Name: Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprenda a gerar sistemas de transcrição binários tecido-específicos em Drosophila usando CRISPR/Cas9. Este método substitui o primeiro éxon codificante por drivers de transcrição para expressão gênica espacial e temporal precisa.

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Agradecemos o Dr. F. Porto, Dr. K. o ' Connor-Giles e Dr. S. Feng para discussões sobre estratégia CRISPR; Dr. T.B. Kornberg e o centro de estoque de Bloomington para reagentes; Instalação de núcleo de imagens de UMD; e financiamento do NIH: R00HL114867 e R35GM124878 ao Sr.

1. projetar e construir a gRNA vetor de expressão
<ol><li>Para precisamente substituir uma região tempo definida de um exon, use uma gRNA dupla abordagem6, em que cada gRNA pode alvejar especificamente duas extremidades da região selecionada de interesse. Para obter uma expressão spatiotemporal precisa de gene-específico do driver, selecione dois sites de destino gRNA dentro o primeiro exon codificação do gene.</li>
	<li>
Drosophila melanogaster, selecione os sites de destino gRNA usando a ferramenta de utilitário de destino ideal do flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Outras ferramentas de design CRISPR disponíveis podem ser usadas também, incluindo a ferramenta otimizado CRISPR Design (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9) e E-CRISP (www.e-crisp.org/E-CRISP). Nota: Os seguintes protocolos de gRNA design e clonagem foi adotada de métodos anteriormente descritos,6,7.<ol>
<li>Copie a sequência real na caixa fornecida na ferramenta on-line. Selecione mais recentemente Drosophila melanogaster genoma anotação versão lançada, "r_6", no menu suspenso para "Select genoma." No campo "Select guia comprimento (nt)," entrada "20". Selecione para encontrar "Todos os alvos CRISPR" e clique em "Encontrar CRISPR alvos".</li>
		<li>Avalie todos os alvos de gRNA candidato definindo "Máximo" para o "Rigor" e "NGG somente" para "PAM". Tente selecionar os sites gRNA sem qualquer potencial fora-alvo ou um número mínimo de possível fora-alvos. Uso da ferramenta web descrito em Doench et al 2014 8 para selecionar gRNAs com uma pontuação de "boa" atividade potencial.</li>
		<li>Simultaneamente, assegurar que não há nenhum polimorfismo de nucleotídeo único em alvos a gRNA no genoma da linha voar pai selecionado para injeção (E.g., n º s-Cas9 no cromossoma X, BL # 54591). Siga o protocolo descrito em Gratz et al . 20157 para extrair o DNA genômico de linha pai de voar. PCR amplificar, aproximadamente, 500 – 1.000 nt regiões usando as primeiras demão que flanqueiam a sequência de interesse e uma polimerase de DNA de alta fidelidade; sequência-Verifique se os produtos da PCR amplificado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para gerar um vetor de expressão em tandem gRNA, siga uma ligadura independente clonagem, protocolo6 para introduzir duas sequências de protospacer em um vetor de expressão de RNA pCFD4. Note-se que um vetor de expressão de multi-gRNA melhorado (pCFD5) agora está disponível, onde ambos os sgRNAs exprimem-se do forte U6:3 promotores9 (https://www.crisprflydesign.org). Use um método de montagem de DNA para clonar o gRNAs no vetor pCFD4.
	<ol>
<li>Projetar e ordenar as primeiras demão para diante e reversos para a introdução duas sequências de protospacer a pCFD4 de vetor de expressão de RNA (tabela 1A). Como descrito anteriormente,6, o primer frente contém a primeira sequência de protospacer, ladeada por regiões correspondentes ao promotor U6-1 e núcleo de gRNA em pCFD4; o reverso primer contém a sequência inversa complemento da segunda protospacer ladeado por regiões correspondentes ao núcleo gRNA e promotor de U6-3 em pCDF4.</li>
		<li>Resuspenda primers para 100 μM com DNase e RNase livre água bidestilada (ddH2O). Fazer uma cartilha de concentração de trabalho 10 do μM. Usar o plasmídeo pCFD4 como modelo e configurar a reação de PCR usando um polymerase de alta-fidelidade e recomendado configurações para reação de PCR6.</li>
		<li>Para clonar o produto amplificado em pCFD4, digerir pCFD4 do plasmídeo com enzimas BbsI Configurando a seguinte reação: 2 – 5 μg do plasmídeo pCFD4, 5 μL de tampão de digestão de 10x, 1 μL de enzima BbsI e ddH2O para trazer o volume final de 50 μL. Misture o conteúdo de reação suavemente tocando o tubo e recolher todas as gotas dispersas da parede do tubo ao fundo por uma breve volta. Incube a mistura de reação a 37 ° C por 2 h.</li>
