Name: Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Aprenda a avaliar o sinergismo entre anticorpos anticâncer e fármacos antineoplásicos usando a equação do índice de combinação de Chou-Talalay em modelos pré-clínicos. Este método quantifica interações medicamentosas para otimizar terapias oncológicas.

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Conceder apoio: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, Ligue La contre le Cancer Comitê de Loire-Atlantique, comité du Morbihan e Comitê de Vendée, une rosa pour S.A.R.A.H., L'Etoile de Martin e la Société Française de Lutte contre les Cânceres et les leucémies de L'enfant et de L'adolescent (SFCE). M.B. e J.F. são suportados pela La Liga Contre Le Cancer. Os autores graças a UTE-facilidade da estrutura Fédérative de Recherche François Bonamy. Os autores também agradecer o Dr. S. Suzin (Inserm, Paris) para fornecer as células IMR5 e a Sra. H. Estéphan para a assistência técnica.

Alojamento dos animais e procedimento experimental foram aprovados pelo governo francês (acordos #C44-278 e #APAFIS 03479.01). Procedimentos e cuidados com animais foram conduzidos sob a Directiva UE 2010/63/CE e Lei n ° 2013 #-118 relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos.
1. avaliação da interação de droga entre mAb 8B6 e Topotecano In Vitro
<ol><li>preparação da amostra de 96 poços Atenção: Consultar a Comissão de saúde e segurança da instituição e seguir as regras do regulamento local relacionadas a segurança do laboratório. Reveja as informações de Material e a ficha de dados de segurança antes de trabalhar com qualquer mídia, linhas celulares ou reagentes. Utilizar técnica asséptica adequada e trabalho em uma capa de fluxo laminar. Todas as soluções/equipamentos que são usados para manipular as células devem ser estéreis. Nota: O seguinte protocolo foi projetado para uso com células aderentes. As modificações são necessárias para aplicar o método de células crescendo em suspensão; Este protocolo usa quatro exemplares para cada condição experimental.<ol>
<li>Desenvolvem-se células de IMR5 num balão T75.</li>
		<li>No primeiro dia (dia 0), observe a cultura de células sob um microscópio para verificar a confluência de célula. Aspire o meio celular do frasco, lave-o com 5 mL de tampão fosfato salino (PBS) e adicionar 3 mL de 0,05% o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) / solução de PBS. Retorne o frasco para a incubadora por 3 min (37 ° C, 5% CO2).</li>
		<li>Examine a cultura de células sob um microscópio para o destacamento de célula. Nota: Se necessário, retorne o frasco para a incubadora para um adicional 3 a 5 min, dependendo do tipo de células do tumor.</li>
		<li>Adicionar 10 mL de meio de célula completa no balão e transferir a suspensão de células para um tubo cônico estéril 15 mL. Centrifugar as células durante 5 min à 300 x g. Conte as células usando um hemocytometer.</li>
		<li>Remover e descartar o sobrenadante. Resuspenda o pellet de células em um meio completo. Ajuste o volume médio para obter uma concentração final de 1 x 105 células/mL.</li>
		<li>Poços de semente 84 de uma placa de cultura de 96 poços com 104 células cada, que é de 100 µ l de suspensão de células. Siga o layout experimental mostrado na Figura 2.</li>
		<li>Incube as celulas para 18 h na incubadora celular (37 ° C, 5% CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da solução medicamentosa Nota: Para estudos de sensibilização de drogas/mAb, modifica a altura, o comprimento e o tratamento de concentração de acordo com o droga/mAb específico em questão. Observe que a concentração inicial é de 3 x a concentração final.<ol>
<li>Na manhã seguinte (dia 1), prepare as seguintes soluções de drogas usando o meio de crescimento completo.<ol>
<li>
preparação de solução do mAb
			<ol>
<li>Dilua o mAb em 500 µ l do meio de cultura completo para obter uma solução de trabalho de anticorpo com uma concentração de mAb 240 µ g/ml.</li>
				<li>Realize cinco diluições de série duas vezes, como indicado na Figura 2.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Preparação de solução de Topotecano
			<ol>
<li>Diluído, como acima, a droga em 500 µ l do meio de cultura completo para obter uma solução de trabalho de drogas com uma concentração final de 120 nM.</li>
				<li>Realize cinco diluições de série duas vezes, como indicado na Figura 2.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Preparação de solução anticorpo e drogas
			<ol>
<li>Dilua as soluções de drogas e mAb em 500 µ l do meio de cultura completo para obter uma solução em 120 nM droga e mAb 240 µ g/mL (solução de trabalho).</li>
