Name: Aparelhos para colheita de tecido Microcolumns (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Aprenda a colher tecido dérmico completo com mínima cicatriz no sítio doador usando microcolunas especializadas. Este método minimamente invasivo permite coleta em alto volume para pesquisa em regeneração cutânea.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo exército, Marinha, NIH, força aérea, VA e assuntos de saúde para apoiar o esforço de contacto II, sob o n. º prêmio W81XWH-13-2-0054. Os E.U. Exército médico aquisição actividade de investigação, 820 Chandler Street, Fort Detrick, MD 21702-5014 é o escritório de aquisição de premiação e administração. Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são aqueles do autor e não são necessariamente endossadas pelo departamento de defesa.

Todo o trabalho envolvendo animais vivos e amostras de tecido animal foram aprovadas pelo Comitê de uso (IACUC) e Massachusetts General Hospital institucional Cuidado Animal.
1. produção de colheita agulhas
<ol><li>Instalação da fase de produção<ol>
<li>Fixar um conector luer fêmea bloqueio de um post e montar o post para um palco de rotação, de modo que o conector luer-lock é o centro do palco (Figura 1A).</li>
		<li>Nesta primeira fase de rotação uma posição verticalmente e montá-lo perpendicularmente sobre um palco de rotação horizontal, segunda (Figura 1B).</li>
		<li>Monte o palco de rotação horizontal sobre um estágio da tradução de dois eixos (Figura 1B).</li>
		<li>Aperte a combinação em uma superfície estável, como uma experimentação ótica.</li>
		<li>Separadamente, monte uma ferramenta rotativa para a mesma tábua de pão, com a ferramenta posicionada em paralelo com a experimentação e a aproximadamente a mesma altura que o conector de bloqueio luer na fase de combinação de rotação e tradução (Figura 1C).</li>
		<li>Instalar dois discos de corte concêntrica para a ferramenta rotativa (um grão menor, menor corte diamantado sobre um disco de corte de pedra de grão maior, maior) (Figura 1D). Nota: Sobre uma 9 mm a diferença entre os diâmetros das duas rodas é geralmente suficiente.</li>
		<li>Posição de uma luz a sobrecarga da fonte com um braço ajustável sobre a ferramenta rotativa, com a luz que visam as rodas de corte.</li>
		<li>Para melhorar a visualização, posicione um microscópio dissecação sobre a instalação de produção para que o ocular está focada sobre os discos de corte (Figura 1C). Nota: Como alternativa, os usuários podem usar óculos de ampliação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remodelando a ponta da agulha<ol>
<li>Use óculos de proteção e uma máscara cirúrgica para impedir que partículas finas de metal entre os olhos ou vias respiratórias.</li>
		<li>Escolha de agulhas hipodérmicas do apropriado medir o tamanho, com base nos requisitos experimentais.</li>
		<li>Marque o comprimento pretendido em cada colheita de agulha. Nota: Para a colheita de pele suína, agulhas de 8 mm são normalmente suficientes; embora, o comprimento pode variar com base nas necessidades experimentais (EG., espessura do tecido-alvo da pele, tamanho do calibre de agulha). Geralmente, uma agulha de calibre 19 funciona bem para a pele de porco.</li>
		<li>Abaixe a agulha perpendicularmente à ferramenta rotativa com o poder, usando a borda do disco externo de corte para cortar o excesso de comprimento da agulha, no ponto marcado no passo 1.2.3.</li>
		<li>Conecte a agulha romba, encurtada ao conector luer fêmea de bloqueio na fase de produção.</li>
		<li>Ajuste a fase de rotação horizontal, para que a agulha está em um ângulo de 12° paralelo para os discos de corte da ferramenta rotativa (mudando o ângulo impactará a força necessária para a inserção da agulha).</li>
		<li>Ligue a luz aérea e ajustar sua posição enquanto observa a agulha sob a ampliação, até que a luz é refletida fora da linha mediana (longitudinal) da agulha.</li>
		<li>Poder da ferramenta rotativa e, em seguida, uso o estágio da tradução para fazer avançar a agulha para o interior (diamante) corte disco(Figura 2).</li>
		<li>Continue avançando a agulha lentamente contra o disco de corte até que o disco de corte atinge aproximadamente a linha média da agulha (como visualizada pela reflexão da luz aérea ao longo da linha mediana).</li>
		<li>Mova lentamente a superfície de corte da agulha do disco de diamante interior sobre a roda exterior de pedra para terminar a superfície de corte da agulha com um esmalte mais fina (Figura 2B).</li>
		<li>Retire a agulha longe o disco de corte.</li>
		<li>Usando a fase de rotação vertical, gire a agulha de 180°.</li>
		<li>Repita as etapas 1.2.9-1.2.10 para reformatar o outro lado da agulha. Nota: A agulha deve ter agora duas dicas de corte de comprimento aproximadamente igual (Figura 2 e 2D).</li>
		<li>Remova a agulha da fase de produção.</li>