		<li>Execute o produto do PCR da etapa 2 e digerido produto da etapa 3 em um gel de agarose 1%. Realize a eletroforese por tempo suficiente para separar completamente as bandas de DNA. Corte o correto tamanho bandas de DNA sob uma trans-iluminador UV antes de purificar os produtos esperados, usando a coluna de eluição de gel seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). O produto PCR deve ser 600 bp e o plasmídeo linear pCFD4 devem ser ~6.4 kb 6.</li>
		<li>Configurar a reação de montagem de DNA em um tubo de PCR, pelas instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>2 μL do produto montagem se transformar em bactérias competentes (DH5α ou cepas semelhantes com ΔrecA1, ΔendA1), placa de ampicilina (100 μg/mL) contendo placas de ágar LB (LB/Amp) e incubar a 37 ° C durante a noite. Observe que a combinação de Assembleia de DNA pode ser tóxica para certas estirpes de bactérias, mas diluir a mistura de montagem pode reduzir a toxicidade.</li>
		<li>Escolha 3 – 4 colônias ampicilina-resistentes da placa incubados durante a noite, inocular a colônia em 3 mL contendo 100 ampicilina μg/mL LB e crescer bactérias inoculadas em um shaker de 37 ° C durante a noite. Extraia o plasmídeo da bactéria durante a noite-cultivadas usando o plasmídeo prep mini kit seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Sequenciar os plasmideos com primer universal de T3 a tela para os corretos clones contendo a inserção de gRNA em tandem. Estabelece um estoque de glicerol de bactéria transformada com um pCFD4-gRNA sequência verificada em glicerol 20% e a loja em um freezer-80 ° C para uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. projetando e construindo o doador HDR
<ol><li>
Para genômico bater-de uma sequência de Gal4 ou LexA , desenha um doador HDR de dupla-hélice que contém a sequência de liberada, ladeada por dois braços de homologia.
	<ol>
<li>Uso > 1,5 kb deixou e braços certa homologia flanqueando o direcionamento de gRNA conceptuais. Braços estendidos homologia aumentam a eficiência do HDR durante o processo de reparação 10.</li>
		<li>PCR amplificar os braços de homologia de DNA genômico (gDNA) extraído da linha voar pai selecionada para injeção (E.g., n º s-Cas9 (no cromossoma X), BL # 54591). Use uma prova de leitura início quente Taq DNA polimerase enzima apropriada para a longa extensão PCR (veja a Tabela de materiais). Verifica a sequência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para evitar o redirecionamento da gRNA para o locus engenharia, desenha o doador de substituição de tal forma que os sites de reconhecimento gRNA são perturbados pela sequência exógena introduzida. Nota: para evitar de alterar os elementos cis-regulatórios putativos, sempre selecione os sites de reconhecimento de gRNA dentro da região de exon a codificação.</li>
	<li>
Para a geração de uma fita de substituição, planejar a estratégia de montagem do DNA para unir quatro segmentos: os braços de homologia 5' e 3', a sequência de DNA médio liberada exógenos e a clonagem linear vector coluna vertebral (por exemplo, pUC19 ou outros comumente utilizados vectores de clonagem). Seguindo orientação do fabricante para montagem de DNA (ver tabela de materiais), desenha os primers adequados para amplificação por PCR e montagem de cada segmento. Resuspenda primers para 100 μM com DDQ2Make O. uma cartilha de concentração de trabalho 10 do μM. Use o polymerase de alta fidelidade para todas as reações de PCR. Siga o seguinte protocolo:
	<ol>
<li>PCR amplificar uma gaveta de expressão Gal4 ou LexA de um vetor de disponível (por exemplo, nls-LexA:p65; o plasmídeo de expressão ideal Gal4/LexA/QF2 pode ser encontrado e obtido de recursos comuns, tais como Addgene) usando o primeiras demão listadas na tabela 1B.<ol>
<li>Para reter todos os originais regulamentos transcricionais e pós-transcricional do exon substituído na expressão da sequência de DNA liberada, desenha a fita de modo que o alelo genômico editado expressaria um RNAm quimérico do liberada e o gene. Preserve a extremidade 5' e 3' do exon direcionado para reter qualquer sinal de emenda.</li>
			<li>Incorpore uma sequência de peptídeo Self chicotada T2A entre residual 5' codificação exon e a sequência liberada para impedir a tradução em uma proteína quimérico. Adicione um códon de parada de tradução após a sequência de liberada exógenos (Figura 5).</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR amplificar os braços de homologia de DNA genômico (gDNA) extraído da linha voar pai selecionada para injeção (E.g., n º s-Cas9 (no cromossoma X), BL # 54591) usar as primeiras demão listados na tabela 1B. Use polymerase de alta fidelidade para todas as reações de PCR utilizando os sistemas da seguinte forma: 5 μL de 5x do amortecedor da reação, 0,5 µ l de dNTPs 10 mM, 1.25 μL de 10 μM para a frente, Primer, 1.25 μL de 10 μM Primer Reverse, 0,5 μL de DNA modelo, 0.25 μL de DNA polimerase de alta-fidelidade , 16.25 μL de DDQ2O.</li>
