Deteção de immunohistochemical da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina no desenvolvimento e Mouse Postmitotic Retina

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da metilação do DNA, como alterações na cromatina durante o desenvolvimento da retina na retina pós-mitótica. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada de forma robusta em qualquer seção de todos os tecidos da retina de camundongos que transportam distribuição de 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcitosina que são processados em uma abordagem semelhante. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de preparação e coloração do tecido são difíceis de aprender, porque se as preparações histológicas congeladas estiverem sendo usadas, o tecido organizacional e original valioso pode ser perdido.

Demonstrando o restante do procedimento estará Pablo Diaz, pesquisador associado de nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, use uma agulha de calibre 29 de meia polegada para perfurar os olhos de um camundongo decapitado sacrificado no lado dorsal dos olhos. Para obter oculares, enuclee imediatamente os olhos cortando ao redor da esclera com uma tesoura oftálmica fina para remover a córnea e o cristalino.

Fixe as oculares e os olhos inteiros E16 em 4% de paraformaldeído ou PFA em 1xPBS pH 8,0 por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave-os duas vezes em um mililitro de 1xPBS em temperatura ambiente por 10 minutos. Para crioproteger as conchas oculares e os olhos inteiros, incube-os em 1xPBS pH 8,0 com 10% de sacarose em temperatura ambiente por uma hora.

Em seguida, em 20% de sacarose em 1xPBS por uma hora. E, finalmente, em 30% de sacarose em 1xPBS a 4 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, incorpore as oculares e os olhos no composto de temperatura de corte ideal, ou OCT, em criomoldes.

Em seguida, congele-os em um banho de etanol com gelo seco e mantenha a 80 graus Celsius. Antes de iniciar a criossecção, remova os moldes com oculares embutidos e olhos a 80 graus Celsius. Coloque-os em um suporte de criostato e deixe-os equilibrar a 20 graus Celsius por uma hora.

Usando um criostato a 20 graus Celsius, corte seções transversais da retina com 12 micrômetros de espessura paralelas ao eixo temporonasal através da cabeça do nervo óptico. Monte as seções em lâminas de microscópio e armazene a 80 graus Celsius. Para iniciar a imunocoloração, use uma caneta de barreira hidrofóbica para circundar as seções da retina montadas em lâminas.

Lave as seções uma vez com 200 microlitros de 1xPBS por 10 minutos. Permeabilize as seções com 200 microlitros de PBST por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, desnature-os com 200 microlitros de ácido clorídrico 2 normal cuidadosamente titulado na hora em 1xPBS por 45 minutos a 37 graus Celsius para otimizar o sinal de 5mC.

Após a desnaturação, adicione 100 microlitros de 0,1 Tris-HCl pH 8,3 nas seções da retina e incube por 10 minutos em temperatura ambiente para neutralizá-las. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de bloqueio. E incube as seções em uma câmara de umidade em temperatura ambiente por uma hora.

Adicione os anticorpos apropriados, diluídos de um a 500 em solução de bloqueio, às seções e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave as seções três vezes por 10 a 15 minutos cada com 0,1% de PBST. Adicionar anticorpos secundários apropriados diluídos de um a 1000 em solução de bloqueio contendo solução de DAPI à temperatura ambiente durante uma hora.

Em seguida, lave as lâminas três vezes com um mililitro de 0,1% PBST por 10 minutos cada. Após a última lavagem, adicione meio de montagem aquoso. Cubra com uma lamínula.

E então prossiga com a microscopia confocal. Após a imunomarcação retiniana em E16, o sinal de 5mC foi forte nos cromocentros dos núcleos celulares e presente em um nível muito mais baixo em todos os núcleos celulares. A coloração de 5hmC foi encontrada exclusivamente nos núcleos celulares e ausente dos cromocentros.

Na retina P0, os sinais de 5mC e 5hmC estavam presentes na camada externa de neuroblastos e na camada interna de neuroblastos. O sinal de 5mC foi forte nos cromocentros e na periferia nuclear dos núcleos celulares, e mais fraco entre os cromocentros dos núcleos celulares. A coloração de 5hmC foi restrita ao núcleo da célula.

Na retina P15, na camada nuclear externa, o sinal de 5mC foi detectado nos cromocentros dos núcleos celulares e na periferia nuclear. Enquanto o sinal de 5hmC estava em todos os núcleos celulares, exceto nos cromocentros. Na camada interna de células nucleares e ganglionares, o sinal de 5mC foi forte nos cromocentros dos núcleos celulares e fraco nos núcleos inteiros das células.

Já o sinal 5hmC foi encontrado em todos os núcleos celulares, exceto nos cromocentros. Nos fotorreceptores de bastonetes adultos, o sinal de 5mC foi limitado ao cromocentro e à periferia nuclear, enquanto o sinal de 5hmC foi restrito à periferia nuclear. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tratar os cortes histológicos com a exposição ideal de HCl, que é de 30 minutos.

Se a exposição for menor ou maior, os resultados ideais não podem ser reprodutíveis. Após este procedimento, outros métodos, como cromatografia líquida de alta pressão, espectrometria de massa podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quantificação de alterações na medição de 5-metilcitosina e 5-hidroximetilcitosina. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do desenvolvimento neural explorarem mudanças epigenéticas na cromatina.

Não se esqueça de que trabalhar com HCl e PFA pode ser extremamente perigoso, e cuidados, como descarte adequado, devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.