Name: TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda o protocolo tChIP-Seq para analisar modificações de histonas específicas de tipos celulares em neurônios de camundongo. Este método permite isolar cromatina de células-alvo e explorar a regulação epigenética com precisão.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a todos os membros do laboratório Iwasaki para leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte por um subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (26113005 # S.N. e JP17H05679 o S.I.); um subsídio para jovens cientistas (A) (JP17H04998 o S.I.) do Ministério da educação, ciência, esportes e cultura do Japão (MEXT); e as pioneiras projetos "Evolução celular" e todo projeto RIKEN "Doença e Epigenoma" de RIKEN (para S.N. e S.I.).

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pela divisão de segurança da RIKEN (H27-EP071) e conduzidos com normas e diretrizes relevantes.
1. dissecção de tecidos
<ol><li>Dissecar os tecidos de interesse em pedaços pequenos (aproximadamente < 3 mm2) com uma tesoura de primavera. Nota: Fragmentos de tecido maiores demoram mais para congelar, e pedaços menores vão transitar por maiores volumes de tampão, ambos os quais podem afetar os resultados.</li>
	<li>Adicionar os fragmentos de tecido dissecado para um recipiente limpo com nitrogênio líquido e recolhê-los em tubos de 2 mL (1 parte por tubo) preenchido com nitrogênio líquido. Nota: Os tubos com uma superfície hidrofílica são recomendados para esta etapa.</li>
	<li>Coloque os tubos a-80 ° C para > 5 minutos com a tampa aberta para evaporar o nitrogênio líquido restante. Nota: Depois de fechar a tampa, fragmentos de tecido podem ser armazenados a-80 ° C durante um mês antes do uso.</li>
</ol>2. fixação da pilha
Nota: Usamos um moedor criogênico útil para esta etapa. Um aparelho alternativo pode ser usado.
<ol><li>Tubos de ligação de baixo lugar a 2 mL-proteínas contendo as amostras de tecido em uma cremalheira do metal gelo refrigerados em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Coloque uma bala de metal em um 1,5 mL-tubo e resfriado com nitrogênio líquido. Coloque-o na prateleira do gelo de metal.</li>
	<li>Abra o tubo 2 mL e coloque a bala de metal prechilled para dentro do tubo. Feche a tampa, definir os 2 mL-os tubos no suporte do tubo de um moedor criogênico útil e mergulhe imediatamente o titular tubo montado em nitrogênio líquido por 1 min.</li>
	<li>Encaixe o suporte de tubo congelado a gaveta exterior do moinho criogênico útil e agitar vigorosamente 60 vezes por 30 s.</li>
	<li>Desmontar o suporte de tubo, remover a bala de metal e coloque o 2 mL-o tubo numa amostra refrigerador prechilled a-20 ° C.</li>
	<li>Coloca a amostra mais frio a-20 º C por 15 min evitar o congelamento do fixador na próxima etapa.</li>
	<li>Levar a amostra mais fresca para o banco, abrir a tampa do tubo e imediatamente gotejamento 900 µ l de formol 1% disso. Após várias vezes de pipetagem, transferir a suspensão nova 2 mL-tubo contendo 900 µ l de formol 1% e correção para 10 min com suave rotação na incubadora, situado a 23 ° C. Atenção: O formaldeído é tóxico e prejudicial.</li>
	<li>Para parar a reação de fixação, adicionar 100 µ l de glicina de 2,5 M a cada tubo e centrifugar por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de gelado fosfato salino (PBS), centrifugar por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes (3 lavagens no total). Nota: Amostras fixas podem ser congelado por nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l do Lysis Buffer 1 (ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic de 50mm 4 (HEPES)-KOH (pH 7,5), 140 mM de NaCl, 1 mM etilenodiaminotetracético ácido (EDTA) (pH 8.0), 10% w/v glicerol, 0,5% w/v NP-40, inibidor de protease 0,25% w/v Triton x X-100 e 0.1 coquetel) ao pellet, pipetar várias vezes e gire por 10 min a 4 ° C. Nota: Lise 1 deve ser filtrado e armazenado a 4 ° C antes do uso.</li>
	<li>Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de Lysis Buffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM de NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA e 0.1 x coquetel de inibidor de protease) ao pellet, vórtice e gire por 10 min a 4 ° C. Nota: Lise 2 deve ser filtrado e armazenado a 4 ° C antes do uso.</li>
	<li>Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 800 µ l de buffer de ensaio (RIPA) radioimmunoprecipitation com inibidor de protease 1x cocktail ao pellet e resuspenda o pellet pipetando.</li>
	<li>Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 500 µ l de buffer RIPA com 1 x inibidor da protease cocktail.</li>
	<li>Centrifugue por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão RIPA com 1 x inibidor da protease cocktail. Imediatamente, prossiga para a próxima etapa.</li>
</ol>3. cromatina tosquia
<ol><li>Transfira o lisado para um tubo de sonicador e em seguida, coloque o tubo em um ultrasonicator.</li>
	<li>A cromatina de cisalhamento com as seguintes configurações: temperatura: 4 ° C; pico de potência incidente: 175 W; factor de serviço: 10%; ciclos/explosão: 200; e tempo: 2.400 s.</li>
	<li>Transferir a amostra para um 1,5 mL-proteína baixa ligação tubo e centrifugar durante 5 min à 20.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Recolha o sobrenadante para um tubo de ligação de baixa proteína nova. Nota: A amostra pode ser congelado em nitrogênio líquido e armazenada a-80 ° C.</li>
</ol>4. seleção de qualidade do DNA (reticulação reversa)
<ol><li>Mix 20 µ l do lisado e 180 µ l de tampão de eluição do ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM de NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) e 1% w/v Dodecil sulfato de sódio (SDS)) em um tubo de reação em cadeia (PCR) de polimerase. Incube a amostra a 65 ° C em um termociclador para 6 h com a tampa do termociclador aberta. Mantenha a tampa do termociclador aberta para evitar excesso de desnaturação. Nota: O tampão de eluição de ChIP deve ser filtrado e armazenado à temperatura ambiente antes do uso. Esta incubação pode ser estendida para a noite.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de 10 mg/mL RNase A, vórtice e incubar a 37 ° C por 30 min.</li>
