Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada
17 de outubro de 2018
Temos protocolos e desenvolvido um aparelho personalizado para permitir a inserção de espécimes de milímetro-escala. Apresentamos os procedimentos de preparação de amostra com ênfase na incorporação em resina acrílica e poliimida tubulação para alcançar a imobilização rígida e armazenamento a longo prazo de espécimes para o interrogatório de morfologia de arquitetura e células de tecidos por micro-CT.
Este método permitirá que você gere imagens histológicas tridimensionais a partir de pequenas amostras de escala milimétrica, incluindo pequenos organismos modelo. A principal vantagem desta técnica é que as amostras incorporadas são muito estáveis, permitindo que você mantenha as amostras por longos períodos de tempo e as imagem várias vezes, digamos com diferentes métodos de imagem ao longo dos anos. A saída deste método será altamente útil para fenemias de sistemas de alto rendimento, toxicologia e, potencialmente, até mesmo diagnósticos de tecido humano.
Geralmente indivíduos novos neste método lutarão porque as amostras são relativamente pequenas e difíceis de orientar ou manobrar. A demonstração visual é fundamental porque é necessária atenção para evitar danos à amostra. Para zebrafish juvenil ou mais velho, ensapeir-os por pelo menos 24 horas, a fim de reduzir o volume de conteúdo intestinal antes da fixação.
Mova formalina tampão 10% neutra ou NBF e 2x Tricaine-S pré-refrigerado a quatro graus celsius no gelo. Dobre o volume de água do peixe com 2x MS-222 refrigerados para eutanásia rápida e humana. Sessenta segundos depois que os peixes pararam de se mover, após a eutanásia humana, coloque o peixe em solução de 10% NBF refrigerada em frascos de vidro de fundo plano à temperatura ambiente, e fixá-los durante a noite.
No segundo dia, enxágue os espécimes de peixes fixos três vezes em 1x PBS pH 7.4 por 10 minutos cada. Após a lavagem, submerse as amostras em 35% de etanol e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, repita esta etapa com 50% de etanol.
Incubar as amostras em ácido fosfotungstênio recém-preparado de 0,3% ou solução pta durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave para manchá-las. Comece o terceiro dia preparando uma mistura de volume por volume de 100% etanol e resina acrílica branca LR. Enxágüe as amostras três vezes em 70% de etanol por 10 minutos cada, depois incuba as amostras em 90% de etanol em temperatura ambiente por 30 minutos com agitação suave.
Repita a incubação nas mesmas condições, mas 95% etanol e depois mais duas vezes com 100% de etanol. No final, submergir as amostras em etanol de um para um e mistura de resina acrílica branca LR, e incubar à temperatura ambiente durante a noite com agitação suave. No quarto dia, retire a mistura do frasco e adicione resina branca 100% LR para submergir as amostras.
Incubar por duas horas em temperatura ambiente com agitação suave. Depois de duas horas, substitua a resina por resina branca fresca de 100% LR e incubada por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave. Para montar o aparelho de incorporação, use a tubulação poly MI com um diâmetro de pelo menos 0,1 milímetros maior que o diâmetro da amostra, e corte-o a um comprimento padrão de 30 milímetros.
Em seguida, conecte uma cabeça de micro-tubo P1000 à extremidade branca do adaptador de incorporação e insira a tubulação poly MI à extremidade estreita. Depois que as amostras tiverem incubado por uma hora em resina branca 100%, transfira-as para um pequeno barco de pesagem e submerse totalmente em resina branca 100%LR. Mire a tubulação do aparelho de incorporação na extremidade larga da amostra fixa, ou em direção à cabeça, e encosta o espécime lentamente na tubulação.
Posicione a amostra no meio da tubulação, certificando-se de que a tubulação acima e abaixo do espécime esteja cheia de resina. Imediatamente depois, para selar a extremidade aberta da tubulação, achate um pedaço de argila de modelagem macia à base de óleo em uma folha de cerca de um milímetro de espessura e estabilize a tubulação entre o indicador e os dedos médios. Em seguida, pressione lentamente a argila contra a extremidade do tubo com o polegar, e remova qualquer excesso de argila.
Remova o aparelho de incorporação da cabeça do micro-tubo. Puxe a tubulação por rotação suave. Enquanto segura um dedo contra a extremidade selada para evitar a ejeção da argila, sele a outra extremidade empurrando lentamente a extremidade não selada da tubulação para a argila.
Coloque a tubulação horizontalmente em um rack de tubo, e deixe a resina polimerizar por 24 horas a 65 graus celsius no forno. No final do dia seguinte, colete as amostras para aquisição de imagens. Uma larva de zebrafish incorporada com sucesso não tem bolhas de ar presas.
Se o ar estiver preso durante o processo de incorporação, ele pode mover-se em direção ao espécime se a amostra não for colocada horizontalmente durante a polimerização, o que pode degradar a qualidade da imagem. Este protocolo foi bem sucedido na incorporação de vários organismos modelo. Como zebrafish, Drosophila, Daphnia e embrião de camundongos.
A incorporação bem sucedida pode ser mostrada com renderizações 3D reconstruídas, imagens por micro-tomografia computadorizada para zebrafish, Dafnia e Drosophila. A incorporação da resina pode ser vista em todos os exames fora da amostra, mas não interfere com a amostra em si. Esses espécimes podem ser armazenados por um longo período de tempo e reutilizados para múltiplas sessões de imagem, como mostrado com larva de zebrafish imagem em 2011.
