Name: Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco epiteliais limbais de células pluripotentes humanas sem uso de células alimentadoras. Este método eficiente e escalável produz células de qualidade clínica para terapias de substituição de córnea.

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O estudo foi apoiado por Academia da Finlândia (número de concessão 297886), o programa de peças humanas de Tekes, o finlandês agência de financiamento para tecnologia e inovação, o olho finlandês e Fundação do banco de tecido e Fundação Cultural finlandesa. Os autores graças os técnicos de laboratório biomédico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt e Outi Heikkilä para assistência técnica excelente e contribuição para a cultura de células. Professor Katriina Aalto-Setälä é reconhecido para fornecer a linha de hiPSC usado e facilidade de BioMediTech Imaging Core para fornecendo equipamentos para tratamento de imagens de fluorescência.

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Os autores não têm nada para divulgar.

O resultado esperado deste protocolo é a geração bem sucedida e robusta de LESCs de uma suspensão de célula única do FF hPSC dentro aproximadamente 3,5 semanas. Como o epitélio corneano se desenvolve a partir do ectoderma de superfície29, o primeiro passo do protocolo visa hPSCs para esta linhagem de direção. Uma indução curto 24 h com a transformação de fator de crescimento beta (TGF-β) antagonista SB-505124 e bFGF são utilizados para induzir a diferenciação ectodérmica, seguida por mesodérmica s...

A córnea transparente na superfície ocular permite que a luz entra na retina e fornece a maioria do poder refrativo do olho. A camada mais externa, o epitélio estratificado da córnea, é continuamente regenerada por estroma de células tronco epiteliais (LESCs). Os LESCs residem na camada basal dos nichos estroma no corneoscleral junção1,2. LESCs falta de marcadores específicos e exclusivos, por sua identificação requer uma análise mais abrangente de um conjunto de marcadores putativos. P63 do fator de transcrição epiteliais e especialmente N-terminal truncada transcreva a isoforma alfa do p63 (ΔNp63α), tem sido proposto como um relevante positivo LESC marcador3,4. Divisão assimétrica de LESCs lhes permite renovar o Self, mas também produzir descendência que migra centripetamente e anteriormente. Como as células de progresso em direção à superfície da córnea eles gradualmente perdem sua stemness e finalmente terminalmente diferenciar superficial de células escamosas que perdem-se continuamente da superfície da córnea.
Danos a qualquer uma das camadas da córnea pode levar à severa deficiência visual, e defeitos corneais são, portanto, uma das principais causas de perda de visão em todo o mundo. Na deficiência de estroma de células estaminais (LSCD), ao limbo é destruído pela doença ou trauma que leva a conjunctivalization e opacificação da superfície da córnea e subsequente perda de visão5,6. Terapia de reposição celular usando enxertos de limbo autólogos ou alogênico oferece uma estratégia de tratamento para pacientes com LSCD4,7,8,9. No entanto, colheita de enxertos autólogos carrega um risco de complicações para o olho saudável, e tecido doador está em falta. Células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), especificamente as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs), pode servir como uma fonte ilimitada de tipos de células clinicamente relevantes, incluindo as células epiteliais da córnea. Portanto, hPSC-derivado LESCs (hPSC-LESCs) representam uma fonte de celular novo atrativo para terapia de reposição celular ocular.
Tradicionalmente, ambos os métodos de cultura hPSC indiferenciadas e seus protocolos de diferenciação para LESCs têm contado com o uso de células alimentador indefinido, soros de animais, mídia condicionadas ou membrana amniótica10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recentemente, esforços na direção de produtos de terapia celular mais seguros tem solicitado a procura de mais protocolos padronizados e xeno-livre cultura e diferenciação. Como resultado, vários métodos definidos e xeno-livre para cultura a longo prazo de hPSCs indiferenciadas estão agora comercialmente disponíveis16,17,18. Como um continuum, dirigido diferenciação protocolos confiando em pistas moleculares para orientar a hPSCs ao destino epitelial da córnea foram recentemente introduzidos19,20,21,22, 23. Ainda muitos desses protocolos utilizados ou indefinido, alimentador com base hPSCs como material, ou fator de crescimento do complexo, xenogénica cocktails para diferenciação de partida.
O propósito do presente protocolo é fornecer um robusto, otimizado, xeno- e método de cultura livre de alimentador hPSC e subsequente diferenciação para LESCs da córnea. Cultura de monocamadas de pluripotentes hPSCs na matriz de laminina-521 (LN-521) no meio de hPSC definida, livre de albumina (especificamente essencial Flex 8) permite a rápida produção de matéria-prima homogênea para diferenciações. Depois de um simples, estratégia de diferenciação em duas fases guias hPSCs em direção a superfície ectodérmico destino em suspensão, seguido de diferenciação aderente para LESCs. Uma população de células onde > 65% express ΔNp63α é obtida dentro de 24 dias. O protocolo de xeno alimentador-livre e foi testado com várias linhas de hPSC (hESCs e hiPSCs), sem qualquer exigência de otimização específicas de linha de celular. Os protocolos para fenotipagem de manutenção, passagem, cryostoring e hPSC-LESC livre de fim de semana, aqui descritos permitem a produção de grandes lotes de alta qualidade LESCs para clínicas ou fins de investigação.