	<li>Adicione 6,5 µ l de 15 mg/mL proteinase K, vortex e incubar a 55 ° C por 60 min.</li>
	<li>A reação de um tubo de ligação baixa de DNA de transferência, adicione 4 µ l de glicogênio de 5 mg/mL e o vórtice. Em seguida, adicione 200 µ l de álcool isoamílico/fenol/clorofórmio (25:24:1) e centrifugar por 5 min a 18.000 x g, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante para um novo tubo de ligação baixa de DNA. Adicionar 200 µ l de tampão Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) e 200 mM NaCl) para a solução de fenol/clorofórmio/isoamílico álcool restante e centrifugar durante 5 min à 18.000 x g, à temperatura ambiente. Recolher o sobrenadante e misture com o sobrenadante primeiro.</li>
	<li>Adicionar 900 µ l de etanol gelado e incubar durante 1 h a-20 ° C. Nota: Esta incubação pode ser estendida para 4 - 6 h.</li>
	<li>Centrífuga para 30 min a 18.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante. Adicionar 1 mL de etanol gelado de 75% para a pelota e centrifugar durante 30 min a 18.000 x g a 4 ° C. Repita este passo (duas lavagens no total).</li>
	<li>Descartar o sobrenadante cuidadosamente e deixe secar naturalmente por 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de tampão Tris-EDTA (TE) e dissolver o DNA pela incubação à temperatura ambiente por 30 min ou a 4 ° C durante a noite. Evite a utilização do Vortex ou pipetagem. Manter este DNA como "entrada" e usá-lo para a preparação de biblioteca, se necessário.</li>
	<li>Medir a concentração de DNA com um dados de acordo com as instruções do fabricante (ver tabela de materiais) e verificar a distribuição de tamanho com uma máquina de electroforese microfluidic (ver dados representativos, mostrados na figura de 2a). uso 10 ng ou menos DNA para este ensaio. Nota: Fragmentos de 100 – 500 pares de bases (bp) a ter 50% ou mais do DNA.</li>
</ol>5. purificação de afinidade pelo anticorpo anti-FLAG
Nota: Para o neurônio tChIP-Seq, tecidos cerebrais de 8 ratos são normalmente usados para obter um exemplo de tChIP-Seq para preparar 2 ng de DNA purificado pela purificação imunológico em tandem (ver passo 7.1). Em nossas mãos, 0,1 ng de DNA ainda fornecida bibliotecas de DNA de alta qualidade para ChIP-Seq (Janaina, não publicada). Assim, em teoria, um único rato pode ser suficiente para executar o neurônio tChIP-Seq A quantidade necessária deve ser otimizada para o tipo de tecidos e células de interesse. Para o controle negativo da experiência imumuno-purificação, tecido cerebral lisado de ratos sem qualquer expressão de H2B-bandeira deve ser preparado e usado.
<ol><li>Pipete 200 µ l dos grânulos magnéticos conjugada com ovelhas anti-rato a imunoglobulina G (IgG) em um tubo de ligação de baixa proteína.</li>
	<li>Coloque o tubo sobre um suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS gelado e o vórtice. Repita este passo (duas lavagens no total).</li>
	<li>Adicionar 20 µ l de anticorpo antibandeira de 1 mg/mL e girar para 5 h a 4 ° C. Nota: Esta incubação pode ser estendida para a noite.</li>
	<li>Lave os grânulos seguindo passo 5.2. Coloque as contas em um tubo de 15 mL.</li>
	<li>Resuspenda os grânulos em 1110 µ l de tampão RIPA e em seguida, adicionar 900 µ l de 10x bloqueando reagente, 180 µ l de solução do Denhardt de 50x, 10 µ l de 100 x coquetel de inibidor de protease e 6,8 mL do lisado preparado no passo 3. Dividi essa mistura em 5 tubos de ligação de baixa proteína. Girar para 6 h a 4 ° C. Nota: Esta incubação pode ser estendida para a noite.</li>
	<li>Coloque o tubo sobre o suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de tampão RIPA e misture suavemente. Repita este passo 5 vezes (6 lavagens no total). Todas as contas do pool em um tubo de ligação de baixa proteína única.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de tampão de eluição de ChIP e rodar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Verifica a qualidade do DNA, conforme descrito na etapa 4.11 (ver dados representativos, mostrados na Figura 2B e C). Imediatamente, prossiga para a próxima etapa.</li>
</ol>6. afinidade purificação por anticorpo Anti-H3K4me3 e reticulação reversa
Nota: A seguinte do grânulo preparação que etapas (6,1-6,4) devem ser executadas antes passo 5.7.
<ol><li>Pipete 40 µ l de grânulos magnéticos conjugada com anti-rato ovelhas IgG em um tubo de 2 mL-emperramento da proteína baixa.</li>
	<li>Coloque o tubo sobre o suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS gelado e misture suavemente. Repita este passo (duas lavagens no total).</li>
	<li>Adicione 4 µ l de anticorpo anti-H3K4me3 de 1 mg/mL e girar para 6 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lave os grânulos 6.2 passo a seguir. Coloque as contas em um tubo de ligação de baixa 2 mL-proteína.</li>
	<li>Resuspenda as contas em 1558 µ l de tampão RIPA e adicione 200 µ l de 10x bloqueando reagente, 40 µ l de solução do Denhardt de 50x, 2 µ l de 100 x coquetel de inibidor de protease e 200 µ l do eluato preparado no passo 5.7. Rodar a noite a 4 ° C. Nota: O SDS em tampão de eluição do ChIP foi diluído 10 vezes mais nesta incubação.</li>
	<li>Coloque o tubo sobre o suporte magnético e esperar 1 min para o sobrenadante se tornar clara. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 mL de tampão RIPA e misture suavemente. Repita essa etapa 4 vezes (5 lavagens no total). Após a última lavagem, transferir as contas para um tubo de ligação baixa de DNA e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de tampão de eluição de ChIP e rodar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferi o eluato para um novo bindingTube baixa de DNA. Nota: O eluato pode ser armazenado a-80 ° C.</li>
