Fabricação de dispositivos de refração-índice-combinada para microfluídica biomédica

Este método pode ajudar a enfrentar um desafio importante na combinação de microscopia com microfluídica, permitindo a correspondência do índice de refração entre a estrutura do microcanal e o meio aquoso dentro do canal. A principal vantagem dessa técnica é que ela é compatível com os métodos de fabricação comumente usados para criar dispositivos microfluídicos. Outra vantagem importante de nossa abordagem é o método usado para vedar microcanais feitos de materiais com baixa adesão, que é um problema comum entre polímeros de índice de refração de poços.

A demonstração visual desse método é crucial, pois as etapas para selar o canal podem ser difíceis de acertar. Por exemplo, é importante que os reservatórios estejam desobstruídos durante a fixação. Comece este procedimento com a fabricação de polidimetilsiloxano, ou PDMS, negativo, conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, preencha o negativo PDMS com 400 microlitros de MY-133-V-2000. O negativo deve estar ligeiramente sobrecarregado. Coloque o negativo PDMS cheio de MY-133-V-2000 na câmara de vácuo por duas horas para remover quaisquer bolhas.

Depois de remover o MY-133-V-2000 da câmara de vácuo, pressione uma lâmina de vidro contra a parte superior do negativo ligeiramente cheio demais para criar uma superfície plana de MY-133-V-2000 e evitar que o oxigênio iniba a polimerização. Em seguida, insira o MY-133-V-2000 em um forno UV de 400 watts. Defina a radiação UV para 50% da intensidade máxima por 300 segundos para curar o microcanal.

Esta é uma potência de aproximadamente 4,5 joules por centímetro quadrado, aproximadamente o dobro do poder mínimo de cura recomendado pelo fabricante. Depois de cortar o acrílico conforme descrito no protocolo de texto, coloque duas pequenas gotas na borda do acrílico e use uma ferramenta descartável para espalhar uniformemente a cola. Coloque o substrato de vidro sobre o acrílico e deixe a cola secar usando o peso do vidro para mantê-lo no lugar.

Cubra o vidro exposto com 100 microlitros de PDMS usando uma pipeta de deslocamento positivo. Em seguida, insira a camada de base em um revestidor a vácuo para revestir uniformemente o vidro com um filme PDMS de aproximadamente 10 micrômetros de espessura usando uma velocidade de 1500 RPM por dois minutos. Remova a camada de base do revestidor giratório e limpe cuidadosamente qualquer excesso de PDMS que revestiu o acrílico com acetona e papel toalha.

Tenha cuidado para não perturbar o PDMS não curado. Agora, asse a camada de base com o PDMS em um forno a 65 graus Celsius por duas horas para curar o PDMS. Pipete um mililitro de PDMS em uma lâmina de vidro e, em seguida, use outra lâmina de vidro para espalhar uniformemente o PDMS até que comece a escorrer pelas laterais.

Catalise em uma chapa quente a 150 graus Celsius por 10 minutos. Corte o PDMS curado em um retângulo com as mesmas dimensões do dispositivo MY-133-V-2000. Em seguida, usando a camada intermediária do acrílico como molde, faça furos para o reservatório e corte uma janela de visualização quadrada no PDMS para fazer a junta do PDMS.

Agora, remova o MY-133-V-2000 curado do forno UV e remova o canal do negativo e coloque-o em um substrato plano com o lado do canal voltado para cima. Remova a camada de base contendo o PDMS curado do forno de 65 graus e coloque-a sobre o substrato. Em seguida, coloque o substrato com o canal MY-133-V-2000 e a camada de base no limpador de plasma de oxigênio.

Defina a pressão de vácuo para 200 militorr e o nível de radiofrequência para alto. Prossiga para tratar a superfície do canal e do substrato de vidro por 30 segundos. O plasma de oxigênio deve brilhar em azul quando o limpador de plasma é ligado.

Após 30 segundos, remova o microcanal e a camada de base do limpador de plasma. Usando uma pinça, coloque imediatamente o canal MY-133-V-2000 voltado para baixo no recorte retangular da camada de base acrílica, de modo que ele entre em contato com o PDMS. Agora, coloque a junta PDMS em cima do dispositivo MY-133-V-2000, alinhando os orifícios da junta com os reservatórios do dispositivo.