		<li>Usa o vetor de clonagem linear como pUC19. Um número de vetores de doadores está agora disponível. Ver uma lista completa para o seguinte site-http://flycrispr.molbio.wisc.edu.</li>
		<li>Execute os produtos PCR em um gel de agarose 1%. Realize a eletroforese por tempo suficiente para garantir uma clara separação entre a banda desejada das bandas inespecíficas indesejadas (se houver). Gel-purifica os fragmentos de DNA a esperada. Medir a concentração de cada fragmento de DNA purificado utilizando um espectrofotômetro.</li>
		<li>Configure a reação de montagem de DNA seguindo as instruções do fabricante. Misturar os fragmentos clonagem linear vector e alvo do passo 3 e passo 4 na seguinte reação: 1 μL de linear clonagem vector (50 ng/μL), excesso de dobra de 2 – 3 de cada fragmento do alvo, 10 μL de 2 x mistura mestre da montagem de DNA, trazer o volume final de reação de 20 μL com DDQ < C21 > 2O. Incubar a mistura de reação durante 1 hora a 50 ° C.</li>
		<li>Transforme 2 μL do produto montagem em bactérias competentes, placa em placas de ágar LB/Amp contendo 100 ampicilina μg/mL. Também, adicione X-galão + IPTG na placa para rastreio de azul/branco.</li>
		<li>Escolha 3 – 4 colônias brancas da placa incubados durante a noite, inocular a colônia em 3 mL contendo 100 ampicilina μg/mL LB e cresce a 37 ° C durante a noite em uma coqueteleira. Manual do extrato de plasmídeo da bactéria durante a noite-cultivadas usando o plasmídeo prep mini kit seguindo o fabricante (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Tela da colônia positiva por PCR ou restrição de digestão.</li>
		<li>Sequência verificar a região do doador HDR do plasmídeo final. Salve um estoque bacteriano transformado com os clones corretos em glicerol 20% a-80 ° C para inoculação de futura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. embrião injeção, mosca genética e rastreio para edição de genoma
<ol><li>Preparar a alta vector de expressão livre de endotoxinas gRNA pureza, bem como o plasmídeo de doador HDR usando um plasmídeo maxiprep kit (veja a Tabela de materiais).</li>
	<li>Co injete o plasmídeo de expressão gRNA (100 ng/μL) e o doador de reposição (500 ng/μL) do germline de N º s-Cas9 embriões6. Nota: nós usamos um serviço comercial para a injeção, mas este procedimento pode ser realizado em laboratório também.</li>
	<li>
Voe, genética e rastreio (Figura 2 e Figura 3):
	<ol>
<li>Quando os embriões injetados desenvolvem-se em adultos, cruz cada único G0 voa para balanceador moscas. Selecione o balanceador apropriado para o cromossomo contendo o alelo alvo.</li>
		<li>Anestesia o F1 descendentes de cada G0 cruzam sobre uma almofada de2 CO e escolher aleatoriamente 10-20 machos sob um estereomicroscópio. Cruzá-los individualmente para as fêmeas de balanceador conforme mostrado na Figura 3.</li>
		<li>Quando a escotilha de larvas de F2, escolher o único pai de F1 de cada cruzamento e extrair gDNA usando o única mosca genomic DNA preparação protocolo:<ol>
<li>Preparar gDNA solução tampão: pH 10 mM Tris-Cl 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM de NaCl, armazenar em temperatura ambiente. Prepare-se 20 mg/mL solução de Proteinase K e guarde no congelador.</li>
			<li>Coloque cada mosca em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e rótulo do tubo. Manter em freezer a-80 ° C durante a noite.</li>
			<li>Preparar um volume de trabalho fresca de gDNA solução tampão contendo a concentração final de 200 µ g/mL de Proteinase K. Nota: Não utilize um buffer antigo para esta etapa.</li>
			<li>Espremer cada mosca para 10-15 s com uma ponta de pipeta contendo 50 μL de esmagar o tampão sem dispensar o líquido. Dispense o buffer restante no tubo e misture bem. Incube a 37 ° C, durante 20 a 30 min.</li>
			<li>Colocar os tubos no bloco de calor 95 ° C por 1 – 2 min inactivar a Proteinase K.</li>
			<li>Spin para baixo por 5 min a 10.000 x g. Armazene a preparação em 4 ° C para posterior análise PCR.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use o mesmo método para preparar gDNA de uma mosca de N º s-Cas9 , que serve como um controle negativo. Executar telas PCR com base em três etapas para identificar o corretas "extremidades fora" HDR (Figura 2, Figura 5) usando gDNA de cada macho F1 como um modelo5. Use 1 μL da preparação do DNA no sistema de reação de PCR seguinte: 10 μL de 2x PCR Master Mix com tintura, 1 μL de cada primer (10 μM), 1 μL do molde do ADN e 7 μL de DDQ2O.</li>