	<li>Siga o passo 4 para decrosslinking do DNA. Resuspenda o DNA purificado em 20 µ l de tampão TE.</li>
	<li>Verifica a qualidade do DNA, conforme descrito na etapa 4.11 (ver dados representativos, mostrados na Figura 2D). (opcional) Realizar análise de enriquecimento por PCR quantitativo conforme descrito anteriormente,2. Dez vezes ou maior enriquecimento deve ser observado.</li>
</ol>7. Biblioteca construção
<ol><li>Para cada entrada e ChIP de DNA, calcule a proporção de DNA na região de 100-500-bp, usando a função de análise do esfregaço do software para a máquina de electroforese microfluidic. Estimar o volume de amostra necessário para obter 2 ng de 100-500 bp DNA. Use 20 ng DNA na faixa de 100-500-bp como o exemplo de "entrada".</li>
	<li>Pipetar amostras de DNA polimerase 8-faixa e adicione H2O para trazer o volume total de 10 µ l. (opcional) se o volume de DNA excede 10 µ l, aumentar proporcionalmente a seguinte reação final-reparação e a seleção de tamanho.</li>
	<li>Preparar mistura de mestre final-reparação (ver Tabela de materiais). Adicionar 4 µ l do mix mestre final-reparação do DNA e incube por 30 min a 20 ° C.</li>
	<li>Adicione 36 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 e 0,6 x volume (30 µ l) de sólido fase grânulos magnético reversível imobilização (SPRI) e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um tubo novo, adicione 1,2 x volumes (60 µ l) de grânulos magnéticos SPRI e incubar 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.</li>
	<li>Lave os grânulos duas vezes com 200 µ l de 80% EtOH, segurando o tubo ainda sobre o ímã.</li>
	<li>Brevemente, centrifugar o tubo para coletar o EtOH residual na parte inferior e colocá-lo de volta sobre o ímã. Remova o residual EtOH completamente.</li>
	<li>Deixe a tampa do tubo aberto para 1-2 min permitir que o EtOH evaporar.</li>
	<li>Feche a tampa e mantenha o tubo no gelo. Nota: Agora você obteve DNA tamanho selecionado de 100-500 bp sobre os grânulos. Mais detalhes sobre a seleção de tamanho duplo podem ser encontrados no site do fabricante (www.beckman.com).</li>
	<li>Preparar A-tailing mestre mistura (veja a Tabela de materiais).</li>
	<li>Resuspenda os grânulos (de passo 7.10) com 10 µ l de mistura de mestre A-tailing e incube por 30 minutos a 30 ° C.</li>
	<li>Adicionar 1,8 x volume (18 µ l) de polietileno glicol (PEG) / solução de NaCl e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Siga os passos 7,7-7.11 para purificar o DNA.</li>
	<li>Preparar a mistura de tampão de ligadura (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Pipetar 8 µ l de mistura de tampão da ligadura para os grânulos (de passo 7.14), adicione 1 µ l de 1 adaptador µM e ressuspender os grânulos. Use 1 µ l de adaptador de 5 µM para o exemplo de entrada. Considere o uso de adaptadores diferentes para cada amostra de multiplexação.</li>
	<li>Acrescente 1 µ l de DNA Ligase e incube por 15 min a 20 ° C.</li>
	<li>Adicionar 1,0 x volume (10 µ l) da solução de NaCl/PEG, resuspenda os grânulos e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Siga os passos 7,7-7.10 para purificar o DNA.</li>
	<li>Pipetar 25 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 no tubo e ressuspender os grânulos.</li>
	<li>Adicionar 1,0 x volume (25 µ l) de solução de NaCl/PEG e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Siga os passos 7,7-7.10 para purificar o DNA.</li>
	<li>Pipete 11 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 no tubo e ressuspender os grânulos.</li>
	<li>Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.</li>
	<li>Recolha o sobrenadante para um tubo de PCR 8-faixa novo.</li>
	<li>Preparar a mistura de mestre PCR em tempo real (ver materiais para obter detalhes).</li>
	<li>Pipete 8,5 µ l de mistura de mestre de PCR em tempo real em um prato PCR (qPCR) 384-bem quantitativa e adicionar 1,5 µ l do adaptador ligado DNA (da etapa 7.26).</li>
	<li>Pipete 10 µ l de cada padrão fluorescente em poços vazios.</li>
	<li>Realizar o PCR em tempo real com o seguinte programa: (98 ° C por 45 s) x 1 ciclo, (98 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s) x 20 ciclos, e (72 ° C por 60 s) x 1 ciclo.</li>
	<li>Determine o número de ciclos PCR necessária para atingir a intensidade de fluorescência da fluorescente padrão 2.</li>
	<li>Preparar o mestre PCR mistura (veja a Tabela de materiais).</li>
	<li>Pipetar 11,5 µ l do mix mestre PCR no DNA restante (da etapa 7.26) adaptador-ligados e realizar PCR conforme indicado no passo 7: 30h com os ciclos PCR determinados em 7.31 da etapa.</li>
	<li>Adicionar 1,0 x volume (20 µ l) de solução de NaCl/PEG e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Siga os passos 7,7-7.10 para purificar o DNA.</li>
	<li>Pipetar 20 µ l de 10mm Tris-Cl, pH 8,5 no tubo e ressuspender os grânulos.</li>
	<li>Coloque o tubo num suporte magnético e esperar até que o sobrenadante se torna claro.</li>
	<li>Recolha o sobrenadante para um tubo de ligação de baixa 1,5 mL-DNA novo.</li>
	<li>Verifica a qualidade da biblioteca conforme descrito na etapa 4.11 (ver dados representativos, mostrados na Figura 2E e F). Use 1 µ l de amostra de DNA da biblioteca. (opcional) Realizar análise de enriquecimento por qPCR conforme descrito anteriormente, 2. Dez vezes ou maior enriquecimento deve ser observado.</li>
</ol>8. sequenciamento
<ol><li>Sequenciar as bibliotecas em um sequenciador de próxima geração (ver dados representativos, mostrados na Figura 3). Nota: A profundidade de sequência suficiente para a análise de dados pode variar dependendo do tamanho do genoma do organismo3. Para o ser humano e rato, nós recomendamos a obtenção de pelo menos 20 milhões de único-extremidade leituras. De acordo com o rendimento de leituras, multiplexação pode ser rentável.</li>
</ol>

