
		<li>Aplica 10 a 15 µ l de cada reação de PCR para um poço no gel. Também Adicione 5 µ l de um marcador de tamanho molecular. Em seguida, execute o gel por 30 min a 75 V.</li>
		<li>Uma vez concluída a execução, o gel usando um gerador de imagens de luz azul da imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. outras técnicas
<ol><li>
Expressão da proteína Nota: A expressão de proteínas de teste (YadA e EibD) tem sido descrito em detalhe em outro lugar,23,24. Este é um breve resumo das principais etapas.<ol>
<li>Transformar BL21ΔABCF ΔtamA with os necessários plasmídeos (YadA-pIBA2 e pEibD10 e os correspondente plasmídeos de controle) e selecione para transformants na LB + Amp.</li>
		<li>Para a expressão da proteína, inocular 100 mL de meio LB + Amp 1ml da cultura de bactérias transformadas durante a noite e crescer estas a 30 ° C até a fase log de mid, momento em que, induzir a produção de proteína com qualquer anhydrotetracycline (a 100 ng/mL) ou thiogalactoside isopropílico (a 0,5 mM).</li>
		<li>Depois de 2h de indução a 30 ° C, medir a turbidez das culturas e coletar um número de células, correspondente a 50 mL no OD600 = 1.0 por centrifugação as culturas por 15 min a 4.000 x g. Lave o pellet 1x com 10 mM HEPES, pH 7,4 e em seguida ou armazená-lo a-20 ° C ou processo etapa 6.2 ainda mais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extração de membrana externa Nota: Extração de membrana externa é realizada conforme descrito em detalhe por Leo et al . 27. as principais etapas estão resumidas a seguir.<ol>
<li>Ressuspender o pellet de células em 1 mL de 10 mM HEPES, pH 7,4, suplementado com 10 mM MgCl2 e MnCl2, lisozima (0,1 mg/mL) e uma pitada de DNase eu.</li>
		<li>Lise as células (por exemplo, usando um batedor do grânulo).</li>
		<li>Centrifugar as células em breve (2 min a 15.600 x g) para remover os detritos celulares e mover o sobrenadante para um tubo de fresco.</li>
		<li>Centrifugar as células por 30 min a 16.000 x g, após o qual, resuspenda o pellet em 400 μL de 1% N-lauroyl sarcosina em 10 mM HEPES, pH 7,4.</li>
		<li>Incube as celulas com agitação por 30 min à temperatura ambiente, após o qual, centrifugue-los durante 30 min como acima.</li>
		<li>Lave o translúcido da pelota 1x com 200 μL de 10 mM HEPES, pH 7,4, resuspenda-lo em 30 μL de 10 mM HEPES e adiciona 10 μL de tampão de amostra SDS-PAGE de 4x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensaios de atividade Nota: Realizar ensaios de SDS-PAGE e atividade para YadA e EibD como descrito28. As principais etapas estão resumidas a seguir.</li>
	<li>
SDS-PAGE
	<ol>
<li>Aquece as amostras a 50 ° C por 5 min antes de carregá-los em um gel de poliacrilamida, para evitar a desnaturação das proteínas.</li>
		<li>Após a separação em SDS-PAGE, transferi as proteínas para uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno.</li>
		<li>Após a transferência, bloquear a membrana com pó de leite desnatado 2% em PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Borrão do extremo-oeste YadA-colágeno
	<ol>
<li>Após o bloqueio, adicionar tipo de colágeno bovino que diluído em tampão de bloqueio a uma concentração de 10 μg/mL e incubar a membrana por 1h.</li>
		<li>Lavar a membrana 2 x com PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T).</li>
		<li>Adicione o anticorpo primário (anticorpo monoclonal anticolágeno COL-1) para a membrana, 1:2,000 diluído em tampão de bloqueio.</li>
		<li>Após a incubação da membrana por 1h, lave 2x como mencionado na etapa 6.3.2.2 e em seguida, adicione o anticorpo secundário [conjugado de peroxidase (HRP) de rábano-IgG de anticabra rato], 1:10,000 diluído em tampão de bloqueio.</li>
		<li>Incubar a membrana para 1 h e, em seguida, lave-o 2 vezes com PBS-T. Adicionar um substrato quimioluminescente reforçado para a membrana de acordo com as instruções do fabricante e detectar a banda usando uma câmera CCD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD-IgG ensaio
	<ol>
<li>Após o bloqueio, adicione um anticorpo secundário (de cabra anticoelho HRP), diluído 1:2,000 em tampão de bloqueio.</li>
		<li>Incubar a membrana para 1 h e, em seguida, lave-o 2 x com PBS. Execute a detecção quimioluminescente como mencionado na etapa 6.3.2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Transdução de P1 é um método rápido, robusto e confiável para a geração de exclusões de gene em e. coli. Isso é demonstrado aqui pelo transducing um mutante de exclusão de tamA de uma estirpe de doador de Keio para um destinatário BL21-derivado. As grandes etapas do processo de transdução são a produção do transducing lisada, a transdução em si, a excisão da fita Kan resistência e a verificação do knock-out pelo PCR. No total, o processo leva cerca de 1 semana e requer sem métodos de biologia molecular ...