E então novamente em 2013. As características anatômicas são preservadas após o armazenamento, como visto em close-ups de músculos de ambos os exames. Além disso, os perfis de intensidade normalizados para suas médias correspondentes ao longo das linhas segmentadas, mostram picos locais espacialmente correspondentes em ambos os exames.
Os valores médios de intensidade para as regiões selecionadas em ambas as varreduras foram divididos por uma média para o fundo e utilizados para gerar relações sinal-ruído, o que correspondeu bem entre os exames. Ao tentar este método, é importante trabalhar suavemente para evitar danos à amostra e trabalhar cuidadosamente para evitar a introdução de bolhas de ar. Após esse procedimento, outros métodos como histologia ou microscopia eletrônica podem ser usados para estudar padrões de expressão proteica, ou alcançar maior resolução de regiões de interesse em 2D.
Nossa esperança é que esta publicação o ajude a acessar o poder da micro-TC tecidual de alta resolução.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para embutir espécimes em escala milimétrica, destacando o uso de resina acrílica e tubos de politrimida. A técnica permite o armazenamento de longo prazo e múltiplas sessões de imagem, facilitando o estudo da arquitetura tecidual e da morfologia celular por meio de micro-TC.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Histologia
Contexto
- As técnicas de inclusão são cruciais para preservar amostras biológicas pequenas.
- A estabilidade das amostras incluídas permite armazenamento prolongado e imagens repetidas.
- A imagem por micro-TC fornece imagens histológicas tridimensionais detalhadas.
- Desafios comuns incluem a orientação da amostra e a prevenção de danos durante o preparo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver protocolos para inclusão de pequenos espécimes para imagem.
- Aumentar a estabilidade e a usabilidade das amostras ao longo do tempo.
- Demonstrar a eficácia do método com diversos organismos modelo.
Métodos Utilizados
- Preparação de espécimes utilizando formalina tamponada neutra e Tricaine-S.
- Inclusão de amostras em resina acrílica LR white usando tubos de politrimida.
- Polimerização da resina em temperaturas controladas.
- Imagem de micro-CT para reconstrução tridimensional das amostras.
Resultados Principais
- Embebição bem-sucedida de espécimes de peixe-zebra, Drosophila e Daphnia.
- Imagens de alta qualidade obtidas sem bolhas de ar afetando as amostras.
- As amostras preservaram características anatômicas durante períodos prolongados de armazenamento.
- O método permite múltiplas sessões de imageamento com resultados consistentes.
Conclusões
- O método de inclusão desenvolvido é eficaz para pequenas amostras biológicas.
- O armazenamento de longo prazo e a reutilização de amostras aumentam as capacidades de pesquisa.
- Este protocolo pode facilitar estudos adicionais em histologia e microscopia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A histologia 3D sem cortes por micro-TC, viabilizada pelo inclusão rígida de espécimes milimétricos fixados e corados, atende à necessidade crítica de análise tecidual volumétrica de alta resolução em pesquisas de descoberta inicial e pré-clínicas. Esta abordagem preserva a integridade anatômica e permite imagens quantitativas repetidas, apoiando triagens fenotípicas robustas e a redução de riscos mecanicistas. O método aumenta a confiança preditiva e a eficiência de recursos em todo o fluxo de sistemas modelo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite análise abrangente da arquitetura tecidual tridimensional para validação funcional de alvos.
- Apoia a redução de riscos mecanicistas ao preservar características celulares e subcelulares para interrogatórios repetidos.
- Facilita estudos orientados por hipóteses em organismos modelo relevantes para vias de doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece amostras estáveis e reutilizáveis para triagens fenotípicas de alto rendimento e fluxos de trabalho em toxicologia.
- Oferece resultados quantitativos e reproduzíveis de imagem para padronização de ensaios.
- Permite compatibilidade de imagem entre plataformas, apoiando flexibilidade analítica em etapas posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Mantém a fidelidade anatômica para estudos longitudinais e alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, permitindo a reanálise de amostras ao longo de vários anos.
- Reduz a variabilidade biológica e o risco na avaliação de modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de inclusão e imagem se integra na interface entre a fase inicial de descoberta, triagem fenotípica e validação de modelos pré-clínicos, fornecendo uma plataforma reutilizável para análise de tecidos tridimensionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação da hipótese nula e a elucidação de vias ao permitir a obtenção repetida de imagens quantitativas tridimensionais de espécimes preservados.
- Triagem: Fornece amostras estáveis e prontas para ensaios, adequadas para avaliação fenotípica e toxicológica em larga escala.
- Análise: Oferece perfis quantitativos de intensidade e medidas de relação sinal-ruído para comparação estatística robusta.
- Pesquisa Translacional: Preserva amostras para análise biomarcadora e anatômica multianual e entre estudos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um recurso padronizado e de longo prazo para estudos retrospectivos e de imagem multimodal.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos baseados em tecidos.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo de amostras, melhora a reprodutibilidade e permite fluxos de trabalho de imagem escaláveis.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao preservar amostras de alto valor para análises repetidas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos em descoberta e pré-clínicos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em imagem de micro-TC e manipulação precisa de amostras para evitar danos e introdução de bolhas de ar.
- Necessita de acesso a materiais para inclusão, tubos de poliimida e infraestrutura de polimerização com controle de temperatura.
- Exige padronização entre equipes para garantir orientação consistente das amostras e qualidade de imagem.
- Adaptável a uma variedade de organismos modelo pequenos e tipos de tecidos dentro de limites de tamanho especificados.
- É essencial prestar atenção cuidadosa às etapas do protocolo para manter a integridade da amostra e a fidelidade da imagem.