		<li>Limpo dentro do furo com um fio de metal que é ligeiramente menor do que o diâmetro interior da agulha.</li>
		<li>Usando uma vara de madeira afiada (ex., encaixando a extremidade da vara de madeira pequena em um aplicador de ponta de algodão), remova quaisquer rebarbas que podem ainda ser anexadas às bordas da agulha recém formado. Nota: Colheita de agulhas pode ser eletropolido e esterilizados em autoclave, se necessário.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. colheita de tecido da pele
<ol><li>Use as agulhas de colheita para coletar microcolumns pele de tecido ex vivo ou animais vivos.</li>
	<li>Para pele ex vivo , tecido que é fino (especialmente a partir de amostras onde a gordura subcutânea está faltando ou foi aparada fora), segure o tecido-alvo sobre a abertura de um tubo de centrífuga de 50 mL, ou empilhar dois pedaços de tecido em cima do outro, para não danificar o n Dicas de eedle batendo neles contra superfícies duras. Nota: No vivo colhendo de animais vivos, é recomendável que a epinefrina e lidocaína local ser administrado por injeção intradérmica para analgesia e reduzir o sangramento.</li>
	<li>Monte o aparelho de colheita de acordo com a quantidade de microcolumns necessária, conforme descrito abaixo.</li>
	<li>Opção de baixa e média de volume:<ol>
<li>Para colher pequenas a médias quantidades de microcolumns, basta encher uma seringa padrão (10-20 mL seringas geralmente funcionam bem) com solução salina normal e conectá-lo a uma agulha de colheita.</li>
		<li>Completamente, insira a agulha de colheita na pele do doador, em seguida, recolhê-la.</li>
		<li>Empurre o êmbolo da seringa para liberar solução salina através da agulha de colheita e expulsar o microcolumn que está alojado no furo da agulha.</li>
		<li>Para acelerar o processo de colheita, repita a etapa 2.4.2 3 a 5 vezes antes de expulsar o microcolumns no passo 2.4.3. Nota: É conveniente geralmente expulsar o microcolumns em um coador de célula padrão para facilitar a coleção subsequente de microcolumns.</li>
		<li>Se as agulhas ficarem entupidas, aumente a pressão sobre o pistão para expelir o tecido furado e remover a obstrução. Se simplesmente aumentando a pressão é insuficiente, inserir um fio de metal através da abertura de ponta de agulha para a desobstruir a agulha do furo.</li>
		<li>Manter o microcolumns submergida em salina ou médio até o uso para evitar a dessecação. Nota: Com um operador experiente, o método descrito acima pode ser usado para colher microcolumns a uma taxa de aproximadamente 1 microcolumn por segundo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opção de alto volume:<ol>
<li>Crie um dispositivo de sucção assistida simples que pode ser construído para facilitar a recolha de grandes quantidades de microcolumns. Nota: O dispositivo consiste de uma agulha de colheita, seringa de 20 mL com bico de fechamento de luer, sucção adaptador normalmente usado para lipoaspiração(Figura 3)e o tubo de aspiração estéril.</li>
		<li>Remova o êmbolo da seringa de 20 mL.</li>
		<li>Ligue a seringa a um adaptador de aspiração.</li>
		<li>Complete a montagem, anexando uma colheita agulha à seringa (Figura 3B).</li>
		<li>Use um pedaço de tubo de aspiração estéril para conectar o adaptador de aspiração para uma vasilha de aspiração estéril. Certifique-se de que aparato colheita está ligado a uma entrada de caixa que permite que o fluido a fluir para o cilindro desimpedido (que pode exigir a conexão a uma porta da vasilha que está marcada para a saída, ao invés de afluência).</li>
		<li>Ligue o aparelho a uma fonte de pressão negativa. Nota: A pressão exigida depende de agulha de diâmetro e comprimento, como descrito anteriormente8. Para os aparelhos descritos neste manuscrito, o sistema de sucção encontrado em salas de operação típicas é geralmente suficiente.</li>
		<li>Conecte uma colheita agulha à seringa.</li>
		<li>Colheita da microcolumns, inserindo a colheita da agulha na pele. Nota: O microcolumns estará desenhado para a seringa de sucção, então liberado no tubo sucção.</li>
		<li>Intermitentemente, mergulhe a colheita agulha em um recipiente de solução salina estéril durante o procedimento de colheita para lavar o sistema. Nota: Esta salina facilita transporte da microcolumn e garante que eles manter-se hidratado. Alternativamente, um adaptador luer de QFP pode ser conectado ao conector luer lock da seringa e através de uma tubulação de conexão, também para um saco de soro de enforcamento.</li>
		<li>Tenha à mão um fio de metal, ou menor medidor de agulha, que é ligeiramente menor do que o diâmetro interior da agulha a colheita. Se a agulha ficar entupida, ela pode ser desmarcada inserindo o arame no furo da agulha.</li>