	<li>Como mostrado na Figura 5A, realizar PCR utilizando primers fwd1 e rev1 a tela para a existência da inserção ou substituição; realizar PCR utilizando primers fwd2 e rev2 para verificar a inserção ou substituição de 3' região; Realize PCR utilizando primers M13F e rev3 para verificar "termina em" HDR (tabela 1).</li>
	<li>Manter as linhas de voar com o HDR de extremidades-fora confirmado e estabelecer ações equilibradas da geração F2. Outcross para as moscas balanceador novamente para remover quaisquer mutações não intencionais em outros cromossomos.</li>
	<li>
Preparar gDNA de alta qualidade das existências estabelecidas para amplificar o PCR longo (> 800 – 1.000 nt) amplicon com polymerase de Taq de alta-fidelidade e totalmente sequência verificar os amplicons obtidos a partir das regiões genômicas engenharia. Como alternativa, usar extrato bruto gDNA conforme descrito anteriormente para amplificar mais curto (< 800 nt), sobreposição de produtos PCR para validar a sequência do genoma editado. Use o seguinte protocolo para preparar o DNA genômico de Drosophila de boa qualidade:
	<ol>
<li>Colocar cerca de 25 adultas moscas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e congelar no freezer-20 ° C ou -80 ° C durante pelo menos 1 hora.</li>
		<li>Adicionar 250 μL da solução A (pH 9.0 Tris HCl 0,1 M, EDTA 0,1 M, SDS 1%).</li>
		<li>Homogeneizar as moscas usando os homogeneização macacos em tubos microcentrifuga e colocar o tubo no gelo.</li>
		<li>Incube a 70 ° C durante 30 min.</li>
		<li>Adicione 35 μL de KOAc (5 M), shake e misture bem, mas fazer não vórtice.</li>
		<li>Incube no gelo por 30 min.</li>
		<li>Girar a 12.000 x g por 15 min.</li>
		<li>Com uma micropipeta de 1 mL, cuidadosamente apenas o sobrenadante claro de transferência para um novo tubo, deixando voltar qualquer precipitado ou interfase.</li>
		<li>Adicione 150 μL de isopropanol para o sobrenadante. Misture suavemente por inversão.</li>
		<li>Girar a 10.000 x g por 5 min.</li>
		<li>Retire o sobrenadante cuidadosamente e deixar a pelota no tubo.</li>
		<li>Lavar o sedimento com 1 mL 70% EtOH.</li>
		<li>Girar a 12.000 x g por 5 min.</li>
		<li>Remova o sobrenadante. Ar seco a pelota por 15 a 20 min. Não seque a pelota.</li>
		<li>Dissolva a pelota em 100 μL de DDQ2O.</li>
		<li>Use alta fidelidade DNA polimerase apropriado para amplicon longo (> 800 bp) para amplificar a região completa editada. Idealmente, tome duas primeiras demão fora a fita inserida para amplificar a região genômica. Gel de purificar o produto do PCR, e conforme descrito anteriormente, a sequência verificar o produto com múltiplos primers sobrepostos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Valide os padrões de expressão spatiotemporal correto de embriões e tecidos dissecados das linhas projetadas voar:
	<ol>
<li>Execute o RT-PCR do RNA total para verificar a expressão do produto híbrido do mRNA (tabela 1).</li>
		<li>Execute uma hibridação in situ do produto do interesse em tecidos/embrião larval para validar a expressão do mRNA.</li>
		<li>A tela para os padrões de exata expressão spatiotemporal de tecido-específica entre as sequência-verificado linhas de extremidades-out, atravessar cada uma das linhas editadas obtidos para o driver de expressão binário com o seguir- GFP ou seguir- RFP (para LexA motorista) (disponível a partir dos centros de estoque Bloomington) de linha e observar o LexA ou Gal4 conduzido a expressão do gene repórter em tecidos de larvas e adultos de embrião, sob um microscópio de fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).</li>
<li>Lin, C. -C., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+Transgenic+DNA+Components+by+Inducible+Gene+Replacement+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).</li>
<li>Li, W., Köster, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control%2C+modeling%2C+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biology. 16 (1), 281(2015).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Tradicionalmente, as armadilhas potenciador de Drosophila foram geradas por dois métodos diferentes. Uma das maneiras inclui inserção aleatória de um driver (eg., Gal4) sequência no genoma por transposição (EG., transposição de P-elemento)1 . Alternativamente, as sequências de motorista podem ser colocadas sob o controle transcricional de uma região de putativo realçador/promotor em uma construção do plasmídeo, que iria então ser integrada em um site de gravidez ectópica...