<ol><li>Mito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+survey+of+epigenetic+modifications+by+tandem+chromatin+immunoprecipitation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).</li>
<li>Kadota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+binding+landscape+in+jawless+fish+with+reference+to+Hox+cluster+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).</li>
<li>Jung, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sequencing+depth+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).</li>
<li>Becker, P. B., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+remodeling+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleosome remodeling and epigenetics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+library+preparation+for+next-generation+sequencing+analysis+of+genome-wide+epigenetic+and+transcriptional+landscapes+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Hornstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-free+ribosome+profiling+of+cell+type-specific+translation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain.</a> Genome Biology. 17 (1), 149(2016).</li>
<li>Zhao, Y., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+catalog+of+currently+documented+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive catalog of currently documented histone modifications.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Nosso protocolo foi otimizado para os neurônios do cérebro do rato, em que a expressão da bandeira-tag H2B é induzida pela injeção de tamoxifeno. Promotores utilizados para H2B expressão, matérias-primas tecido e a quantidade dos tecidos são parâmetros cruciais para sucesso tChIP-Seq Assim, a otimização desses fatores deve ser considerada para cada tipo de célula de interesse.
Um passo crítico entre os procedimentos utilizados neste protocolo é o DNA de tosquia para atingir um comprimento de c...