		<li>Quando a quantidade desejada de microcolumns acumuladas na vasilha, desligue o dispositivo de sucção, em seguida, despeje o conteúdo do tubo sucção para fora através de um filtro para recolher os microcolumns.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a colheita, aplica uma pomada antibiótica sobre os sites de doador. Nota: Curativos adicionais geralmente não são necessários para sites de doador.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+skin+grafting+and+treatment+of+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds.</a> Science. 346 (6212), 941-945 (2014).</li>
<li>Singh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenging+the+Conventional+Therapy%3A+Emerging+Skin+Graft+Techniques+for+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Challenging the Conventional Therapy: Emerging Skin Graft Techniques for Wound Healing.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4), 524-530 (2015).</li>
<li>Tam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractional+Skin+Harvesting%3A+Autologous+Skin+Grafting+without+Donor-site+Morbidity%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery.+Global+Open%22%5BJournal%5D)">Fractional Skin Harvesting: Autologous Skin Grafting without Donor-site Morbidity.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 1 (6), 47(2013).</li>
<li>Tam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+full-thickness+skin+by+microcolumn+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of full-thickness skin by microcolumn grafting.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (10), 2796-2805 (2017).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+hair+and+other+skin+appendages%3A+A+microenvironment-centric+view%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Regeneration of hair and other skin appendages: A microenvironment-centric view.</a> Wound Repair and Regeneration. 24 (5), 759-766 (2016).</li>
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<li>Rasmussen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+autologous%2Fallogeneic+constructs+for+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Military+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric autologous/allogeneic constructs for skin regeneration.</a> Military Medicine. 179, 8 Suppl 71-78 (2014).</li>
<li>Ter Horst, B., Chouhan, G., Moiemen, N. S., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+keratinocyte+delivery+in+burn+wound+care%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in keratinocyte delivery in burn wound care.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 123, 18-32 (2018).</li>
<li>Wong, V. W., Levi, B., Rajadas, J., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niches+for+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell niches for skin regeneration.</a> International Journal of Biomaterials. 2012, 926059(2012).</li>
<li>Manstein, D., Herron, G. S., Sink, R. K., Tanner, H., Anderson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractional+photothermolysis%3A+a+new+concept+for+cutaneous+remodeling+using+microscopic+patterns+of+thermal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fractional photothermolysis: a new concept for cutaneous remodeling using microscopic patterns of thermal injury.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 34 (5), 426-438 (2004).</li>
<li>Iriarte, C., Awosika, O., Rengifo-Pardo, M., Ehrlich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+applications+of+microneedling+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical%2C+Cosmetic+and+Investigational+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Review of applications of microneedling in dermatology.</a> Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 10, 289-298 (2017).</li>
<li>Anderson, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+treatment+of+traumatic+scars+with+an+emphasis+on+ablative+fractional+laser+resurfacing%3A+consensus+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Laser treatment of traumatic scars with an emphasis on ablative fractional laser resurfacing: consensus report.</a> Journal of the American Medical Association Dermatology. 150 (2), 187-193 (2014).</li>
<li>Hogan, S., Velez, M. W., Ibrahim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedling%3A+a+new+approach+for+treating+textural+abnormalities+and+scars%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cutaneous+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">Microneedling: a new approach for treating textural abnormalities and scars.</a> Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery. 36 (4), 155-163 (2017).</li>
<li>Manuskiatti, W., Fitzpatrick, R. E., Goldman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effectiveness+and+side+effects+of+carbon+dioxide+laser+resurfacing+for+photoaged+facial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Long-term effectiveness and side effects of carbon dioxide laser resurfacing for photoaged facial skin.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 40 (3), 401-411 (1999).</li>
</ol>

