Name: Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a modificar vetores de expressão de baculovirus para produzir proteínas vegetais secretadas em células de inseto. Este método de baixo custo facilita a cristalização de proteínas para estudos de biologia estrutural.

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Este trabalho foi financiado pelos fundos de inicialização nova faculdade da North Carolina State University para Guozhou Xu.

Nota: É utilizado um sistema de célula/baculovirus inseto com vetores de expressão modificada para expressão de proteínas secretoras de planta e cristalização.
1. modificação de um vetor de expressão de Baculovirus com o peptídeo sinal GP67 para expressão de secreção de proteínas vegetais
<ol><li>Sintetiza um fragmento de DNA contendo uma 5' BglII corte local13, a sequência de sinal de secreção de GP67 e um site multi-clonagem com NotI, BamHI, EcoRI, StuI sobre, SalI, SpeI, XbaI, PstI e XhoI (figura 1A). Nota: Desde que ambos BglII e BamHI digerido DNA resultou no mesmas adesivas, extremidades, o vetor tornado linear pode ligar para o fragmento de DNA digerido enquanto o BglII e BamHI sites na sequência da ligadura recozido serão ser uma mutação para uma sequência que não é cleavable por BglII ou BamHI14.</li>
	<li>Digest 4 µ g de DNA com BglII e XhoI e 4 µ g de um vetor de expressão DNA com BamHI e XhoI14. 10 unidades de cada enzima de restrição se misturam com o DNA em uma concentração de tampão de reação (acetato de potássio de 50 mM, 20 mM Tris-Acetato, acetato de magnésio de 10 mM e 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 a 25 ° C) de 1x e incubar a mistura a 37 ° C por 4 h.<ol>
<li>Purifica o fragmento de DNA extirpado e o vetor tornado linear do DNA por um DNA gel de extração kit15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix 100 ng de DNA vetor tornado linear com 400 ng de DNA digerido fragmentar-se em uma mistura de reação de ligadura de 10 µ l contendo 1 x amortecedor da reação T4 DNA ligase (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, ATP de 1 mM e 10 mM DTT, pH 7,5 a 25 ° C) e 5 unidades de ADN T4 ligase. Incube a mistura de reação a 16 ° C, durante 16 h.</li>
	<li>Transformar a 5 µ l da mistura de ligadura em 100 µ l de células competentes DH5α, seguindo um protocolo padrão de transformação e selecione as colônias resultantes em um de placa de ágar de ampicilina-LB16. Pegar de 5 a 10 colônias e crescer cada colônia em 2 mL de meio LB contendo 100 ampicilina µ g/mL a 220 rpm e 37 ° C numa incubadora tremendo para 16 h.</li>
	<li>Extrair cada plasmídeo com um DNA miniprep kit17 e confirmar os clones de sequenciação de ADN com uma cartilha AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>PCR-amplificação do gene TDR a. thaliana fragmento codificação resíduos 30-642 de um gene sintético de TDR construir (encaminhar cartilha: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, primer reverso: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Amplifica o DNA para 30 ciclos em um buffer de reação de polimerase de DNA contendo uma mistura de dNTP 0,5 mM, as primeiras demão de 0,2 µM, 0,1 µ g do modelo de DNA, 0,4 mM MgCl2e 1 unidade de reação da polimerase da ADN.<ol>
<li>Para as etapas do ciclo PCR, defina a desnaturação inicial a 95 ° C por 30 s e depois de 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 30 s, recozendo a 55 ° C por 30 s e extensão a 72 ° C por 1 min, com uma extensão final a 72 ° C por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digeri tanto o fragmento PCR e o vetor modificado com NotI e BamHI enzimas endonucleases de restrição. Ligam o fragmento de gene com o vetor tornado linear. Mix 100 ng de DNA vetor tornado linear com 400 ng de DNA digerido fragmentar-se em uma mistura de reação de ligadura de 10 µ l contendo tampão de reação T4 DNA ligase e 5 unidades de T4 DNA ligase. Incube a mistura de reação a 16 ° C, durante 16 h.</li>