O uso desta junta PDMS é crucial porque o PDMS é mais elástico que o MY-133-V-2000 e, portanto, pode ser mais comprimido. Isso permite que a força seja transferida do acrílico para o microcanal sem quebrar o vidro. Neste ponto, coloque o dispositivo inacabado em uma plataforma elevada acima da bancada para fornecer um clampsuperfície para montagem do dispositivo.

Em seguida, extraia três mililitros de cimento acrílico usando uma seringa. Distribua cimento acrílico suficiente no topo da camada de base para fornecer uma camada fina. Faça a camada o mais uniforme possível e não deixe o material penetrar no canal.

Agora, coloque a peça de acrílico da camada intermediária em cima da camada de base de acrílico. Certifique-se de que os orifícios estejam alinhados com os reservatórios do canal MY-133-V-2000. Prenda a camada intermediária na camada de base o mais firmemente possível e segure-a por dois minutos enquanto o cimento endurece para unir os pedaços de acrílico.

Certifique-se de que os reservatórios não estejam obstruídos durante esta etapa para evitar que o ar fique preso embaixo do dispositivo MY-133-V-2000. O ar preso entre o MY-133-V-2000 e o substrato permanecerá preso se os reservatórios estiverem obstruídos. Isso causará vazamentos no dispositivo acabado.

Portanto, é fundamental que os furos não sejam obstruídos durante esta etapa. Depois que o cimento endurecer, remova a pressão do dispositivo. Coloque o cimento acrílico na camada intermediária nos locais de contato antecipado com a camada superior do acrílico.

Agora, coloque a camada superior do acrílico na peça intermediária do acrílico, garantindo que os orifícios estejam alinhados com os reservatórios. Deixe descansar na bancada por dois minutos enquanto o cimento acrílico seca. Teste o dispositivo MY-133-V-2000 adicionando 10 microlitros de corante alimentar ou água deionizada em um dos orifícios do reservatório para testar a adesão e o fluxo.

Insira um tubo no reservatório oposto e conecte a outra extremidade a um purgador de vácuo. Ligue o aspirador para puxar o corante ou a água pelo canal para garantir que um dispositivo bem-sucedido foi criado. Verifique ao microscópio se não há vazamentos no canal ou reservatório.

Usando o vácuo, remova o corante de ambos os reservatórios. Em seguida, enxágue os reservatórios com etanol. Coloque o etanol em um reservatório.

Puxe o etanol usando o vácuo. Deixe o etanol descansar em temperatura ambiente por 10 minutos. Pulverize bem o canal com etanol e coloque-o em um prato de poliestireno estéril.

Embrulhe bem com Parafilm e guarde até que seja necessário. O mapa de calor mostrado aqui representa a massa de células MCF-7 aderentes ao FOD em um microcanal. Poucos artefatos são visíveis perto das paredes do microcanal.

Nesta medição, uma única célula MCF-7 aderente pode ser vista na borda do microcanal próximo à parede. A falta de artefatos perto da parede permite que medições quantitativas precisas sejam obtidas, mesmo quando as células estão próximas à parede do canal. Esta figura final mostra um par de células MCF-7 assentadas perto da parede do microcanal.

A massa dessas células em cada pixel pode ser medida com precisão usando microscopia de fase quantitativa. Ao seguir este protocolo, é importante não obstruir os reservatórios ao clampear o dispositivo enquanto o cimento acrílico seca. A obstrução dos orifícios retém o ar entre o MY-133-V-2000 e o substrato.

Isso causará vazamentos no canal durante o fluxo. O uso do MY-133-V-2000 como material de fabricação para dispositivos microfluídicos oferece uma vantagem distinta sobre os materiais tradicionais, reduzindo bastante os artefatos próximos às paredes dos microcanais. Isso permite que medições quantitativas sejam feitas nas proximidades de estruturas de microcanais.

Os dispositivos fabricados com este protocolo são compatíveis com qualquer técnica de microscopia comumente usada. Este protocolo é baseado em patologia celular, por isso é compatível com outras técnicas microfluídicas avançadas, como classificadores de células ou geradores de gradiente para estudar o comportamento celular. No geral, essa técnica fornece aos pesquisadores uma nova ferramenta para ensaios microfluídicos biomédicos baseados em microscopia.

A precisão extra que concede às medições quantitativas em microcanais tem aplicações importantes em muitos campos, incluindo descoberta de medicamentos e análise de célula única.