Os autores são co-inventores em patentes relacionadas com a tecnologia descrita neste artigo, do qual receberam licenciamento e receitas de royalties através da sua instituição, o Hospital Geral de Massachusetts. J. Tam também consulta para Medline Industries, Inc., que detém a licença comercial para esta tecnologia.

Os métodos descritos aqui destinam-se para permitir que a coleção de tecido microcolumns em quantidades suficientes na vivo grandes estudos em animais, usando ferramentas feitas de suprimentos de laboratório disponíveis comercialmente. Este aparelho tem sido usado anteriormente na colheita do tecido da pele humana extirpado4,9 , bem como de pele suína ao vivo3. Os parâmetros específicos descritos são aqueles que foram encontrados ...

Enxerto de pele autólogo é o esteio de reparação da ferida, mas é limitada pela escassez de sítio doador e morbidade, levando a esforços concertados nas últimas décadas para desenvolver novas opções terapêuticas para substituir o enxerto de pele convencional1,2 . Recentemente desenvolvemos um método alternativo de colheita da pele para aproveitar os benefícios do enxerto de pele de espessura total, minimizando a morbidade do sítio doador. Através da recolha de pele de espessura total na forma de pequenas (~0.5 mm de diâmetro) "microcolumns", locais de doadores são capazes de curar rapidamente e sem cicatrizes em circunstâncias normais (para possíveis exceções, consulte a seção de discussão abaixo)3. Microcolumns pode ser aplicado diretamente na ferida camas para acelerar o fechamento da ferida, reduzir a contração3e restaurar uma variada gama de tipos de células epidérmicas e dérmicas e estruturas funcionais dos anexos4, muitas das quais são carentes de enxerto de pele de espessura dividida convencional ou de substitutos de pele de bioengenharia atual5. A capacidade de microcolumns para aumentar a cura e de seus sites de doador para curar sem cicatriz ambos independentemente validados por outros grupos de pesquisa6,7.
Anteriormente, nós desenvolvemos um sistema de abate de laboratório para permitir que a coleção de microcolumns na escala8; no entanto, este sistema é composto de muitos componentes personalizados que não estão amplamente disponíveis. Aqui, descrevemos em detalhe o processo para produzir colheita agulhas, bem como sistemas de simples coleta, feita a partir principalmente componentes prontos para uso, que podem ser usados para atingir alto volume de colheita. Os aparelhos descritos neste manuscrito é apropriado para in vitro e em animal trabalho, mas não para uso em seres humanos. Um dispositivo clínico com autorização da FDA para a aplicação desta técnica em seres humanos é comercialmente disponível, mas não será discutido em detalhe aqui.