	<li>Transformar a 5 µ l da mistura de ligadura em 100 µ l de células competentes DH5α, seguindo um protocolo padrão de transformação e selecione as colônias resultantes em um de placa de ágar de ampicilina-LB16. Confirme os corretos clones de sequenciação de ADN.</li>
</ol>2. modificação de um vetor de expressão de Baculovirus com o peptídeo sinal Hemolin inseto planta secreção na expressão de proteínas
<ol><li>Sintetiza um fragmento de DNA contendo uma 5' BglII corte local13, a sequência de sinal de secreção de insetos hemolin e um site multi-clonagem com NotI, BamHI, EcoRI, StuI sobre, SalI, SpeI, XbaI, PstI e XhoI (figura 1B).</li>
	<li>Digest 4 µ g de DNA com BglII e XhoI e 4 µ g de um vetor de expressão DNA com BamHI e XhoI14. 10 unidades de cada enzima de restrição se misturam com o DNA em uma concentração de tampão de reação (acetato de potássio de 50 mM, 20 mM Tris-Acetato, acetato de magnésio de 10 mM e 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 a 25 ° C) de 1x e incubar a mistura a 37 ° C por 4 h.<ol>
<li>Purifica o fragmento de DNA extirpado e o vetor tornado linear do DNA por um DNA gel de extração kit15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix 100 ng de DNA vetor tornado linear com 400 ng de DNA digerido fragmentar-se em uma mistura de reação de ligadura de 10 µ l contendo 1 x amortecedor da reação T4 DNA ligase (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, ATP de 1 mM e 10 mM DTT, pH 7,5 a 25 ° C) e 5 unidades de ADN T4 ligase. Incube a mistura de reação a 16 ° C, durante 16 h.</li>
	<li>Transformar a 5 µ l da mistura de ligadura em 100 µ l de células competentes DH5α e selecione as colônias em uma placa de ágar de ampicilina-LB. Pegar de 5 a 10 colônias e crescer cada colônia em um meio LB de 2 mL contendo 100 µ g/mL de ampicilina a 220 rpm e 37 ° C numa incubadora tremendo para 16 h.</li>
	<li>Extrair o DNA do plasmídeo com um DNA miniprep kit17 e confirmar os clones de sequenciação de ADN com uma cartilha AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>PCR-amplificar a. thaliana pólen Receptor quinase 3 (PRK3) gene fragmento codificação resíduos 20-237 de uma construção de gene PRK3 sintética (encaminhar cartilha: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, primer reverso: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Amplifica o DNA para 30 ciclos em um buffer de reação de polimerase de DNA contendo uma mistura de dNTP 0,5 mM, as primeiras demão de 0,2 µM, 0,1 µ g do modelo de DNA, 0,4 mM MgCl2e 1 unidade de reação da polimerase da ADN.<ol>
<li>Para as etapas do ciclo PCR, defina a desnaturação inicial a 95 ° C por 30 s e depois de 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 30 s, recozendo a 55 ° C por 30 s e extensão a 72 ° C por 30 s dentro de cada ciclo e a extensão final a 72 ° C por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digeri tanto o fragmento PCR e o vetor modificado com NotI e BamHI enzimas endonucleases de restrição. Ligam o fragmento de gene com o vetor tornado linear. Mix 100 ng de DNA vetor tornado linear com 400 ng de DNA digerido fragmentar-se em uma mistura de reação de ligadura de 10 µ l contendo tampão de reação T4 DNA ligase e 5 unidades de T4 DNA ligase. Incube a mistura de reação a 16 ° C, durante 16 h.</li>
	<li>Transformar a 5 µ l da mistura de ligadura em 100 µ l de células competentes DH5α, seguindo um protocolo padrão de transformação e selecione as colônias resultantes em um de placa de ágar de ampicilina-LB16. Confirme os corretos clones de sequenciação de ADN.</li>
</ol>3. produção e amplificação de Baculovirus constrói abrigando o Cassette de expressão de proteínas recombinantes
<ol><li>Uso 100 ng do plasmídeo de construção para transformar 40 µ l de células competentes DH10Bac, seguindo o protocolo do baculovirus expressão sistema1. Incube as placas de transformação a 37 ° C por 48 h.</li>