				<li>Realize cinco diluições de série duas vezes, como indicado na Figura 2.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para obter a concentração final, transferi 50 µ l de cada solução de drogas para os poços correspondentes, conforme indicado no layout experimental ( Figura 2). Nota: Transferi 50 µ l de meio de cultura completo para os poços de célula não tratada, conforme indicado na Figura 2.</li>
		<li>Incube as celulas para 72 h na incubadora (37 ° C, 5% CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de MTT
	<ol>
<li>Adicione 10 µ l de solução de reagente MTT em cada poço.</li>
		<li>Incube a 37 ° C por 4 h.</li>
		<li>Adicione 100 µ l de solução de lise (10% SDS em 0,01 M HCl) em cada poço, usando uma pipeta multicanal e misture bem por pipetagem.</li>
		<li>Incube a 37 ° C por 4 horas em uma câmara umidificada (95% de umidade).</li>
		<li>Ler a absorvância a 570 nm (570) e 620 nm (620), utilizando um espectrofotômetro. Nota: Misturar cada amostra novamente pipetando antes de ler a absorvância; absorvância a 620 nm permite a correção dos valores de fundo inespecífica.</li>
		<li>Calcular a absorbância corrigida: corrigido absorbância = um570- um620.</li>
		<li>Calcular a viabilidade celular da seguinte maneira: viabilidade celular = 100 x (média corrigida absorvância da amostra / controle de média de absorbância corrigida).</li>
		<li>Calcular os valores afetados por fração (Fa) usando a seguinte equação: 1 - (média corrigida absorvância da amostra / controle de média de absorbância corrigida).</li>
	</ol></li>
	<li>Software de simulação analítica de interação de droga para single e estudos de combinação de drogas
	<ol>
<li>Execute o software de simulação para abrir a janela de início.</li>
		<li>Clique no botão para abrir a janela principal de Nova experiência .</li>
		<li>Digite o nome do experimento na janela de nome . Nota: A data pode ser adicionada na janela Data .</li>
		<li>Clique no botão Nova droga única .</li>
		<li>Digite o nome na janela Nome completo .</li>
		<li>Digite a abreviatura na janela abrev .</li>
		<li>Digite a unidade de concentração de droga na janela unidades .</li>
		<li>Inserir Dados ponto 1 Dose e valor de Fa, pressione Enter.</li>
		<li>Repita este passo até que todos os pontos de dados são inseridos.</li>
		<li>Clique no botão terminado .</li>
		<li>Siga os mesmos passos para inserir pontos de dados do mAb. Nota: Use a mesma unidade de concentração como é usado por droga.</li>
		<li>Clique no botão Nova combinação de drogas .</li>
		<li>Selecione a droga e mAb.</li>
		<li>Selecione a Relação constante e clique no Okey.</li>
		<li>Digite o nome na janela Nome completo .</li>
		<li>Digite a abreviatura na janela abrev .</li>
		<li>Digite a relação de drogas/mAb na proporção da janela.</li>
		<li>Insira Dados ponto 1 Dose e pressione Enter. Nota: O programa automaticamente irá calcular as doses de mAb e Combo.</li>
		<li>Insira o valor de Dados ponto 1 Fa e pressione Enter.</li>
		<li>Repita este passo até que todos os pontos de dados são inseridos.</li>
		<li>Clique no botão concluído e, em seguida, clique no botão Gerar relatório .</li>
		<li>Selecione a droga e mAb e, clique em Okey.</li>
		<li>Selecione o Combo e, clique em Okey.</li>
		<li>Selecione o cabeçalho, CI tabelae quadro-resumo. Em seguida, clique em Okey.</li>
		<li>Digite o nome do arquivo do arquivo de análise e clique em salvar para gerar o relatório. Nota: Depois de clicar Okey, o relatório será aberto automaticamente no navegador de web padrão do computador.</li>
		<li>Para imprimir o relatório, escolha Imprimir no menu arquivo do navegador da web. O relatório contém uma seção de tabela de resumo que inclui título, data, nome do arquivo, nota de descrição, parâmetros (m, Dm e r), ED50 para qualquer agente usado em monoterapia ou em combinação e a tabela de CI para cada combinação de ED50, ED 75, ED90e ED95. Nota: Um CI valor de < 1 indica sinergismo, um valor de CI de = 1 indica a aditividade e um valor de CI de > 1 indica o antagonismo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. geração de Xenografts humanos Neuroblastoma em obesos diabéticos NOD Gamma Scid Mice (NSG ratos)
Nota: Exclui qualquer contaminação da cultura de pilha. Desde que a matriz da membrana basal forma um gel acima de 5 ° C, todos os cultureware ou entrar em contato com o reagente de matriz de membrana basal de mídia deve ser prechilled/gelo-frio. Manter a matriz da membrana basal no gelo durante todo o processo.