Uma primeira abordagem comum para estudar a função de um gene é executar o mutagenesis de mata-mata e observar o fenótipo resultante. Isto também é denominado genética reversa. A bactéria e. coli tem sido o carro-chefe da biologia molecular nos últimos 70 anos, ou então, devido à facilidade do seu cultivo e sua acessibilidade para manipulação genética1. Vários métodos foram desenvolvidos para produzir exclusões de gene em e. coli, incluindo troca de marcador a mutagênese2,3 e, mais recentemente, recombineering usando o λ vermelho ou Rac ET sistemas4,5 , 6.
Em um sistema amplamente utilizado, codificação de sequências de genes individuais são substituídas por uma gaveta de resistência aos antibióticos que pode mais tarde ser extirpada do cromossoma5,7. As sequências de codificação são substituídas, por exemplo, uma gaveta de resistência de canamicina (Kan), que é ladeada por sites de destino (FRT) de reconhecimento de flipase (FLP) em ambos os lados. Os sites da FRT são reconhecidos pela recombinase FLP, que medeia a site-specific recombinação entre os sites FRT, levando à supressão da fita Kan. Desta forma, uma exclusão total de sequência de código de um determinado gene pode ser conseguida, deixando para trás apenas uma sequência de cicatriz mínima de aproximadamente 100 pares de bases (bp) (Figura 1).
Pouco mais de uma década atrás, foi desenvolvida a coleção chamada de Keio. Esta é uma biblioteca bacteriana com base em um padrão de laboratório cepa de Escherichia coli K12, onde quase todos os genes não essenciais foram individualmente excluídos por λ recombinação vermelho7,8. Os clones dentro de cada coleção tem uma sequência de código substituída com uma gaveta de resistência Kan sujeitas. A coleção de Keio provou para ser uma ferramenta útil para muitas aplicações9. Uma tal aplicação é a produção de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . A gaveta de Kan de um clone de exclusão determinada pode ser mobilizada por geralmente transducing bacteriófagos, tais como P110,11,12,13,14. Um estoque de fago preparado a partir de uma tensão tão grande pode ser usado para infectar um destinatário Escherichia coli cepa de interesse, onde em uma frequência baixa, mas de confiança o Kan região contendo gaveta pode ser incorporada o genoma destinatário por recombinação homóloga (Figura 2). Transductants podem ser selecionados para o crescimento em meio de Kan-contendo. Em seguida, se a remoção da fita resistência aos antibióticos é desejada, a recombinase FLP pode ser fornecido para a estirpe transductant em trans. Após a cura o plasmídeo contendo FLP, que transporta um marcador de resistência a ampicilina (Amp), clones de Kan e Amp-sensíveis são selecionados para, e a correta excisão de sequência de codificação a selvagem-tipo e a gaveta de Kan são verificadas por PCR de colônia.
Aqui, é apresentado um protocolo detalhado, descrevendo cada uma das etapas na produção de uma estirpe de Escherichia coli , baseado na estratégia delineada acima de mata-mata. Como exemplo, uma deleção do gene da tamA é demonstrada. tamA codifica uma proteína de β-barril de membrana exterior que é uma parte do transporte e módulo de montagem (TAM), que está envolvida na biogênese de certas proteínas autotransporter e pili15,16,17. Esta estirpe de mata-mata foi usado para examinar o efeito da exclusão tamA sobre a biogênese de dois autotransporter trimeric adesinas (TAAs), a Yersinia adesina YadA e a Escherichia coli imunoglobulinas (Ig)-vinculação TAA EibD 18,19.