A caixa de ferramentas genética para a expressão do gene alvo bem desenvolveu-se em Drosophila, tornando-o um dos melhores sistemas de modelo para investigar a função de genes envolvidos em uma ampla variedade de processos celulares. Sistemas de expressão binário, como fermento Gal4/UAS (sequência de ativação upstream), foi adotado inicialmente por misexpression de trapping e gene potenciador de tecido-específica na drosófila genética modelo1 (Figura 1). Este sistema facilitou o desenvolvimento de um grande número de técnicas como spatiotemporal regulamento da superexpressão do gene, misexpression, nocaute em grupos selecionados de células, bem como em ablação de célula, marcação de célula, ao rastreamento de celular e molecular processos em embriões e tecidos, rastreamento de linhagem e análises de mosaico durante o desenvolvimento. Um número do sistema binário de transcrição, tais como o bacteriana LexA/ sistemaLexAop (Figura 1) e Q-sistema de Neurospora , são poderosas ferramentas genéticas que são amplamente utilizadas em Drosophila, além de o sistema original de Gal4/UAS para expressão de gene alvo a1,2,3.
Aqui, apresentamos um método para gerar o sistema altamente confiável tecido-específica de expressão binário empregando uma técnica de edição de genoma. Aos recentes avanços na tecnologia de edição CRISPR/Cas9 genoma permitiu oportunidades sem precedentes para fazer mudanças de direção do genoma em uma ampla gama de organismos. Em comparação com outras técnicas de edição disponíveis do genoma, o sistema CRISPR/Cas9 é barato, eficiente e confiável. Esta tecnologia utiliza componentes do sistema imune adaptativo bacteriano: uma endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes que cria uma ruptura da dobro-Costa (DSB) e um RNA guia Quimérico (gRNA), que orienta a Cas9 para um site específico do genoma para alvo de ORL4. As células contêm a maquinaria para reparar o ORL usando diferentes caminhos. Não-homóloga final juntando (NHEJ) leva a pequenas inserções ou exclusões para perturbar a função dos genes, enquanto reparo homologia-dirigido (HDR) introduz um definido dirigido/desejável genômica em/TOC-nocaute usando um doador HDR exógeno como um modelo. A estratégia de substituição baseada em HDR com eficiência pode ser utilizada para gerar um sistema altamente confiável expressão binário de tecido-específica, que pode superar todas as limitações dos métodos tradicionais potenciador armadilha. Descrevemos um procedimento passo a passo para a utilização do reparo HDR CRISPR/Cas9-baseado na geração de uma linha de driver binário da transcrição que se expressa sob o controle de endógena regulação transcricional e pós-transcricional de um da drosófila gene. Neste protocolo, demonstramos a geração de uma linha de motorista específica para branchless (bnl) gene que codifica uma proteína de família FGF que regula a morfogênese de ramificação da via aérea traqueal epitélio5. Neste exemplo, o primeiro exon codificação do gene da bnl foi substituído pela sequência de uma sequência de liberada bacteriana LexA sem alterar qualquer endógena cis-sequências reguladoras do gene do bnl . Mostramos que a estratégia gerou uma linha de motorista bnl-LexA que spatiotemporally controla a expressão de um gene repórter, colocado a jusante do LexAoperator (LexAop ou seguir) exclusivamente na bnl- expressando as células epiteliais/mesenquimais/neuronal.