<ol><li>
Preparação da suspensão de células de IMR5
	<ol>
<li>Descongele o reagente de matriz de membrana basal durante a noite, submergindo o frasco no gelo em um frigorífico de 4 ° C antes do uso.</li>
		<li>No dia 0, colha as IMR5 pilhas cultivadas como detalhado acima.</li>
		<li>Transferi as células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar x g por 5 min.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante. Lavar as células 2 x com 15 mL de PBS gelado e preparar uma suspensão de células de 5 x 107 células/mL de PBS gelado. Nota: Se necessário, transferi a suspensão de células para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
		<li>Agite o frasco de matriz de membrana basal. Nota: O reagente de matriz de membrana basal deve ser descongelado e dispersos.</li>
		<li>Adicionar um volume de reagente de matriz da membrana basal e misture pipetando para obter uma suspensão de células de 2.5 x 107 células /mL.</li>
		<li>Manter a suspensão de células no gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação dos ratos Nota: Os ratos devem ser seis ou sete semanas de idade.<ol>
<li>Manter os ratos sob uma condição específica de agentes patogénicos.</li>
		<li>Permita um período de aclimatação de três a cinco dias depois chegaram os ratos.</li>
		<li>No dia da inoculação, raspar o flanco onde será a injeção (consulte a etapa 2.3.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da injeção de células de tumor Nota: Manter a suspensão de células de matriz gelada da membrana basal asséptica durante o procedimento.<ol>
<li>Misture as células e cuidadosamente desenhar a suspensão de células em uma seringa de 1 mL, montada com uma agulha 21G.</li>
		<li>Verifique se que não há nenhuma bolha de ar na seringa.</li>
		<li>Desinfete a área de inoculação do mouse com uma solução anti-séptica.</li>
		<li>Aperte suavemente a pele do rato no flanco entre os dedos, no local da injeção.</li>
		<li>Insira a agulha exatamente a dobra de pele. Não coloque a agulha profundamente no tecido para garantir uma injeção subcutânea.</li>
		<li>Injete 100 µ l de suspensão de células IMR5 (ou seja, 2,5 x 106 células) por via subcutânea no flanco direito inferior dos ratos.</li>
		<li>Gire a seringa para evitar fugas e retirar a agulha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Monitoramento de alterações de peso do corpo e o crescimento do tumor
	<ol>
<li>Medir o comprimento (A) e a largura (B) do tumor com uma pinça.</li>
		<li>Calcule o volume do tumor usando a fórmula (A x B2) x 0,5.</li>
		<li>Inicie a terapia quando os tumores têm alcançado um volume médio de ~ 50-60 mm3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. drogas e administração de anticorpos em ratos
<ol><li>
Administração intravenosa de mAb 8B6
	<ol>
<li>Com cuidado, encha uma seringa de 1 mL, montada com uma agulha 25g com solução do mAb.</li>
		<li>Coloque o mouse sob uma lâmpada de calor por 10 min dilatar a veia da cauda.</li>
		<li>Contenha o mouse em uma retenção de roedor.</li>
		<li>Desinfete a área de inoculação do mouse com uma solução anti-séptica.</li>
		<li>Insira a agulha paralelamente a veia da cauda, penetrante 2-4 mm para o lúmen, mantendo o bisel da face de agulha para cima (Figura 3A).</li>
		<li>Injetar 100 µ l de solução de anticorpos por via intravenosa (i.v.).</li>
		<li>Terminada a injeção, suavemente, pressão no local da injeção para prevenir hemorragias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Administração intraperitoneal de Topotecano
	<ol>
<li>Desenhe a solução de drogas em uma seringa de 1 mL, montada com uma agulha de 25 G.</li>
		<li>Segure o mouse na posição supina, com a extremidade posterior ligeiramente elevada.</li>
		<li>Desinfete a área de inoculação do mouse com uma solução anti-séptica.</li>
		<li>Localize a linha mediana de abdômen do rato e mentalmente, dividir o abdome em quadrantes. Localize o local da injeção no quadrante inferior direito ou esquerdo (Figura 3B).</li>
		<li>Insira a agulha no abdômen (5 mm de profundidade) em ângulo de ~ 10°, no quadrante inferior direito ou esquerdo.</li>
		<li>Injetar 100 µ l de solução de fármaco intraperitonealmente (i.p.).</li>
		<li>Desinfecte o local da inoculação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+basis%2C+experimental+design%2C+and+computerized+simulation+of+synergism+and+antagonism+in+drug+combination+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies.</a> Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).</li>
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</ol>