	<li>Pegue duas colónias brancas de cada prato de transformação, inocular cada colônia em 2 mL de meio LB contendo 50 µ g/mL canamicina, gentamicina 7 de µ g/mL e 10 tetraciclina µ g/mL. Siga o protocolo do baculovirus expressão sistema1 para extrair e verificar a bacmid DNA. Alíquota cada DNA em dois tubos com 20 µ l cada e armazenar os tubos a-20 ° C. Nota: As etapas a seguir exigem uma operação asséptica.</li>
	<li>Cresce uma monocamada de células Sf9 em meios de cultura com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 µ g/mL (ou 100 teórica) antibióticos penicilina-estreptomicina a 27 ° C a confluência de 80% em uma placa de 6. Estime a porcentagem de confluência com base na porcentagem de área coberta na placa de cultura de tecidos.</li>
	<li>Prepare as seguintes soluções em dois tubos de centrífuga de 1,5 mL estéril.<ol>
<li>Tubo 1: Para cada transfeccao, dilua 20 µ l de bacmid DNA em 100 µ l de unsupplemented meio de cultura celular Sf9 sem antibióticos. Misture delicadamente a diluição por agredir o lado do tubo.</li>
		<li>Tubo 2: Para cada transfeccao, dilua 8 µ l de reagente de Transfeccao de lipídios em 100 µ l de unsupplemented meio de cultura celular Sf9 sem antibióticos. Homogeneiza a diluição pipetando para cima e para baixo para x 6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combinar as duas soluções, misture-os delicadamente pipetando lentamente acima e para baixo para x 3 e incube-os por 20-40 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavagem de cada poço da monocamada Sf9 células 2x com 3 mL de meio de cultura de células Sf9 unsupplemented sem antibióticos. Para cada transfeccao, adicione 0,8 mL de meio de cultura de células Sf9 unsupplemented sem antibióticos a cada tubo contendo a mistura de lipídios-DNA. Misture o conteúdo dos tubos suavemente pipetando lentamente acima e para baixo para x 3. Aspirar a mídia de lavagem das placas e as amostras com a mistura de Transfeccao de sobreposição.</li>
	<li>Após a adição da mistura de transfeccao, incubar a placa transfectada para 5h a 27 ° C. Substitua os meios de comunicação de transfeccao completa Sf9 célula meio de cultura contendo 10% FBS e 100 µ g/mL (ou 100 teórica) antibióticos penicilina-estreptomicina. Incube a placa transfectada a 27 ° C, durante 4 d.</li>
	<li>Colheita e amplificar o baculovirus recombinante.<ol>
<li>Recolha o sobrenadante da placa infectado em um tubo cônico de 15 mL estéril após 4D de incubação. Gire o sobrenadante a 1010 x g por 5 min remover os detritos de células. Descartar a pelota e decante o sobrenadante para um tubo limpo e armazená-lo em 4 ° C por até 1 ano. Nota: Este é o vírus de P0. Pode ser aliquotadas e armazenado a-80 ° C por um longo período de tempo.</li>
		<li>Para amplificar cada vírus recombinantes, cresce uma monocamada de células Sf9 em uma placa de 150 mm a confluência de 80%. Aspire a mídia do prato, adicione 2 mL do vírus P0 para o aderente de células para a placa e incubar a placa por 1h em uma incubadora de 27 ° C. Agitar a placa cada 15 min para misturar o meio com as células.<ol>
<li>Adicionar 25 mL de mídia da Grace completo contendo 10% FBS e 100 µ g/mL (ou 100 teórica) antibióticos penicilina-estreptomicina. Incube a placa para 3-d em uma incubadora de 27 ° C para obter o vírus de passagem P1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Recolha o sobrenadante da placa em um tubo cônico estéril de 50 mL e girar a 1010 x g por 5 min remover os detritos de células infectada. Decante o sobrenadante para um tubo limpo e armazená-lo em 4 ° C por até 1 ano. Nota: O vírus P1 pode ser aliquotadas e armazenado a-80 ° C por um longo período de tempo.</li>
		<li>Para amplificar o vírus de P1 para P2 passagem, crescer uma monocamada de células Sf9 em uma placa de 150 mm a confluência de 90%, aspirar a mídia da placa, adicione 2 mL do vírus P1 para a placa e incubá-lo por 1h em uma incubadora de 27 ° C.</li>