<table><tbody><tr><td>X-Gal/IPTG</td><td>Gentrox (Genesee Scientific)</td><td>18-218</td><td>clonagem</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>BD Difco</td><td>BD&nbsp; 244520</td><td>clonagem</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td>Biologia Molecular</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1161</td><td>Biologia Molecular</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Biologia Molecular</td></tr><tr><td>UltraPure DNase / RNase Livre Água</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td>Biologia Molecular</td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71736</td><td>Biologia Molecular</td></tr><tr><td>KOAc</td><td>Fisher-Scientific</td><td>P1190</td><td>Biologia Molecular</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher-Scientific</td><td>04-355-451</td><td>Biologia Molecular</td></tr><tr><td>GeneJET Miniprep</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td>Miniprep</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210006</td><td>Maxiprep</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R0539S</td><td>Primers de enzima de restrição</td></tr><tr><td></td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>pCFD4</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>DNA modelo e vetor para gRNA</td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td> <td>Kapa biosystems</td><td>KK2601</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Q5-alta fidelidade Taq</td><td></td><td>NEB NEB #M0491</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>NEB #E2611</td><td>Montagem de DNA</td></tr><tr><td>pBPnlsLexA: p65Uw</td> Modelo de DNA <td>Addgene</td><td></td><td>para amplificação LexA</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td>Biologia Molecular</td></tr><tr><td>2x PCR PreMix, com corante (vermelho)</td> <td>Sydlab</td><td>MB067-EQ2R</td><td>Kit</td></tr> de <tr><td>eluição em gel</td> de biologia molecular <td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td> <td>11-300</td><td></td></tr><tr><td>Reagente</td> <td>TRI de biologia molecularKits de</td> purificação de RNA Sigma-Aldrich <td></td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>Direct-zol</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-330</td><td>Biologia Molecular</td></tr><tr><td>OneTaq One-Step RT-PCR Kit</td><td>NEB</td><td>E5315S</td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>lexO-CherryCAAX</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>Linha de moscas</td></tr><tr><td>UAS-CD8:GFP</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Linha de mosca</td></tr><tr><td>btl-Gal4</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Linha de mosca</td></tr><tr><td>MKRS/TB6B</td><td>Laboratório</td><td></td> Kornberg <td>Linha</td></tr><tr><td>de mosca Microscópio confocal SP5X</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging padrão de expressão</td></tr><tr><td>CO2 estação</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td>mosca empurrando</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>mosca empurrando</td></tr><tr><td>Pilões homogeneizadores de microtubos</td><td>Fisher-Scientific</td><td>03-421-217</td><td>isolamento de DNA genômico</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>quantificação de DNA</td></tr></tbody></table>

uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em drosophila editando genoma

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Sistemas de transcrição binário são poderosas ferramentas de genéticas, amplamente utilizadas para visualizar e manipular a célula destino e gene expression em grupos específicos de células ou tecidos em organismos-modelo. Estes sistemas contêm duas componentes linhas transgénicas. Uma linha de motorista expressa um ativador transcricional sob o controle de promotores/potenciadores de tecido-específica e uma linha de repórter/efetoras portos um gene alvo colocado a jusante para o sítio de ligação do ativador da transcrição. Animais, abrigando os dois componentes induzem transactivation tecido-específica de uma expressão de gene alvo. Preciso spatiotemporal expressão do gene nos tecidos alvo é crítica para interpretação imparcial da atividade celular/gene. Portanto, é essencial desenvolver um método para gerar linhas de motorista exclusivo de célula/tecido-específica. Aqui nós apresentamos um método para gerar o sistema altamente específicos do tecido-alvo expressão empregando um "Clustered regularmente Interspaced curta palíndromo Repeat/CRISPR-associado" (CRISPR/Cas)-com base técnica de edição de genoma. Neste método, a endonuclease Cas9 é alvo de dois quimérico guia RNAs (gRNA) para locais específicos no primeiro exon codificação de um gene no genoma de Drosophila para criar quebras de dobro-Costa (DSB). Posteriormente, usando um plasmídeo exógena do doador que contém a sequência de liberada, a maquinaria de reparo celular-autónoma permite reparação homologia-dirigido (HDR) de ORL, resultando em preciso exclusão e substituição do exon com a liberada sequência. A batido em liberada é expressa exclusivamente nas células onde o cis-elementos reguladores do gene substituído são funcionais. O protocolo passo a passo detalhado apresentado aqui para gerar um binário driver transcriptional expressado em Drosophila fgf/branchless-produção de células epiteliais/neuronal pode ser adotado para qualquer expressão de gene - ou tecido-específica.