Tecidos de animais consistem em tipos de células diferentes. A regulação dos genes em cada célula define o tipo de célula. Modificações da cromatina - DNA metilação e histona modificação - fundamentam a especificidade do tipo de célula da expressão do gene. Assim, a medição do Regulamento epigenética em cada tipo de célula tem sido desejada, mas tem sido um desafio técnico.
Para investigar a epigenética em um tipo específico de célula, sequenciamento de imunoprecipitação da cromatina em tandem (tChIP-Seq) foi recentemente desenvolvido (Figura 1)1. Em tChIP, proteína de núcleo com tag epítopo histona H2B é expressa de um promotor de célula tipo-específico. Este recurso permite o isolamento de chromatins partir de células de interesse, embora o material começa a partir de uma mistura de vários tipos de células. ChIP-Seq seguir — purificação da cromatina, através de um modificado-histona marca e geração de sequenciamento profundo de isolado DNA — pode monitorar o status epigenético o tipo de células alvo de forma todo o genoma.
Usando esta técnica, investigamos recentemente neurônio específico trimethylation de histona H3 proteína em lisina (H3K4me3) de 4 marcas. Nesse estudo, nós desenvolvemos um rato bate-no qual C-terminal bandeira-tag H2B proteína foi expressa sobre recombinação mediada por Cre (Rosa26Floxed-pA CAG H2B-bandeira). Por cruzamento com um rato, possuindo o Cre-endoplasmic gene endoplasmático (ER) sob o controle do promotor CamK2a, a linha obtidos rato induzido H2B-bandeira nos neurônios ativos sobre tamoxifeno injeção (Camk2aH2B-bandeira)1. A partir do cérebro da linha estabelecida rato, realizamos tChIP-Seq com anticorpo anti-H3K4me3. Desde que H3K4me3 marcas muitas vezes correspondem a regiões do promotor, poderia descobrir centenas de mRNAs especificamente expressados em neurônios1.
Aqui, descrevemos um método típico tChIP-Seq que cobre as etapas de dissecção de tecidos para a construção da biblioteca (Figura 1). O objetivo final do presente protocolo é compartilhar nossas melhores práticas para o desempenho de tChIP-Seq e a aplicação futura deste método para outros tipos de células e modificações do histone.