		<li>Repita as etapas 3.8.2 e 3.8.3 para obter as passagens P2 e P3 dos vírus. Não guarde o P3 vírus por mais de 2 meses.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. proteína expressão, purificação com NiNTA e cristalização
<ol><li>Cultura 1 L de células de inseto Hi5 em meios de cultura com 100 µ g/mL (ou 100 teórica) antibióticos penicilina-estreptomicina para uma densidade de 2 x 106 a 100 rpm em um shaker de incubadora de 27 ° C. Gire para baixo as células a 570 x g por 5 min, decante o sobrenadante, Ressuspender as células em 20 mL do vírus P3 recentemente produzido e mantê-lo em temperatura ambiente por 1 h. Agite suavemente o frasco de rotação para Ressuspender as células 1 x a cada 15 min.</li>
	<li>Transferir as células para 1 L de antibióticos penicilina-estreptomicina de meios de cultura com 100 µ g/mL (ou 100 teórica), cultura de células em 100 rpm em um shaker de incubadora de 27 ° C por 72 h. Spin para baixo as células a 1.010 x g por 5 min e recolher o sobrenadante.</li>
	<li>Indicador de pH de uso tiras para ajustar o pH do líquido sobrenadante para 8.0 adicionando ou 0.1 M HCl ou NaOH 0.1 de M e adicionar tampão de ligação em uma concentração final, contendo tampão Tris de 20mm a pH 8.0, 100 mM de NaCl e imidazol de 5 mM. Adicione uma certa quantidade de resina NiNTA (10-40 mL) com base no rendimento estimado da proteína recombinante com sua tag expressa.<ol>
<li>Misturar a solução em uma agitação magnética com baixa velocidade a 4 ° C, durante 1 h. lavagem a resina e eluir a proteína ligada seguindo o padrão de protocolo de purificação NiNTA18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Submeta a proteína purificada a troca iônica e cromatografia de filtração, bem como outros métodos de purificação de proteínas, para produzir uma amostra homogênea do gel. Nota: Para o ectodomínio TDR, 20 mM Tris, pH 8, 100 mM de NaCl foram usadas como amortecedor de gel filtração. Para o ectodomínio PRK3, bis-Tris de 20 mM, pH 6, 100 mM de NaCl foram usados como o amortecedor de filtração de gel preferencial.</li>
</ol>

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<li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallographic+studies+of+the+extracellular+domain+of+the+first+plant+ATP+receptor%2C+DORN1%2C+and+the+orthologous+protein+from+Camelina+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+BIology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).</li>
<li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells%3A+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).</li>
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<li>Dohi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+virus-mediated+expression+of+a+foreign+protein+in+suspension-cultured+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells.</a> Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Dada a diversidade no tamanho e na estabilidade dos milhares de proteínas presentes nos sistemas biológicos, é frequentemente empírica para uma pesquisa laboratorial para decidir qual sistema de expressão heteróloga tem de ser escolhida para a expressão de uma proteína específica. O sistema de expressão de Escherichia coli é frequentemente a primeira escolha para a expressão da proteína devido ao curto ciclo de vida das bactérias, baixo custos dos meios de cultura e relativa facilidade para escalar até<sup class...

É imperativo para um laboratório de pesquisa ser capaz de produzir grandes quantidades de proteínas recombinantes homogêneas para Caracterização bioquímica e biofísica, especialmente para estudos cristalográficos de raio-x. Existem muitos sistemas de expressão heteróloga bem estabelecidas, tais como Escherichia coli, levedura, células de inseto, células de mamíferos, células vegetais, etc. , entre eles, o sistema de expressão de células de inseto mediada por baculovirus é um dos mais comumente usado técnicas para produzir grandes quantidades de estruturalmente dobrado de grande porte eukaryotic proteínas recombinantes para cristalização de proteínas1.