Este protocolo foi utilizado com sucesso para gerar um alvo expressão binário repórter sistema específico para bnl expressando células5. O cis-elementos reguladores (CREs) que controlam a expressão complexa spatiotemporal bnl não são caracterizados. Portanto, para alcançar expressão spatiotemporal sob o controlo da sequência reguladora endógena bnl , somente o primeiro exon codificação do bnl foi projetado para ser subst...

Aqui, apresentamos um método para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila , substituindo o primeiro exon codificação de genes com drivers de transcrição. O método baseado em CRISPR/Cas9 coloca uma sequência liberada sob o Regulamento endógena de um gene substituído e, consequentemente, facilita a expressão de transctivator exclusivamente em padrões spatiotemporal gene-específico.

Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

O objetivo geral deste método é gerar um sistema de expressão direcionada altamente específico do tecido. Neste método, demonstramos a geração de um driver transcricional binário específico para o nosso homólogo Drosophila FGF, sem ramificações. Expressão dinâmica e esposte de sem ramificações regula hemogênese de epitélio traqueal das vias aéreas.Embora este método possa fornecer uma visão da expressão espostetemporal e migração de células produtoras sem ramificações, ele pode ser facilmente aplicado a outros genes e tecidos em Drosophila ou em outros organismos modelo, como C.Elegans e zebrafish. A principal vantagem dessa técnica é que ela gera sistemas de expressão altamente confiáveis, específicos de tecidos e genes, e ativos exclusivamente em células onde os elementos regulatórios cis do gene substituído são funcionais. Sistemas de transcrição binária são ferramentas essenciais para a expressão e manipulação genética direcionada.Um ativador trans, como GAL4 ou LexA, expresso sob o controle de elementos regulatórios cis de um gene, impulsiona um gene trans efeitoor que é colocado a jusante de sites específicos de ligação de transcrição, como UAS para GAL4 e/ou LexO para LexA.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo descreve um método de triagem para identificar moscas transgênicas de Drosophila, cujo genoma foi modificado usando CRISPR-Cas9. O CRISPR-Cas9 é uma poderosa ferramenta de edição de genoma que revolucionou a maneira como os cientistas podem manipular o genoma de um organismo. No protocolo de exemplo, veremos como identificar mutantes gerados por CRISPR, em que uma inserção de uma sequência de transativação substitui o primeiro éxon do gene branchless (bnl), criando assim uma linha de...

Triagem para modificações genômicas: um método para identificar mutantes gerados por CRISPR em Drosophila

Técnicas de recombinação homóloga avançar...

Recombineering Construções recombinação homóloga em<em&gt; Drosophila</em

Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

A validação experimental da atividade do intensificador é melhor abordada pela análise de perda de função. Apresentado aqui é um protocolo eficiente que usa deleção mediada por CRISPR / Cas9 para estudar a regulação específica do alelo da transcrição gênica em células F1 ES que contêm um genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Genoma alvo edição no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem sido facilitada pela emergência de abordagens baseadas em CRISPR. Aqui, descrevemos um protocolo simplificado, robusto para a geração e a identificação de alelos CRISPR-derivado absurdo que incorpora o ensaio de mobilidade doheteroduplex e identificação de mutações usando sequenciamento de próxima geração.

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso da enzima Cas13D com destino a RNA (RfxCas13D) em moscas.

RNA onipresente e específico para tecidos em Drosophila Melanogaster usando CRISPR/CasRx

Este trabalho apresenta os protocolos passo-a-passo para a mutagênese CRISPR/Cas9 da mosca da fruta oriental Bactrocera dorsalis. Passos detalhados fornecidos por este protocolo padronizado servirão como um guia útil para a geração de moscas mutantes para estudos de genes funcionais em B. dorsalis.

Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Aqui, apresentamos um protocolo simplificado de marcação gênica endógena para Drosophila, que utiliza uma técnica baseada em PCR para identificação livre de marcadores de modificações genéticas bem-sucedidas, facilitando o desenvolvimento de linhagens estáveis.

Estratégia baseada em CRISPR em uma etapa para marcação gênica endógena em Drosophila melanogaster

Este artigo toma como exemplo a transgênese mediada por integrase phiC31 em Drosophila e apresenta um protocolo otimizado para microinjeção de embriões, uma etapa crucial para a criação de moscas transgênicas.

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

Aprenda a gerar sistemas de transcrição binários tecido-específicos em Drosophila usando CRISPR/Cas9. Este método substitui o primeiro éxon codificante por drivers de transcrição para expressão gênica espacial e temporal precisa.

Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma

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