S.Fa., J.F. e S.B. são designados como inventores do pendente patentes cobrindo a aplicação clínica de anticorpos terapêuticos anti-O-acetil-GD2.

Para prever o efeito de interações medicamentosas, podem ser usados três métodos: a metodologia de isobologram17, a mistura não-linear modelo18e a combinação do índice1. Análise do índice de combinação é o mais comumente usado porque sua aplicação é simplificada pela disponibilidade de um programa de computador user-friendly. Para esta finalidade, nós primeiro caracteriza a resposta de dose-efeito de cada agente usado sozinho ou em combinação, atravé...

A abordagem convencional no tratamento de um grande número de diferentes tipos de câncer foi baseada em monoterapia. Mesmo que ainda é usado em muitos casos, este método encontrou vários obstáculos levando a optar por terapias combinadas2. Particularmente, as células cancerosas são mais suscetíveis a desenvolver resistência quando tratados com uma única droga através da indução de sobrevivência alternativa mecanismos3, resultando em falha terapêutica em pacientes4. Além disso, em monoterapia, drogas são administradas geralmente em uma dose alta. Essa situação geralmente resulta da ocorrência de fortes efeitos colaterais de dose-dependente que pode ser intolerável e forçar os médicos a parar o tratamento2. Por estas razões, a associação de moléculas anticâncer é agora preferiu em monoterapia.
Combinações de drogas ideal seriam aqueles que agem em sinergia contra células tumorais, sem maior toxicidade contra células normais. Sinergismo refere-se a interação de duas ou mais drogas que produz um efeito terapêutico maior que a soma de cada fármaco individual agindo separadamente. Tais interações podem resultar em maior eficácia terapêutica clínica2. Isso limita a resistência de tratamento aumenta a eficácia e também pode reduzir a toxicidade2. Na verdade, a dose de cada fármaco pode ser reduzida para diminuir seus efeitos colaterais, orientando caminhos diferentes. Além disso, uma das moléculas também pode servir como um agente de sensibilização contra células cancerosas. O efeito da segunda droga pode ser melhorado em células sensibilizadas e menos dosagens podem ser usado5.
Terapia combinada pode incluir dois ou mais quimioterápicos e/ou produtos biológicos, tais como anticorpos monoclonais6. Esses mAbs voltados especificamente para as células expressando um antígeno de superfície celular de interesse e são capazes de matar células tumorais através de vias imunológicas, incluindo a citotoxicidade mediada por células do anticorpo-dependente (ADCC), com a participação de células imunes efetoras 7e citotoxicidade complemento-dependente (CDC)6. Eles também podem atuar através de um mecanismo não-imunológica mediado por apoptose8,9,10,11. Neste caso, a indução do processo de morte celular programada pode sensibilizar as células cancerosas, enfraquecer sua função e que a droga associada quimioterápico mais eficazes em uma dosagem mais baixa. Como tal, proapoptotic mAb são bons candidatos para a concepção de regimes de combinação com fármacos antineoplásicos.
Diferentes modelos matemáticos têm sido descritos para avaliar sinergismo de drogas; um deles é baseado na combinação índice método1. Este método baseia-se no princípio da mediana-efeito desenvolvido por Chou1. A equação da mediana-efeito correlaciona a dose da droga e o efeito de drogas como segue.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq1.jpg">
Aqui, D é a dose de drogas; DM é a dose mediana-efeito; FA é a fração que afetaram a dose; m é um expoente que significa a forma do dose-efeito trama1. A dose de mediana-efeito é usada para calcular a dose Dx de uma droga que inibe ou mata "x" por cento das células. O valor de CI é então calculado para avaliar o efeito aditivo da combinação de drogas, da seguinte forma1.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq2.jpg" style="font-size: 14px;">