<table><tbody><tr><td><forte>Material/Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS contendo Ca2+ e Mg2+</td><td>Gibco</td><td>#14040-091</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS sem Ca2+ e Mg2+</td><td>Lonza</td><td>#17-512F/12</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 100 mm</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3296</td><td>Formato de vaso de cultura para hPSC-LESC aderente diferenciação</td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3336</td><td>Formato de vaso de cultura para amostras de FI</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3337</td><td>Formato de vaso de cultura para amostras de FI</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>#31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços, acessório ultrabaixo</td><td>Corning Costar</td><td>#3471</td><td>Formato de vaso de cultura para indução em suspensão cultura</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-rato Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21202</td><td>Anticorpo secundário para IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-coelho Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21206</td><td>Anticorpo secundário para IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-cabra Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11057</td><td>Anticorpo secundário para IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-rato Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-10037</td><td>Anticorpo secundário para</td></tr><tr><td>fator de crescimento de fibroblastos IF Basic (bFGF, humano)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#AF-100-18B</td><td>Animal-Free Humano Recombinante FGF-básico (154 a.a.)</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td><td>BD Biosciences</td><td>#554722</td><td>Solução de fixação e permeabilização para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>#554723</td><td>Tampão de lavagem para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Blebbitatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#B0560</td><td></td></tr><tr><td>Proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#120-05A</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A8022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de citoqueratina 12</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#SC-17099</td><td>Anticorpo primário para IF</td></tr><tr><td>Citoqueratina 14 anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>#MAB3164</td><td>Anticorpo primário para</td></tr><tr><td>anticorpo IF Citoqueratina 15</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#MS-1068-P</td><td>Anticorpo primário para IF</td></tr><tr><td>CnT-30</td><td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td><td>#Cnt-30</td><td>Meio de cultura para diferenciação aderente hPSC-LESC</td></tr><tr><td>Colágeno tipo IV (humano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5533</td><td>Colágeno placentário humano tipo IV</td></tr><tr><td>CoolCell LX Recipiente de congelamento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Tubos CryoPure</td><td>Sarsted</td><td>#72.380</td><td>Criotubo de 1,6 mL para criopreservação de hPSC-LESC</td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina definido</td><td>Gibco</td><td>#R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>Kit médio Essential 8 Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2858501</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>#35050061</td><td></td></tr><tr><td>Laminina 521</td><td>Biolamina</td><td>#Ln521</td><td>Laminina recombinante humana 521</td></tr><tr><td>&Delta; Np63&alfa; anticorpo</td><td>BioCare Medical</td><td>#4892</td><td>Anticorpo primário para anticorpo IF</td></tr><tr><td>OCT3/4</td><td>R& D Systems</td><td>#AF1759</td><td>Anticorpo primário para IF</td></tr><tr><td>p63&alpha; anticorpo</td> Tecnologia <td>de sinalização celular</td><td>#ACI3066A</td><td>Anticorpo primário para IF</td></tr><tr><td>p63-&alfa; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugado)</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>#56687</td><td>p63-&alfa; Anticorpo conjugado com PE para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Anticorpo PAX6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HPA030775</td><td>Anticorpo primário para</td></tr><tr><td>IF Penicilina/Estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>#17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td>Fixador de células para IF</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant com DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#P36931</td><td>DAPI mountant para disco montagem para</td></tr><tr><td>IF PSC Cryopreservation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2644601</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme</td><td>Gibco</td><td>#12563-011</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco' s Águia modificada' s medium</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR XenoFree CTS</td><td>Gibco</td><td>#10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos não essenciais</td><td>Gibco</td><td>#11140050</td><td></td></tr><tr><td>SB-505124</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4696</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td><td>Agente de permeabilização para IF</td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>#H-1200</td><td>DAPI mountant para montagem líquida para IF</td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citocentrífuga, e.g. CellSpin II</td><td>Tharmac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo, por exemplo BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência, e.g.Olympus IX 51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneais estroma epiteliais células-tronco (LESCs) são responsáveis por renovar continuamente o epitélio corneano e mantendo assim a homeostasia corneana e clareza visual. Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-LESCs derivadas fornecem uma promissora fonte de células para terapia de reposição de células da córnea. Condições de cultura e diferenciação de indefinido, xenogénicas causam variação nos resultados de pesquisa e impedem a tradução clínica da terapêutica hPSC-derivado. Este protocolo fornece um método eficiente e reprodutível para diferenciação de hPSC-LESC condições xeno - e alimentador sem célula. Em primeiro lugar, cultura de monocamadas de hPSC indiferenciada na recombinação laminina-521 (LN-521) e médio hPSC definido serve como uma base para a produção de robusta de alta qualidade matéria-prima para diferenciações. Em segundo lugar, um método de diferenciação rápida e simples hPSC-LESC produz populações LESC em apenas 24 dias. Este método inclui uma quatro dias superfície ectodérmica indução em suspensão com pequenas moléculas, seguido por fase de cultura aderente na matriz de combinação LN-521/colagénio IV médio definido diferenciação epitelial da córnea. Cryostoring e diferenciação estendida mais purifica a população celular e permite bancário das células em grandes quantidades de produtos de terapia celular. Os resultantes hPSC-LESCs de alta qualidade fornecem uma potencial estratégia de tratamento romance para reconstrução da superfície da córnea tratar a deficiência de células-tronco limbal (LSCD).