Os vetores de expressão do sistema de expressão de baculovirus são projetados para conter uma forte polyhedrin ou promotor P10 para produzir um alto rendimento de proteínas recombinantes intracelular2,3. Para tornar um baculovirus recombinante, o gene de interesse foi clonado em um inseto vetor contendo o locus polyhedrin (polh) do genoma de multi-nucleopolyhedroviral Autographa californica . A construção resultante é então sequenciada e seu quadro correto de leitura aberta (ORF) é verificado. A construção correta é então introduzida célula hospedeira de insetos através do processo do transfection. O gene de interesse é inserido no genoma viral por recombinação homóloga. Este evento resulta na produção do genoma viral recombinante, que é então replicada para produzir recombinante brotou de partículas do vírus1.
As células de insetos que são mais comumente usadas no sistema de expressão são Sf9 e alta cinco células (Hi5). Sf9 células são uma clonal isolada de Sf21, derivado das células dos ovários pupal de Spodoptera frugiperda, e Hi5 células são uma clonal isolada derivada o parental Trichoplusia ni ovário célula linha TN-3684,5. Co transfections, amplificação de vírus e ensaios de placa são realizados em células de Sf9, enquanto células Hi5 são normalmente Selecionadodas para produzir maiores quantidades de proteínas recombinantes6. É interessante notar que as células do Hi5 não são adequadas para a geração e amplificação de progênies de vírus por causa de sua tendência a produzir vírus mutantes. Tradicionalmente, uma faixa de temperatura de 25-30 ° C é considerada bom para o cultivo de células de inseto. No entanto, foi relatado que o 27-28 ° C é a temperatura ideal para o inseto celular crescimento e infecção7,8.
A introdução de uma sequência de forte sinal precede o gene é necessária para a alta expressão das proteínas secretadas. A sequência de sinal guiariam eficientemente a proteína recombinante traduzida no retículo endoplasmático por secreção de proteína e modificações borne-translational necessárias para dobramento adequado e de estabilização3. Sequências de peptídeo sinal, tais como os baculovirus envelop proteína GP64/67, Melitina abelha e outros, foram escolhidas para facilitar a expressão de proteínas recombinantes secretoras no expressão mediada por baculovirus sistemas3. A introdução do peptídeo sinal de GP67 foi mostrada para melhorar o rendimento de expressão de uma proteína recombinante secretado, em comparação com usando o peptídeo sinal intrínseco do gene alvo9. Hemolin é uma proteína de hemolinfa da mariposa gigante de seda Hyalophora cecropia, induzida após infecção de bactérias10. Devido o nível relativamente elevado de expressão induzida, a sequência do peptídeo sinal do gene pode ser usada para mediar a expressão de secreção de proteínas recombinantes em sistema de célula de baculovirus-inseto.
O . thaliana Tracheary elemento de diferenciação Inhibitory Factor Receptor (TDR) e pólen Receptor quinase 3 (PRK3), ambos pertencem à família de repetição como Receptor quinase (LRR-RLK) planta rica em leucina de proteínas11,12 . Para estudar a estrutura e a função desta família de receptores proteínas vegetais, bem como para facilitar a caracterização estrutural e bioquímica de outras proteínas de planta secretada, foi modificado o sistema de expressão de células de baculovirus-inseto para Melhore o rendimento de produção e qualidade de proteína. Os domínios extracelulares de TDR e PRK3 com êxito foram expressas usando dois vetores de expressão modificados no sistema de expressão de célula de baculovirus-inseto. Cristalizaram-se ambos os domínios extracelulares de proteínas TDR e PRK3. Este artigo relata a expressão e purificação de grandes quantidades de proteínas recombinantes planta secretada com baculovirus modificados dois vetores da expressão, incorporando um GP67 ou uma sequência de sinal de hemolin entre o promotor e clonagem múltiplos sites.