CI o valor 1 indica um efeito aditivo e um valor de CI de &lt; 1 indica um efeito sinérgico, enquanto um valor de CI de &gt; 1 indica o antagonismo1. A aplicação deste método é facilitada pela disponibilidade de um programa de computador, CompuSyn, que determina o sinergismo e antagonismo em todas as doses ou níveis de efeito automaticamente simularam12.
O nosso grupo desenvolveu o mAb 8B6 específico para O-acetil-GD2 gangliosídeos (OAcGD2) neuroblastoma antígeno13 e ainda mais demonstrado que este mAb é capaz de induzir a morte celular com atributos de apoptosis11. Para testar se o mAb 8B6 pode sensibilizar as células de neuroblastoma de Topotecano o agente antineoplásicos, adaptamos o método acima mencionado, desenvolvido por Chou1. Primeiro, vemos a dose efetiva 50 (ED50) valores de mAb 8B6 e Topotecam. Em seguida, as células de neuroblastoma com equipotent rácios dos dois compostos com base nos valores de50 ED são expostas para determinar os valores de CI usando o software de simulação acima mencionados. Este método nos permite demonstrar sinergismo entre mAb 8B6 e Topotecano em vitro. Em seguida, descreveremos um protocolo para avaliar a potência e a segurança desta combinação regime na vivo. Este protocolo pode ser facilmente aplicado para selecionar mAb anticâncer potente e seguro e agente quimioterapêutico combinações em estudos pré-clínicos. Uma representação esquemática deste estudo é fornecida na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Kit de Proliferação Celular (MTT)</td><td>Roche</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>Software CompuSyn</td><td>ComboSyn</td><td></td><td>pode ser baixado gratuitamente em http://www.combosyn.com</td></tr><tr><td>Barbeador elétrico</td><td>Bioseb</td><td>BIO-1556</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVFF00-01</td><td>10% de soro fetal de bezerro inativado por calor em RPMI 1640</td></tr><tr><td>Firefox&nbsp;</td><td>Mozilla Corporation</td><td></td><td>Firefox pode ser baixado gratuitamente em http://www.mozilla.org/en-US/firefox/</td></tr> <tr><td>Lâmpada de calor</td><td>Verre& Quartzo</td><td>4003 / 1R</td><td></td></tr><tr><td>Neuroblastoma humano IMR-5 linha celular</td><td>Accegen Biotechnology</td><td>ABC-TC0450</td><td>IMR-5 é um clone da linha celular de neuroblastoma humano IMR32 5459762. As células IMR-5 foram generosamente fornecidas pelo Dr. Santos Susin (U.872, Paris, França)</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>2 mM em solução de lise RPMI 1640</td></tr><tr><td></td><td>Roche&nbsp;</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>mAb 8B6</td><td>Universidade de Nantes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC</td><td>Thermofischer Scientific&nbsp;</td><td>N08625</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 21G 1 &frac12; &nbsp;</td>Agulha <td>304432</td><td></td> <td>BD</td></tr><tr><td>Microlance 25G 1</td><td>Camundongos Terumo</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas Nunc MicroWell de 96 poços</td><td>Thermofisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 0,05% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>PC que roda windows 7</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Windows 7 pode ser adquirido a http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 unidades/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina em RPMI 1640</td></tr><tr><td>Reservatório de reagentes</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>8094</td><td></td></tr><tr><td>Limitador de roedores</td><td>Bioseb</td><td>TV-150-SM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Topotecano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2705</td><td></td></tr></tbody></table>

potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potencialização dos hostis antibodies monoclonal (mAb) por agentes quimioterápicos constitui uma estratégia valiosa para a concepção de terapia eficaz e segura contra o câncer. Aqui nós fornecemos um protocolo para identificar uma combinação racional na etapa pré-clínica. Primeiro, nós descrevemos um baseada em célula de ensaio para avaliar o sinergismo entre mAb anticâncer e drogas citotóxicas, que utiliza a equação de índice de combinação de Chou e Talalay1. Isso inclui a medição de tumor celular droga-anticorpo-sensibilidade e usando um ensaio de MTT, seguido por uma análise automatizada de computador para calcular os valores de índice (CI) de combinação. Valores de CI de < 1 indicar sinergismo entre mAbs testado e agentes citotóxicos1. Para corroborar o em vitro achados na vivo, descrevemos mais um método para avaliar a eficácia do regime de combinação em um modelo de tumor de enxerto. Neste modelo, o regime combinado significativamente atrasa o crescimento do tumor, o que resulta em uma significativa sobrevivência prolongada em comparação com controles de único agente. Importante, a experimentação na vivo revela que o regime de combinação é bem tolerado. Este protocolo permite a avaliação eficaz das combinações de drogas anticâncer em modelos pré-clínicos e a identificação de uma combinação racional de avaliar em ensaios clínicos.

Os resultados representativos e figuras são adaptadas com a permissão de trabalho anteriormente publicado14.
Anti-OAcGD2 mAb 8B6 sinergicamente aumenta os efeitos inibitórios de Topotecano no crescimento de linha de células de Neuroblastoma:
Para estabelecer a droga e as concentrações de anticorpos deve ser usado para avaliar o ...

Este protocolo descreve como avaliar o sinergismo entre um anticorpo anticâncer e medicamentos antineoplásicos em modelos pré-clínicos, usando a equação de índice de combinação de Chou e Talalay.

Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

A imunoterapia combinada com a quimioterapia representa uma abordagem inovadora para desenvolver uma terapia eficiente no câncer. Os principais objetivos são alcançar efeitos sinérgicos, terapêuticos, redução de dose e toxicidade, e minimizar ou retardar a indução da resistência medicamentosa. No entanto, por razões práticas e éticas, não é possível determinar o sinergismo nos pacientes. Assim, antes da combinação direta em ensaios clínicos, estudos de combinação de prenicaptores, in vitro e/ou em animais, devem ser realizados para obter a lógica para estudos clínicos. Um método simples e robusto para a quantificação do sinergismo entre as drogas baseia-se na equação de índice de combinação desenvolvida por Shouan Talale, como ilustrado neste vídeo. Usando este método, e sua simulação computadorizada, evidenciamos aqui o sinergismo entre o Anticorpo Monoclonal 8B6, que é específico para o antígeno de neuroblastoma O-Acetyl-GD2 Ganglioside e a droga quimioterápica Topotecan em células neuroblastoma. Resumidamente, após determinar a dose efetiva de 50 valores de cada composto em IMO humana, 5 linha celular neuroblastoma, essas células foram entubadas com razões equitagens dos dois compostos, e os valores do índice de combinação foram calculados por meio de simulação computador automatizada. Em seguida, confirmamos esses resultados na Vivo, em um modelo IMO, 5 tumores xenografados. Nós cultivamos células IMR-5 em um frasco T75, observamos-nas sob um microscópio, para verificar a confluência celular. Asperate meio celular do frasco, lave com 5 mL de PBS. Adicione 3 mL de solução 0,05%EDTA/PBS. Devolva o frasco à incubadora por 3 minutos. Examine a cultura celular sob um microscópio para desprendimento celular. Adicione 10 mL de meio celular completo ao frasco e transfira a suspensão da célula para um tubo cônico estéril de 15 mL. Centrífuga por cinco minutos a 300 g.Conte células usando um hemócito. Remova e descarte o supernaspe. Re suspender células em Meio de Crescimento Completo.Ajuste o volume médio para obter concentração final de 100.000 células/mL.Semente 84 poços, 96 placas de cultura bem com 10.000 células cada, que é 100 microliters de suspensão celular. Incubar células por 18 horas na Incubadora celular.Diluir anticorpo monoclonal em 500 microliters de Meio de Crescimento Completo para obter uma solução de trabalho de anticorpos com uma concentração de anticorpos monoclonais 240 micro-gramas por mL.Execute 5 delírios serial duas vezes, conforme indicado no protocolo. Diluir a droga em 500 microliters de Complete Growth Medium para obter uma solução de trabalho medicamentosa com uma concentração final de 120 nanomolar. Realize 5, duas vezes delírios seriais, como indicado no protocolo. Diluir da mesma forma que a droga mais soluções de anibodies monoclonais. Para chegar à concentração final, transfira 50 microliters de cada solução de medicamentos nos poços correspondentes, como mostrado neste layout experimental. Incubar as células por 72 horas na incubadora. Adicione 10 microliters de solução de reagente MTT em cada poço. Incubar a 37 graus Celsius por 4 horas. Adicione 100 microliters de solução lycine em cada poço usando uma pipeta multicanal e misture bem por pipetação. Incubar a 37 graus Celsius por 4 horas em uma câmara umidificada. Livre os absorventes a 570 e 620 nanômetros usando um espectrômetro. Calcule a viabilidade celular da seguinte forma. Calcule os valores afetados pela fração usando a seguinte equação. Execute o software de simulação, clique no novo botão de experimento para obter a janela principal. Digite o nome do experimento. Clique em nova droga única. Digite o nome. Digite a abreviação. Digite a unidade de concentração de drogas. Digite dados 1 dose e valor fa. Pressione Enter.Repita esta etapa até que todos os pontos de dados sejam inseridos. Clique em Concluído.Siga os mesmos passos para inserir os pontos de dados de anticorpos monoclonais. Clique em New Drug Combo.Select droga e anticorpos monoclonais. Selecione Relação constante.clique em OK. Digite o nome. Digite a abreviação. Digite a relação de anticorpos monoclonais da droga. Digite a dose 1 dos dados. Pressione Enter.O programa calculará automaticamente as doses de Anticorpo Monoclonal 8B6 e combo. Digite o valor de FA dos dados 1.Pressione Enter.Repita esta etapa até que todos os pontos de dados sejam inseridos. Clique em Concluído.Em seguida, clique em Gerar Relatório.Selecione a droga e o anticorpo monoclonal e, em seguida, clique em OK. Selecione Combo e clique em OK. Selecione Cabeçalho, Tabela CI e Tabela de Resumo e clique em OK. Digite o nome do arquivo e a análise e clique em salvar para gerar o relatório. O relatório é aberto automaticamente no navegador padrão da Web. O relatório contém uma seção de tabela de resumo que inclui título, data, nome final, nota de descrição, m, Dm e r parâmetros, dose efetiva 50 para qualquer agente usado como monoterapia ou em combinação, e a tabela de índice de combinação para cada combinação na dose efetiva 50, 75, 90 e 95.Um valor de índice de combinação menor que 1 indica sinergismo. Um valor igual a um indica aditividade. Um valor maior que 1 indica antagonismo. Descongele a matriz da membrana do porão durante a noite submergindo o frasco no gelo em 4 graus C geladeira antes do uso. Todo o desgaste da cultura, ou mídia que entra em contato com a métrica da membrana do porão deve ser prechilled. Colher a cultura IMR5. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 300 g por 5 minutos. Descarte o supernaspeso. Lave as células com 15 mL de pbs gelado duas vezes. Prepare uma suspensão celular para 5 milhões de células por mL em PBS gelado. Transfira a suspensão do celular para um microtubo de 1,5 mL. Frasco de matriz de membrana do porão giratório. Adicione 1 volume do reagente da matriz da membrana do porão, misturado por pipetação para obter suspensão celular de 2,5 milhões de células por mL.Mantenha a suspensão celular no gelo. Raspe o flanco de onde a injeção será feita. Misture as células e desenhe cuidadosamente a suspensão celular em uma seringa de 1 mL montada com uma agulha de 21 g. Verifique se não há bolhas de ar na seringa. Desinfetar a área de inoculação dos camundongos com uma solução antisséptica. Aperte suavemente a pele do rato no flanco entre os dedos no local da injeção. Insira a agulha exatamente na dobra cutânea. Não coloque a agulha profundamente no tecido para assegurar a injeção subcutânea. Injete 100 microliters de suspensão celular IMR5 subcutânea. Gire a seringa para evitar a propagação líquida e retire a agulha. Monitore os camundongos para o peso corporal e o crescimento do tumor. Meça o comprimento e largura do tumor com um calibre. Calcule o volume do tumor usando esta fórmula. Terapia inicial quando os tumores atingiram um volume médio de 50 a 60 mm