<table><tbody><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BW25113</td><td>NIG</td><td>ME6092</td><td>Cepa selvagem da coleção Keio</td></tr><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Merck</td><td>69450-3</td><td>Cepa de expressão</td></tr><tr><td>E. coli BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>Derivado de BL21(DE3)</td></tr><tr><td>E. coli JW4179</td><td>NIG</td><td>JW4179-KC</td><td>tamA mutante de deleção</td></tr><tr><td>P1 vir</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>Geralmente transdução de bacteriófagos</td></tr><tr><td>Plasmídeos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td><td>plasmídeo replicante condicional com FLP</td></tr><tr><td>pASK-IBA2</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1301-000</td><td>vetor de expressão</td></tr><tr><td>pEibD10</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>para produção de EibD; plasmídeo disponível a pedido</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>vetor de expressão</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>para produção de YadA; plasmídeo disponível a pedido</td></tr><tr><td><forte>Produtos químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ácido</td> <td>acéticoThermoFisher</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>Anhidrotetraciclina</td><td>Abcam</td><td>ab145350</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anticolágeno tipo I COL-1</td><td>Sigma</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno bovino tipo I</td><td>Sigma</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato dissódico</td><td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>Corante de DNA</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de tamanho molecular de DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Mistura dNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP substrato</td><td>Advansta</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>VWR</td><td>24388</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-rato IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-coelho IgG-HRP</td><td>Agrisera</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil tiogalactosídeo</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Applichem</td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de manganês</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>N- lauroil sarcosina</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>tamA primário direto</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequência 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'</td></tr><tr><td>tamA primário inverso</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequência 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3'Taq</td></tr> <tr><td>DNA polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trissódico</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Merck</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</ câmara de</td> eletroforese em gel strong><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Hoefer</td><td>SUB13</td><td></td></tr><tr><td>Batedor de contas</td><td>Thermo</td><td>FP120A-115</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Kodak</td><td>4000R</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de eletroporação</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de eletroporação</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de imagens em gel</td><td>Nippon Genetics</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de incubação</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Forno de microondas</td><td>Samsung</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR</td><td>Biometra</td><td>Tpersonal</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de</td> <td>PCRAxygen</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>membrana PVDF</td><td>ThermoFisher</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de eletroforese SDS-PAG</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de transferência úmida</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

produzindo a deleção do gene na escherichia coli por transdução p1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Uma primeira abordagem para estudar a função de um gene desconhecido em bactérias é criar um knock-out deste gene. Aqui, descrevemos um protocolo robusto e rápido para transferência de mutações do gene exclusão de uma estirpe de Escherichia coli para outro usando transdução generalizada com o bacteriófago P1. Este método requer que a mutação seja selecionável (por exemplo, baseado em interrupções de gene usando inserções de gaveta antibiótico). Tais fitas antibióticas podem ser mobilizadas a partir de uma estirpe de doador e introduziram uma destinatário estirpe de interesse para rapidamente e facilmente geram um mutante de apagamento do gene. A gaveta antibiótica pode ser projetada para incluir sites de reconhecimento de flipase que permitem que a excisão da fita por um site-specific recombinase para produzir um nocaute limpo com apenas uma sequência de ~ 100-base-par-longa cicatriz no genoma. Demonstramos o protocolo ao nocautear o gene de tamA codifica um fator de montagem envolvido na biogênese de autotransporter e testar o efeito desse nocaute sobre a biogênese e a função de dois autotransporter trimeric adesinas. Embora a supressão do gene por transdução P1 tem suas limitações, a facilidade e rapidez de sua implementação seja uma alternativa atraente para outros métodos de apagamento do gene.