<table><tbody><tr><td>Tubo LoBind de proteína, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108132</td> Para tubo de proteína LoBind de <td>lise celular</td></tr><tr><td>, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108116</td><td>Para ChIP e preparação de biblioteca</td></tr><tr><td>Tubo de DNA LoBind, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108051</td><td>Para ChIP e preparação</td></tr><tr><td>de biblioteca Tubo de PCR de 8 tiras</td><td>BIO-BIK</td><td>3247-00</td><td>Para ChIP e preparação de biblioteca</td></tr><tr><td>SK Mill</td><td>TOKKEN</td><td>SK-200</td><td>Moedor criogênico prático para fazer pó de célula para fixação</td></tr><tr><td>Bala de metal</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-DLC10</td><td>Acessório do SK Mill</td></tr><tr><td>Tubo de aço inoxidável de 2 mL</td><td>TOKKEN</td><td>TK-AM5-SUS</td><td>Uma opção para célula suporte</td></tr> de <tr><td>tubo de lise 2 mL em aço inoxidável</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-TL</td><td>Uma opção para lise celular</td></tr><tr><td>16% formaldeído (p/v), sem metanol</td><td>Pierce</td><td>28906</td><td>Para fixar células. Prepare a solução a 1% antes de usar.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-35</td><td>Prepare o estoque de 2,5 M</td></tr><tr><td>D-PBS (-)(1x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>Para lavar lisado e DNA purificado</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02443-05</td><td>Para tampão de lise 1. Prepare 1 M, caldo de pH 7,5.</td></tr><tr><td>5 M NaCl, grau de biologia molecular</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06900-14</td><td>Para tampão de lise 1, tampão de lise 2, tampão de eluição ChIP e tampão Tris-EDTA-NaCl</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, grau de biologia molecular</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>311-90075</td><td>Para tampão de lise 1, tampão de lise 2, tampão de eluição ChIP e tampão Tris-EDTA-NaCl</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>072-04945</td><td>Para tampão de lise 1</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25223-75</td><td>Para tampão de lise 1</td></tr><tr><td>Triton X-100, grau de biologia molecular</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-32</td><td>Para tampão de lise 1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-91</td><td>Para tampão de lise 2, tampão de eluição ChIP e tampão Tris-EDTA-NaCl. Prepare 1 M, caldo de pH 8,0.</td></tr><tr><td>0,1 M EGTA pH neutro</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08947-35</td><td>Para tampão de lise 2</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de protease (100x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25955-24</td><td>Para bloquear a degradação do</td></tr><tr><td>tampão de proteína RIPA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>Para lise celular e</td></tr><tr><td>lavagem milliTUBE 1 mL AFA Fiber</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td>Sonicator tube. Acessório do ultrassônico focalizado</td></tr><tr><td></td><td>Covaris</td><td>S220 ou E220</td><td>Para digerir o DNA em tamanho adequado para ChIP-Seq</td></tr><tr><td>UltraPure 10% SDS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15553-027</td><td>Para Tampão de eluição ChIP</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30141-14</td><td>Para purificar o DNA do lisado</td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinante, PCR Grau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115887001</td><td>Para purificar o DNA do etanol lisado</td></tr><tr><td></td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>054-07225</td><td>Faça 70% de solução</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal anti-FLAG M2 produzido em camundongo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Para purificar a cromatina expressa em células de interesse</td></tr><tr><td>Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11201D</td><td>Isso pode ser usado para anti-FLAG IP e anti-H3K4me3 IP</td></tr><tr><td>Anti-tri-metil histona H3 (K4), anticorpo monoclonal de camundongo</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>301-34811</td><td>Qualquer outro anticorpo que funcione para análise ChIP funcionará</td></tr><tr><td>10x Reagente de bloqueio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Para bloqueio durante a purificação de afinidade</td></tr><tr><td>Denhardt' s solução</td><td>Nacalai Tesque</td><td>10727-74</td><td>Para bloqueio durante a purificação de afinidade</td></tr><tr><td>Glicogênio (5 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td>Para purificar o DNA do lisado</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>Para quantificação de DNA isolado</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>Para quantificação de DNA isolado</td></tr><tr><td>Tubo de 0,5 mL</td><td>Axygen</td><td>10011-830</td><td>Para quantificação por Qubit</td></tr><tr><td>Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25970-56</td><td>Para purificar o DNA do lisado</td></tr><tr><td>AMPure XP grânulos</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>SPRI magnéticos para preparação de biblioteca</td></tr><tr><td>Rack de gelo de metal</td><td>Funakoshi</td><td>IR-1</td><td>Para manter o lisado celular congelado</td></tr><tr><td>Resfriador</td><td>de amostras New England Biolabs</td><td>T7771S</td><td>Ajuda a consertar células com danos mínimos</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>Para verificar a qualidade de fragmentos de DNA isolados. Outro analisador de fragmentos pode ser usado.</td></tr><tr><td>Software Especialista Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946CA</td><td>Fornecido com o</td></tr><tr><td>Kit de DNA de Alta Sensibilidade</td> Bioanalyzer <td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Para verificar a qualidade dos fragmentos de DNA isolados</td></tr><tr><td>KAPA LTP Library Preparation Kit</td><td>Roche</td><td>07961898001</td><td>Fornecido com 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase e solução PEG/NaCl</td></tr><tr><td>NEXTflex DNA Barcodes</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-514101</td><td>Adapter para preparação de bibliotecas. Fornecido com adaptadores de código de barras de DNA e mistura de primer.</td></tr><tr><td>Kit de amplificação de biblioteca em tempo real KAPA</td><td>Roche</td><td>07959028001</td><td>Fornecido com 2x KAPA HiFi HS PCR em tempo real Master Mix, PCR Primer Mix e padrões fluorescentes</td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Roche</td><td>KM2602</td><td>Para preparação de biblioteca. Além disso, esta enzima pode ser necessária para o KAPA Real-Time Library Amplification Kit</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8,5 para eluição de placa</td></tr><tr><td>qPCR de DNA de 386 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>Para PCR em tempo real</td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485701</td><td>Para quantificar o DNA</td></tr><tr><td>MicroAmp Filme Adesivo Óptico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Para PCR em tempo real</td></tr><tr><td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td>Para vedação de placas</td></tr><tr><td>Mistura</td><td></td><td></td> mestre de reparo final <td>Combine 1.4 &micro; L de 10x KAPA End Repair Buffer, 1 &micro; L de KAPA End Repair Enzyme Mix e 1,6 &micro; L de H2O</td></tr><tr><td>Master mix</td><td></td><td></td> A-taling <td>Combine 1 &micro; L de tampão de cauda A KAPA, 0,6 &micro; L da enzima KAPA A-tailing e 8,4 &micro; L de H2O</td></tr><tr>Mistura <td></td><td></td><td>de tampão de ligação</td><td>Combine 2 &micro; L de tampão de ligadura KAPA e 6 &micro; L de H2O</td></tr><tr>Mistura <td></td><td></td><td>mestre de PCR em tempo real</td><td>Combine 5 &micro; L de 2x KAPA HiFi HS PCR Master Mix em tempo real, 0,35 &micro; L de Primer PCR Mix (10 &micro; M cada um dos primers diretos AATGATACGGCGACCACCGAG e primer reverso CAAGCAGAAGACGGCATACGAG) e 3,15 &micro; L de mistura</td>mestra</tr><tr><td></td><td></td><td></td> de PCR H2O <td>Combine 10 &micro; L de 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 &micro; L de PCR Primer Mix e 0,6 &micro; L de H2O</td></tr><tr><td>Integrative Genomics Viewer</td><td>Broad Institute</td><td>IGV_2.3.88</td><td>Navegador do genoma para visualizar dados de sequenciamento</td></tr><tr><td>DNA olgionucleotídeo: 5&prime;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>Um primer para amplificar a região promotora do</td></tr><tr><td>olgionucleotídeo do DNA GAPDH: 5&prime;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>Um primer para amplificar a região promotora de GAPDH</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara</td><td>RR420L</td><td>Para quantificar o DNA correspondente à região promotora de GADPH</td></tr><tr><td>Thermal Cycler Dice</td><td>Takara</td><td>TP870</td><td>Para quantificar o DNA correspondente à região promotora de GADPH</td></tr></tbody></table>