De hPSCs para hPSC-LESCs
Todo o processo de induzir a diferenciação de FF hPSCs para cryostoring hPSC-LESCs leva cerca de 3,5 semanas. Visão esquemática do método de diferenciação, destacando suas etapas-chave é apresentada na figura 1A. A figura 1B mostra morfologias típicas de populações de células em diferentes fases do protocolo. Os dados apresentados são obtidos com R...

Este protocolo apresenta um método simples de duas etapas de diferenciação de células-tronco epiteliais estroma corneana de células-tronco pluripotentes humanas sob condições de cultura celular-free xeno - e alimentador. Os métodos de cultura celular aqui apresentados permitem a produção de custo-eficiente, em larga escala de células de qualidade clínica aplicáveis ao uso de terapia de células da córnea.

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Este protocolo introduziu um método livre de células alimentadores definidos para diferenciar células-tronco epiteliais membros da córnea de células-tronco pluripotentes humanas. As células-tronco epiteliais limbais são responsáveis pela renovação da epitelial córnea no olho saudável. Danos a essas células levam a uma condição conhecida como deficiência de células-tronco limbais, e à perda de clareza corneal.Os métodos de cultura celular aqui mostrados permitem a produção eficiente de células-tronco epiteliais membros para futuras terapias de substituição de células córneas. Para começar, passar e manter o alimentador livre de cultura de células-tronco pluripotentes humanas, conforme descrito no protocolo de texto. Certifique-se de usar apenas células-tronco pluripotentes humanas de alta qualidade como material inicial para diferenciações.Quando estiver pronto para induzir a formação do corpo embrionário, aqueça todos os materiais e reagentes necessários à temperatura ambiente em uma coifa de fluxo laminar. Desvincule as células-tronco pluripotentes humanas livres para a suspensão adicionando 500 microliters de xeno free trypsin EDTA a cada poço. Uma incubação a 37 graus Celsius, c

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

As células do epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células-tronco podem ser usadas para várias aplicações, incluindo terapias baseadas em células para degeneração da retina, modelagem de doenças e estudos de medicamentos. Aqui apresentamos um protocolo simples para derivar RPE de forma reprodutível de células-tronco.

Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

Um exemplo de terapia genética adenoviral nas córneas cultivadas de órgãos diabéticos humanos é apresentado para a normalização da cicatrização tardia de feridas e expressão de marcadores de células-tronco epiteliais marcadamente reduzida nessas córneas. Também descreve a otimização desse processo em culturas epiteliais límbicas enriquecidas com células-tronco.

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

Este protocolo descreve como produzir células epiteliais de pigmento retinal (RPE) de células-tronco pluripotentes. O método usa uma combinação de fatores de crescimento e de pequenas moléculas para direcionar a diferenciação de células-tronco em RPE imaturo em catorze dias e RPE maduro e funcional, depois de três meses.

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

Este protocolo detalha um monolayer, método soro-livre para gerar eficientemente Hepatocyte-como pilhas das pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em 18 dias. Isto implica seis etapas como hPSCs se diferenciam seqüencialmente em tipos de células intermediárias, como a raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior e progenitores de broto hepático antes de formar células como hepatócitos.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Usando um método de auto-organização, desenvolvemos um protocolo com a adição de COCO que poderia aumentar significativamente a geração de fotorreceptores.

Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.

Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e identificar as células do nicho limbal humano.

Isolamento e Identificação de Células de Nicho Limbal

Aqui, apresentamos um protocolo para obter suspensões unicelulares de alta qualidade de córneas inteiras de camundongo por meio da digestão sequencial com colagênase A e tripsina. Esse método gera células únicas viáveis com alta integridade de RNA, tornando-as compatíveis com aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA de célula única e citometradorde fluxo y.

Um Protocolo para Colheita de Suspensão de Célula Única de Córneas de Camundongos

Aprenda a diferenciar células-tronco epiteliais limbais de células pluripotentes humanas sem uso de células alimentadoras. Este método eficiente e escalável produz células de qualidade clínica para terapias de substituição de córnea.

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

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