<table><tbody><tr><td>Roda diamantada</td><td>Dremel</td><td>545</td><td></td></tr><tr><td>Agulha hipodérmica (19G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-840-98</td><td>Outros tamanhos de agulha podem ser usados, dependendo das necessidades experimentais</td></tr><tr><td>Roda de pedra</td><td>Seringa Dremel</td><td>540</td><td></td></tr><tr><td>(20mL com trava luer)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-124-967</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de sucção</td><td>Tulip Medical</td><td>PA20BD</td><td>Opcional, para colheita de alto volume</td></tr><tr><td>Recipiente de sucção</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-212</td><td>Opcional, para colheita de alto volume. Esterilize antes de usar.</td></tr><tr><td>Tubo de sucção</td><td>Medline</td><td>DYND50216H</td><td>Opcional, para colheita de alto volume</td></tr></tbody></table>

aparelhos para colheita de tecido microcolumns

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

Este manuscrito descreve o processo de produção para um aparelho de laboratório, feito de componentes de prateleira, que podem ser usados para coletar a microcolumns dos tecidos da pele de espessura total. O tamanho pequeno da microcolumns permite aos doadores sites curar rapidamente sem causar local doador, cicatrizes, durante a colheita de tecidos da cheio-espessura permite a incorporação de todos os componentes celulares e extracelulares dos tecidos da pele, incluindo aqueles associados com regiões dérmicas profundas e as estruturas dos anexos da pele, que ainda precisa com sucesso ser reproduzido usando tecido convencional, técnicas de engenharia. O microcolumns pode ser aplicado diretamente em feridas de pele para aumentar a cura, ou podem ser usados como fonte de células/tecidos autólogos para outras abordagens de engenharia de tecidos. As agulhas de colheita são feitas, modificando o padrão de agulhas hipodérmicas, e podem ser usados sozinho para colheita de pequenas quantidades de tecido ou juntamente com um sistema simples baseado em sucção coleção (também feito de material de laboratório comumente disponíveis) para alto volume da colheita para facilitar os estudos em modelos animais grandes.

As agulhas de colheita devem ser capazes de coletar microcolumns cheio-espessura dos tecidos da pele com aproximadamente uma taxa de sucesso de 80-90%, e cada microcolumn deve conter a epiderme, derme e alguma gordura subcutânea (Figura 4). Se a taxa de sucesso de colheita é baixa, ou se torna-se difícil inserir uma agulha no tecido, em seguida, uma agulha nova provavelmente é necessária. Se a taxa de sucesso para a colheita é consistentemente baixa, mesmo co...

Aqui descrevemos um protocolo para a produção de colheita agulhas que podem ser usadas para coletar tecido cheio-espessura da pele sem causar o doador do site cicatrizes. As agulhas podem ser combinadas com um sistema de coleta simples para atingir alto volume de colheita.

Aparelhos para colheita de tecido Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Este método pode ajudar a responder perguntas essenciais no campo de regeneração do tecido da pele, que é como substituir os diversos tipos de células e estruturas que estão contidas na pele natural. A principal vantagem dessa técnica é que a pele autóloga de espessura total pode ser coletada com morbidade mínima do local do doador. Demonstrando o procedimento estará Bill Farinelli, que é um pesquisador associado em nosso laboratório.Inicie este procedimento com a configuração da etapa de produção, conforme descrito no protocolo de texto. Instale duas rodas de corte concentricamente na ferramenta rotativa. Use uma roda de corte de corte de diamante de grade inferior menor sobre uma roda de corte de pedra de grade maior.Posicione uma fonte de luz aérea com um braço ajustável sobre a ferramenta rotativa com a luz apontada para as rodas de corte. Para melhorar a visualização, posicione um microscópio de dissecação sobre a configuração da produção para que a ocular esteja focada nos discos de corte. Ao remodelar a ponta da agulha, use óculos protetores e uma máscara cirúrgica para evitar que partículas metálicas finas entrem nos olhos ou vias aéreas.Escolha agulhas hipodérmicas do tama

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JoVE Journal

Bioengineering

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