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Pesquisa sobre o Câncer

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Combinações de drogas sinérgica são difíceis e demorados identificar empiricamente. Aqui, descrevemos um método para identificar e validar sinérgicas pequenas moléculas.

Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição2

Neste protocolo, descrevemos como fazer Loewe medições de interação de drogas baseadas em aditividade para pairwise e combinações de drogas de três vias.

Método diagonal medida sinergia entre qualquer número de drogas

Antimicrobiana sinergia teste é usado para avaliar o efeito de dois ou mais antibióticos usados em combinação e é normalmente realizada por um dos dois métodos: a matriz do tabuleiro de damas ou o ensaio de matar tempo. Aqui, apresentamos um automatizado, jato de tinta impressora assistida quadriculado matriz sinergia técnica e um estudo clássico sinergia... matar tempo.

Antimicrobiana sinergia testes pela impressora jato de tinta-assistida matriz Checkerboard automatizado e o método Manual de tempo-kill

Grandes telas genéticas em organismos modelo levaram à identificação de interações genéticas negativas. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho de integração de dados usando dados de telas genéticas em organismos modelo para delinear combinações de medicamentos visando interações letais sintéticas no câncer.

Um fluxo de trabalho de integração de dados para identificar combinações de drogas visando interações letais sintéticas

Um sistema de ensaio in vitro de alta throughput foi desenvolvido para avaliar drogas anticancerígenas usando organoides tumorais derivados do paciente (PDOs), semelhantes aos tecidos cancerígenos, mas são inadequados para sistemas de ensaio in vitro de alto rendimento com placas de 96 poços e 384 poços.

Ensaio in vitro de alta produtividade usando organoides tumorais derivados do paciente

Este protocolo apresenta uma técnica automatizada de alto rendimento baseada em imagem para identificar compostos que modulam a morte de células de câncer de mama mediadas por células natural killer na presença de um anticorpo terapêutico anti-HER-2.

Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio de citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpos usando um kit de bioensaio ADCC. Este método oferece uma ferramenta valiosa para elucidar o mecanismo ADCC e avaliar o potencial terapêutico dos anticorpos na imunoterapia contra o câncer.

Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

Um procedimento para implantar células cancerígenas pancreáticas que expressam proteínas fluorescentes verdes (PANC-1 GFP) ortotopicamente no pâncreas de camundongos Balb-c Ola Hsd-Fox1nu para avaliar a progressão e metástase do tumor é apresentado aqui.

Fluorescente modelo de camundongo ortotópico de câncer de pâncreas

Aprenda a avaliar o sinergismo entre anticorpos anticâncer e fármacos antineoplásicos usando a equação do índice de combinação de Chou-Talalay em modelos pré-clínicos. Este método quantifica interações medicamentosas para otimizar terapias oncológicas.

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Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

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