Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bioquímica e biologia estrutural de proteínas secretadas, como determinação da estrutura de proteínas, por cristalografia e crio-EM. A principal vantagem desta técnica é que ela produz grande quantidade de proteínas secretadas recombinantes com custo relativamente baixo para determinação da estrutura da proteína. Primeiro, sintetize um fragmento de DNA contendo um local de corte de cinco BglII principais, a sequência de sinal de secreção de interesse em um local de multiclonagem, conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, digerir quatro microgramas do DNA com BglII e X1 e quatro microgramas de um vetor de expressão DNA com BamH1 e X1. Misture 10 unidades de cada enzima de restrição com o DNA em um tampão de reação de concentração 1X. Incube a 37 graus Celsius por quatro horas. Adicione 10 microlitros de uma mistura de reação de ligação contendo 1X tampão de reação T4 DNA Ligase e cinco unidades de T4 DNA Ligase a um tubo Eppendorf novo de 1,5 mililitro.