tchip-seq: epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenético regulamento tem um papel central na expressão gênica. Desde que a modificação do histone foi descoberta na década de 1960, suas funções fisiológicas e patológicas têm sido muito estudadas. Com efeito, o advento da próxima geração sequenciamento profundo e imunoprecipitação da cromatina (ChIP) através de anticorpos de modificação de histona específico tem revolucionado o nosso ponto de vista do Regulamento epigenético através do genoma. Por outro lado, tecidos tipicamente consistem em tipos de diversas células, e sua mistura complexa coloca desafios analíticos para investigar a Epigenoma em um tipo específico de célula. Para resolver o estado de cromatina de tipo específico de célula em uma forma de todo o genoma, desenvolvemos recentemente em tandem da cromatina imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq), que se baseia a purificação seletiva da cromatina de proteínas de histona marcados do núcleo da célula tipos de interesse, seguido de ChIP-Seq O objetivo do presente protocolo é a introdução de melhores práticas de tChIP-Seq Esta técnica fornece uma ferramenta versátil para a investigação de tecido-específica Epigenoma em modificações do histone diversificada e organismos modelo.

Aqui, descrevemos a dissecção de tecidos, fixação, lysis da pilha, purificação em tandem da cromatina e preparação de biblioteca de DNA por sequenciadores de última geração. Durante os procedimentos, pode-se testar a qualidade do DNA, que é a chave para o sequenciamento de sucesso, em várias etapas (Figura 2). Desde uma única nucleossoma é tipicamente rodeada por 147 bp DNA 4, DNA cortado não deve ser inferior esse tamanho. Imediatamen...

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da epigenética, como a quantidade de modificações cromáticas que são reguladas de forma específica do tipo celular, juntamente com genomas. A principal vantagem desta técnica é que podemos isolar a cromatina das células-alvo e, em seguida, seguir cigano típico rio abaixo. Assim, este método pode fornecer insights sobre trimincil específico de neurônio, lysinc 4, opisoncilly.Também pode ser aplicado a outras modificações de histona, outros tipos de células e, em seguida, outros organismos modelo. Demonstrando o procedimento será Mari Mito, técnica do meu laboratório. Para começar, use uma tesoura de mola fina para dissecar o tecido de interesse em pequenos pedaços.Adicione os fragmentos de tecido a um recipiente limpo cheio de nitrogênio líquido. Em seguida, transfira os fragmentos de tecido para dois tubos mililitros cheios de nitrogênio líquido. Armazene os tubos a menos 80 graus Celsius por cinco minutos com a tampa aberta para evaporar o nitrogênio líquido.Coloque os tubos contendo as amostras de tecido em um bloco de gelo de metal refrigerado. Em seguida, coloque uma bala de metal em um tubo de 1,5 mililitro e esfrie-a com nitrogênio líquido. Coloque a bala de metal gelada em um dos tubos de amostra.Feche a tampa e coloque o tubo no suporte do tubo de um moedor criogênico. Imediatamente, mergulhe o suporte do tubo montado em nitrogênio líquido por um minuto. Insira o suporte do tubo congelado no externo do moedor criogênico.E agite vigorosamente por 30 segundos, 60 vezes. Depois disso, desmonte o moedor criogênico, remova a bala de metal. E coloque o tubo em um refrigerador de amostra pré-refrigerado.Armazene o refrigerador a 20 graus Celsius negativos por 15 minutos. Em seguida, adicione 900 microliters de 1%de formaldeído ao tubo e pipeta para misturar. Transfira a suspensão para um novo tubo de dois mililitros com 900 microliters de 1%de formaldeído.Em seguida, fixe a suspensão por 10 minutos com rotação suave a 23 graus Celsius. Para parar a reação de fixação, adicione 100 microlitadores de 2,5 molares de glicina molar ao tubo. E centrífuga a 3.000 vezes gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius.Depois disso, descarte o supernatante. Adicione um mililitro de PBS ao tubo e vórtice para misturar. Centrífuga a 3.000 vezes gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius.Repita este passo de lavagem, mais duas vezes. Em seguida, adicione 500 microliters de tampão de lise um à pelota e pipeta para misturar. Centrifugar o tubo por cinco minutos a 3.000 vezes a gravidade a quatro graus Celsius e descartar o supernante.Adicione um mililitro de tampão de lise dois à pelota e vórtice para misturar. Em seguida, centrifugar a suspensão por cinco minutos a 3.000 vezes gravidade a quatro graus Celsius e descartar o supernaspe. Depois disso, adicione 800 microliters de tampão de ensaio de imunoprecipitação de rádio com coquetel inibidor de protease à pelota e pipeta para misturar.Centrifugar a suspensão por cinco minutos a 3.000 vezes gravidade a quatro graus Celsius e descartar o supernante. Em seguida, adicione 500 microliters de tampão RIPA com coquetel inibidor de protease à pelota. Em seguida, centrifugar a suspensão por cinco minutos a 3.000 vezes gravidade a quatro graus Celsius e descartar o supernaspe.Adicione um mililitro de tampão RIPA com coquetel inibidor de protease. Imediatamente após adicionar tampão RIPA com coquetel inibidor de protease, transfira o lysate para um tubo sonicator. E coloque o tubo em um ultrassônico.Usando as configurações descritas no protocolo de texto, tesoura a cromatina. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de baixa ligação de proteína de 1,5 mililitro. E centrifuá-lo por cinco minutos a 20.000 vezes gravidade a quatro graus Celsius.Recolhe o supernasal da amostra e transfira-o para um novo tubo de baixa ligação proteica. Neste protocolo, foi introduzido e demonstrado o sequenciamento da imunoprecipitação de cromatina tandem. Durante o procedimento, a qualidade do DNA foi testada em várias etapas.Imediatamente após a sônicação, o DNA cortado foi isolado e testado com máquina de eletroforese microfluida. Depois de usar anticorpo anti-FLAG e anticorpo anti-H3K3me3 para realizar a purificação de afinidade, a qualidade do DNA foi verificada novamente. A especificidade da purificação imunológica do DNA em H2B-FLAG foi confirmada com amostras de controle negativos.Onde quantidades insignificantes de DNA foram detectadas. Mais adiante no protocolo, verificou-se a qualidade da biblioteca de sequenciamento. O chip e o T-ChIP bem sucedidos foram evidenciados através de análise de enriquecimento usando primers voltados para a região promotora do gene GAPDH.Foram obtidas redistribuições representativas ao longo de três genes neurônios. E o enriquecimento das leituras nas cinco extremidades primos dos genes pelo neurônio T-ChIP busca sobre todo o cérebro T-ChIP busca foi observado. Após uma estabilização, essa técnica abre caminho para pesquisadores do campo epigenético explorarem o tipo celular específico modificação de histona geral em neurônios em camundongos.Não se esqueça que trabalhar com formaldeído pode ser extremamente perigoso e tomar precauções como usar roupas de borracha e óculos deve ser sempre tomado durante a realização deste procedimento.