<table><tbody><tr><td>Agitador de incubadora</td><td>VWR</td><td>Modelo Excella E25</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>VWR</td><td>Modelo 2005</td><td>27 Centrífuga oC</td></tr><tr><td></td><td>Modelo J-6</td><td>com rotor de balde oscilante</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polimerase</td><td></td><td>Agilent 600677-51</td><td>Para amplificação por PCR de</td></tr><tr><td>termociclador</td> <td>de DNABIO-RAD</td><td>Modelo C1000 Touch</td><td>Para amplificação por PCR do agitador de incubadora de DNA</td></tr><tr><td></td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Modelo I 24</td><td>Para cultivo de cultura de baceria</td></tr><tr><td>Síntese de DNA do cliente</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td> <td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td>Endonuclease de restrição</td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td>Endonuclease de restrição</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td> <td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>Endonuclease de Restrição</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Endonuclease</td></tr> de <tr><td>Restrição T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>Kit</td></tr><tr>de<td>extração de gel QIAquick Purificação</td> de DNA <td>Qiagen</td><td>28704</td><td>do gel Agorase</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Purificação de DNA de plasmídeo de cultura de bactérias</td></tr><tr><td></td><td>Agarose Thermo Fisher Scientific</td><td>15510-019</td><td>Para eletroferrose de gel de DNA</td></tr><tr><td>MAX Eficiência DH5&alpha; célula competente</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>Para transformação da mistura de ligação de DNA</td></tr><tr><td>Lennox L LB Broth</td><td>Research Product International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>Para fazer cultura de bactérias</td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11593-019</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15160-054</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-75-5</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710-064</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>MAX Eficiência DH10Bac células competentes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10361-012</td><td>Para fazer bacmid DNA</td></tr><tr><td>S.O.C. Médio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544-034</td><td>Para transformação de DNA</td></tr><tr><td>CellFECTIN II Reagente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362-101</td><td>Reagente de transfecção de células de insetos</td></tr><tr><td>Sistema de expressão Bac-to-Bac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10359-016</td><td>Kit de expressão de células de insetos Baculovirus</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15519-028</td><td>Para isolamento de DNA Bacmid recominant</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15529-019</td><td>Para isolamento de DNA Bacmid recominant</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10360014</td> Células Sf9 <td>do vetor de expressão Baculorirus</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 células monocamada</td></tr><tr><td>Hi5 células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>High Five células de insetos</td></tr><tr><td>Grace' s meio de inseto, não suplementado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Sf9 meio mínimo de transfecção de células</td></tr><tr><td>Grace' s meio de inseto, suplementado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11605102</td><td>Sf9 meio completo de cultura de células monocamada</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10902104</td><td>Sf9 meio de cultura de células em suspensão sem FBS</td></tr><tr><td>Express Cinco SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10486025</td><td>Hi5 meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml (10.000 UI/ml)</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>FBS Certified Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000-044</td> Placas <td>de 500 ml</td></tr><tr><td>de 6 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Placas de fundo plano</td></tr><tr>de<td>150 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353025</td><td>100/caixa</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>500 tubos/saco</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga com tampa de rosca cônica de 15 ml USA</td><td>Scientific</td><td>1475-0511</td><td>25 tubos/saco</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga com tampa de rosca cônica de 50 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td>25 tubos/saco</td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>Tiras</td></tr><tr><td>indicadoras de pH</td> de resina NiNTA <td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>pH 0 - 14</td></tr></tbody></table>

modificar vetores de expressão de baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Tem sido um desafio para cientistas de expressar proteínas recombinantes de eucariotas secretoras para estudos bioquímicos e estruturais. O sistema de expressão de células de inseto mediada por baculovirus é um dos sistemas utilizados para expressar proteínas recombinantes de secretoras eucarióticas, com algumas modificações borne-translational. As proteínas secretoras precisam ser roteadas através de vias secretoras para proteína glycosylation, formação de ligações de bissulfeto e outras modificações borne-translational. Para melhorar a expressão célula inseto existentes de proteínas vegetais secretora, um vetor de expressão de baculovirus é modificado pela adição de qualquer um GP67 ou uma sequência de peptídeo sinal hemolin entre o promotor e a clonagem de vários sites. Este sistema de vetor modificado recentemente projetado com sucesso produzido um alto rendimento de proteínas do receptor solúvel recombinante secretada planta de Arabidopsis thaliana. Duas das proteínas expressas da planta, os domínios extracelulares de receptores de membrana plasmática de Arabidopsis TDR e PRK3, foram cristalizada para estudos cristalográficos de raio-x. O sistema do vetor modificado é uma ferramenta melhorada que potencialmente pode ser usada para a expressão de proteínas recombinantes de secretoras no reino animal também.