Geração de um tamA Knock-out de BL21ΔABCF:
A estratégia acima descrita anteriormente foi usada para produzir uma tensão derivada de BL21(DE3), uma estirpe de laboratório padrão usada para a produção de proteína, que é otimizada para a produção de proteínas de membrana exterior e chamada BL21ΔABCF21. Esta tensão não possui quatro genes que codificam para proteínas de membrana externa abundante e, con...

Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Este método é útil no campo da Microbiologia, como descobrir as funções de genes específicos. A principal vantagem deste método é que é uma maneira rápida e confiável de gerar mutantes knockout de E.Coli. Demonstrando este procedimento estará Thomas Trunk, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para infectar uma cepa de doador contendo uma deleção de gene baseada em um de antibiótico excisável, primeiro, cultive a bactéria em cinco mililitros de caldo de lisogenia, ou LB, com cloreto de cálcio de dez milimolares e, opcionalmente, com 25 microgramas por mililitro de canamicina, a uma densidade óptica de 600 nanômetros de cerca de 1,0. Faça uma série de diluições de um estoque de fago P1 existente no meio LB e misture 200 microlitros da suspensão bacteriana com 100 microlitros cada diluição de fago em tubos de centrífuga individuais de 15 mililitros. Incube os tubos estaticamente por 20 minutos a 37 graus Celsius.No final da incubação, adicione aproximadamente três mililitros de ágar topo fundido, suplementado com cloreto de cálcio dez milimolares aos tubos. Misture o conteúdo por vórtice e despeje as misturas em placas LB pré-aquecidas para fazer camadas uniformes. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius.Na manhã seguinte, selecione uma placa com um crescimento semi-confluente de placas de fago e use uma alça de inoculação para raspar a camada superior de ágar em um tubo de centrífuga. Sob a coifa, adicione um a dois mililitros de LB e uma gota de clorofórmio ao tubo e agite o tubo vigorosamente por um minuto. Pulverizar o ágar e as células bacterianas por centrifugação e transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga, evitando os detritos do sedimento.Em seguida, adicione duas gotas de clorofórmio e armazene o lisado a quatro a dez graus Celsius. Para a transdução P1, aumente a cepa receptora em LB para uma densidade óptica de um a 600 nanômetros e adicione cloreto de cálcio à cultura da cepa receptora a dez milimolares com mistura. Em seguida, adicione o volume apropriado de lisado de fago do topo da amostra para evitar a transferência do clorofórmio para um mililitro de cultura receptora para obter uma multiplicidade de infecção de 0,5 e incube estaticamente a mistura por 20 minutos a 37 graus Celsius.No final da incubação, interrompa a infecção adicionando citrato de sódio a 100 milimoles por litro e centrifugue as bactérias transduzidas. A adição de citrato de sódio após a transdução é uma etapa essencial, pois evita novas infecções por fagos de bactérias do tipo selvagem. Ressuspenda o pellet em um mililitro de LB fresco suplementado com citrato de sódio 100 milimolar e lave as células mais duas vezes para garantir a remoção de fagos livres e cálcio.Após a última lavagem, ressuspenda as bactérias em um mililitro de LB fresco, suplementado com citrato de sódio 100 milimolar. para uma incubação de uma hora a 30 graus Celsius a 100 RPM. No final da incubação, colete as bactérias por centrifugação e ressuspenda o pellet em cerca de 100 microlitros de LB suplementado com citrato de sódio 100 milimolar.Em seguida, espalhe as bactérias em uma placa LB suplementada com 25 microgramas por mililitro de canamicina e citrato de sódio dez milimolares e cultive as bactérias a 30 graus Celsius até que as colônias apareçam. Para selecionar os transdutores, coloque novamente as colônias em novas placas LB mais canamicina para crescimento de colônia única a 30 graus Celsius até que colônias únicas apareçam. Para extirpar o de canamicina, torne a cepa receptora resistente à canamicina eletrocompetente.Adicionar um picograma do ADN plasmático pCP20 codificador da recombinase à suspensão celular. Misture a suspensão suavemente e transfira-a para uma cubeta de eletroporação resfriada de um milímetro. Defina o eletroporador para 1,8 quilovolts para eletroporação das células e resgate as células transformadas com um mililitro de meio SOC por uma hora a 30 graus Celsius.Em seguida, coloque 100 microlitros de células em LB mais placas de ampicilina para cultura noturna a 30 graus Celsius. Na manhã seguinte, escolha colônias únicas para inoculação em LB fresco sem antibióticos e cultive as células durante a noite na temperatura não permissiva de 43 graus Celsius para induzir a expressão de flippase recombinase. Em seguida, coloque diluições seriais de 50 microlitros em placas não seletivas para cultura noturna a 30 graus Celsius e rastreie os clones que perderam seu de resistência a antibióticos.Após a transdução de P1 e a excisão do de canamicina, como acabamos de demonstrar, vários clones sensíveis à ampicilina e à canamicina podem ser obtidos, e a deleção bem-sucedida do gene tamA dentro dos clones pode ser verificada por PCR de colônia. Após a indução da produção de proteínas, as frações da membrana externa das culturas de expressão podem ser isoladas e analisadas por SDS-PAGE. Não são observadas grandes diferenças entre os níveis de expressão nas cepas parental e receptora de knockout para tamA, embora YadA pareça ser produzido em níveis um pouco mais baixos na cepa knockout.O oposto parece ser verdadeiro para o EibD. Para examinar se a falta de tamA pode influenciar o dobramento ou transporte correto das proteínas, a capacidade das proteínas de se ligarem aos liganos pode ser testada por um blot de colágeno far-western. Neste experimento representativo, o colágeno ligado ao YadA foi detectado em um nível semelhante nas cepas original e nocaute, demonstrando que a proteína é dobrada corretamente e funcional.Da mesma forma, as atividades de ligação de IgG de EibD nas duas cepas se correlacionaram com a expressão da proteína, demonstrando que a deleção de tamA não tem um efeito significativo na biogênese da adesina do autotransportador trimérico. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar uma boa técnica asséptica e lembrar de cultivar bactérias contendo pCP20 a 30 graus ou menos. Não se esqueça de que trabalhar com clorofórmio pode ser extremamente perigoso e que precauções, como trabalhar em uma capela e garantir proteção pessoal usando luvas resistentes a produtos químicos e jaleco, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Um método rápido e eficiente para integrar DNA estranho de juros em cepas pré-fabricados receptoras, chamadas de tensões almofada de aterragem, é descrito. O método permite site-specific integração de uma cassete de ADN no locus engenharia aterragem almofada de uma estirpe dada, por meio de conjugação e expressão da integrase ΦC31.

Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Sistemáticas e em grande escala genético sintético telas (gene-gene ou epistasia) interação pode ser usado para explorar a redundância genética e via de cross-talk. Aqui, descrevemos um alto rendimento quantitativo tecnologia de rastreamento genético sintético matriz, denominada eSGA que desenvolvemos para a elucidação de relações epistáticos e explorar redes de interação genéticos...

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Um eficiente do genoma método única mutação genética foi estabelecida...

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Fonte: Valentine, M. E., et al. Geração de mutantes de deleção de genes em Pseudomonas aeruginosa e teste de atenuação de virulência em um modelo simples de infecção em camundongos. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra a geração de recombinantes de cruzamento duplo em Pseudomonas aeruginosa usando uma estratégia de deleção de genes baseada em plasmídeo. O processo envolve a seleção de bactérias que abrigam um plasmídeo não replicativo integrado ao genoma por meio de um único cruzamento e,...

Gerando recombinantes de cruzamento duplo de Pseudomonas aeruginosa para deleção de genes direcionados

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

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Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos

Aqui, descrevemos um protocolo simples e reproduzível do modelo de infecção do rato para avaliar a atenuação das cepas geneticamente modificadas de Pseudomonas aeruginosa em comparação com os Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA) aprovado Escherichia coli para aplicações comerciais.

Geração de mutantes de deleção de genes no quadro em Pseudomonas aeruginosa e testes para atenuação de virulência em um modelo simples de infecção por camundongos

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