tchip-seq-cell-type-specific-epigenome-profiling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

Métodos para mapear interações proteína-DNA in vivo estão se tornando cruciais para todos os aspectos da pesquisa genômica, mas são trabalhosos, caros e demorados. Aqui, é apresentado um sistema robótico de manuseio de líquidos disponível comercialmente que automatiza a imunoprecipitação da cromatina para mapear interações proteína-DNA in vivo com quantidades limitadas de células.

Automatizando Experiments chip-seq para gerar perfis epigenéticos em 10.000 células HeLa

Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.

Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Este trabalho descreve um protocolo para a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) usando uma linha de células T de mouse maduras. Este protocolo é adequado para investigar a distribuição de marcas de histonas específicas em locais promotores específicos ou em todo o genoma.

Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) em linhas de células T de mouse

Apresentamos uma imunoprecipitação da cromatina nativa modificada sequenciamento (ChIP-seq) metodologia para a geração de conjuntos de dados sequência apropriadas para um quadro analítico de nucleossoma densidade ChIP-seq integrando acessibilidade nuclease micrococcal (MNase) com medidas de modificação de histona.

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Aqui, descrevemos os métodos para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq, incluindo preparação de biblioteca para o sequenciamento de última geração, para gerar epigenomic global e cromatina associada RNA mapas em pilhas do ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Este artigo descreve um protocolo chip-seq semiautomado e microescalado de regiões de DNA associadas a uma modificação de histona específica (H3K27ac) usando uma plataforma de manipulador de líquidos ChIP, seguido de preparação da biblioteca usando tagmentação. O procedimento inclui avaliação de controle para fins de qualidade e quantidade e pode ser adotado para outras modificações de histona ou fatores de transcrição.

Um procedimento de ChIP-Seq semiautônomo para estudos epigenéticos em larga escala

Este estudo apresenta um protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificação de barras espacial direta de uma seção de tecido com análise multioma de célula única. Essa abordagem permite o perfilamento espacialmente resolvido de uma única célula da expressão gênica e a modificação da histona H3K27ac simultaneamente, oferecendo insights mecanicistas sobre a regulação gênica no contexto da microanatomia tecidual.

Perfilamento Multiômico Integrado de Célula Única Espacialmente Resolvido do Transcriptoma e Alvos Epigenômicos em Seções de Tecido Congelado

Aprenda o protocolo tChIP-Seq para analisar modificações de histonas específicas de tipos celulares em neurônios de camundongo. Este método permite isolar cromatina de células-alvo e explorar a regulação epigenética com precisão.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Explorar mais vídeos