Como mostrado na Figura 1, dois vetores de expressão de baculovirus pFastBac1 modificados foram usados para expressar as proteínas secretadas com o GP67 ou a sequência de sinal hemolin para substituir a sequência de sinal intrínseco do gene do alvo. O GP67 viral e os genes de insetos hemolin têm demonstrados que têm níveis de expressão de alta secreção nas células. Proteínas de fusão com qualquer destas duas sequências de sinal deverão ter melhorado os níveis...

Aqui, apresentamos os protocolos para utilizando o inseto sistema expressão da proteína celular e baculovirus para produzir grandes quantidades de proteínas vegetais secretada por cristalização de proteínas. Um vetor de expressão de baculovirus foi modificado com GP67 ou inseto hemolin peptídeo sinal planta secreção na expressão de proteínas nas células de inseto.

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bioquímica e biologia estrutural de proteínas secretadas, como determinação da estrutura de proteínas, por cristalografia e crio-EM. A principal vantagem desta técnica é que ela produz grande quantidade de proteínas secretadas recombinantes com custo relativamente baixo para determinação da estrutura da proteína. Primeiro, sintetize um fragmento de DNA contendo um local de corte de cinco BglII principais, a sequência de sinal de secreção de interesse em um local de multiclonagem, conforme descrito no protocolo de texto.Em seguida, digerir quatro microgramas do DNA com BglII e X1 e quatro microgramas de um vetor de expressão DNA com BamH1 e X1. Misture 10 unidades de cada enzima de restrição com o DNA em um tampão de reação de concentração 1X. Incube a 37 graus Celsius por quatro horas. Adicione 10 microlitros de uma mistura de reação de ligação contendo 1X tampão de reação T4 DNA Ligase e cinco unidades de T4 DNA Ligase a um tubo Eppendorf novo de 1,5 mililitro.Em seguida, adicione 100 nanogramas do DNA vetorial linearizado e 400 nanogramas do fragmento de DNA digerido. Incube a 16 graus Celsius por 16 horas. Transforme cinco microlitros da mistura de ligação em 100 microlitros de células competentes DH5 alfa e selecione as colônias resultantes em uma placa de ágar Ampicilina LB, conforme descrito no protocolo de texto.Escolha entre cinco e 10 colônias, transferindo cada uma para dois mililitros de meio LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Cultive essas colônias em uma incubadora agitada a 220 rpm a 37 graus Celsius por 16 horas. Depois disso, use um kit DNA Miniprep para extrair cada DNA de plasmídeo.Confirme os clones por sequenciamento de DNA com um primer de sequenciamento direto, conforme descrito no protocolo de texto. Usando 100 nanogramas do plasmídeo de construção, transforme 40 microlitros de células competentes para DH10Bac, conforme descrito no protocolo de texto. Incube as placas de transformação a 37 graus Celsius por 48 horas.Pegue duas colônias brancas de cada placa de transformação e inocule cada colônia em dois mililitros de meio LB contendo canamicina, gentamicina e tetraciclina. Extraia e verifique o DNA bacmid conforme descrito no protocolo de texto. Alíquota de cada DNA em dois tubos com 20 microlitros sendo transferidos para cada tubo.Em seguida, armazene os tubos a menos 20 graus Celsius até que estejam prontos para prosseguir. Todas as etapas subsequentes devem ser executadas assepticamente. Em uma placa de seis poços, cultive uma monocamada de células Sf9 no meio de cultura com soro bovino fetal a 10% e 100 microgramas por mililitro de antibióticos penicilina-estreptomicina a 27 graus Celsius a 80% de confluência.Para cada transfecção, adicione 100 microlitros de meio de cultura de células Sf9 não suplementado sem antibióticos a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Dilua 20 microlitros de DNA bacmid em cada tubo e mexa suavemente para misturar. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cultura de células Sf9 não suplementado sem antibióticos a um tubo de 1,5 mililitro para cada transfecção.Dilua oito microlitros de reagente de transfecção lipídica em cada tubo e misture pipetando completamente para cima e para baixo seis vezes. Combine essas duas soluções e misture-as pipetando suavemente para cima e para baixo três vezes. Incube por 20 a 40 minutos em temperatura ambiente.Lave cada poço da placa de cultura duas vezes usando três mililitros de meio de cultura Sf9 não suplementado sem antibióticos para cada lavagem. Em seguida, adicione 0,8 mililitros de meio de cultura de células Sf9 não suplementado sem antibióticos a cada tubo contendo a mistura de DNA lipídico. Pipete lentamente para cima e para baixo três vezes para misturar.Aspire o meio de lavagem das placas e cubra as amostras com a mistura de transfecção. Incube a placa transfectada por cinco horas a 27 graus Celsius. Depois disso, substitua o meio de transfecção pelo meio de cultura de células Sf9 completo que contém 10% de FBS e 100 microgramas por mililitro de antibióticos penicilina-estreptomicina.Incubar a 27 graus Celsius por quatro dias. Em seguida, recolher o sobrenadante num tubo cónico estéril de 15 mililitros. Gire a 1.010 vezes g por cinco minutos para remover os detritos celulares.Rejeitar o pellet e transcantar o sobrenadante para um tubo limpo. Armazene a quatro graus Celsius por até um ano ou até a hora de usar. Para amplificar cada vírus recombinante, primeiro cultive uma monocamada de células Sf9 em uma placa de 150 milímetros a 80% de confluência.Em seguida, aspire o meio e adicione dois mililitros do vírus P0 a cada poço. Incube por uma hora em uma incubadora de 27 graus Celsius, balançando a placa a cada 15 minutos para misturar o meio com as células. Em seguida, adicione 25 mililitros de Grace's Media completo contendo 10% de FBS e 100 microgramas por mililitro de antibióticos penicilina-estreptomicina.Incubar a placa por três dias em uma incubadora de 27 graus Celsius para obter o vírus de passagem P1. Depois disso, colete o sobrenadante em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Gire a 1.010 vezes g por cinco minutos para remover os detritos celulares.Transvase o sobrenadante para um tubo limpo e armazene a quatro graus Celsius por até um ano ou até que esteja pronto para uso. Para amplificar o vírus da passagem de P1 para P2, primeiro cultive uma monocamada de células Sf9 em uma placa de 150 milímetros a 90% de confluência. Uma vez alcançada a confluência desejada, aspirar o meio.Adicione dois mililitros do vírus P1 e incube por uma hora em uma incubadora de 27 graus Celsius. Repita as etapas de amplificação para obter as passagens P2 e P3 do vírus. Neste estudo, dois vetores de expressão de baculovírus pFastBac1 modificados são usados para expressar as proteínas secretadas com a sequência de sinal gp67 ou hemolina, substituindo a sequência de sinal intrínseca do gene alvo.O PBEC gp67 é utilizado com sucesso para expressar os domínios extracelulares do receptor a-thal-leano TDR. Enquanto a hemolina PBEC1 é utilizada com sucesso para expressar o domínio extracelular PRK3. Em seguida, as proteínas purificadas são concentradas a cinco miligramas por mililitro e submetidas à triagem de cristalização.As condições que produziram cristais preliminares para cada proteína são otimizadas até que cristais de proteína maiores que 20 micrômetros sejam observados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que eles examinam a qualidade das proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho, espalhamento de luz multiangular e outros ensaios quanto ao status de não agregação da proteína recombinante. Não se esqueça, de verificar a pureza da proteína também pela coloração de prata.Após esse procedimento, outros métodos como cristalografia de raios-X e crio-EM podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como as estruturas tridimensionais da proteína produzida. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de biologia estrutural explorarem as propriedades estruturais, funcionais e bioquímicas de proteínas secretadas de plantas e mamíferos. Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta para visualizar as bandas de DNA no gel de agarose pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar proteções UV, protetor facial, óculos de proteção, jaleco, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.Além disso, ao fazer tampões, tenha cuidado ao manusear ácidos e bases fortes.

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Research

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Biochemistry

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