Name: Isolamento e Decellularization de um pâncreas todo porcino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda o método de dissecação e descelularização do pâncreas porcino intacto usando detergentes a frio. Esta técnica preserva a matriz extracelular para aplicações em engenharia de tecidos pancreáticos.

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Este estudo foi financiado por uma concessão do governo sueco LUA ALF para S.S.H.

A dissecação de um pâncreas de suínos e o procedimento de decellularization apresentado aqui seguir as diretrizes éticas da Universidade de Gotemburgo.
1. preparação de afinação Decellularization
<ol><li>Usando tubos de silicone 3 x 5 mm, ligar em série o recipiente de detergente da entrada para a bomba de peristalic e em seguida para o pâncreas no órgão câmara através do desgaseificador (ver Figura 1). Conecte um conector luer macho à extremidade livre do tubo na câmara de órgão.</li>
	<li>Com outro tubo de silicone de 3 x 5 mm, ligue a câmara de órgão o detergente tomada recipiente através da bomba peristáltica para coletar o detergente perfundido.</li>
	<li>Conecte as extremidades livres dos tubos em cointainer de tomada de contêiner e detergente detergente da entrada, uma pipeta de 2ml sem rótulo.</li>
	<li>Manter a afinação toda a 4 ° C.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figura 1: preparação de set-up a perfusão. Usando um tubo de silicone de 3 x 5 mm, conforme mostrado na configuração, ligar em série o recipiente de detergente da entrada para a bomba peristáltica, o desgaseificador e câmara de órgão. As setas pretas mostram a direção do fluxo do recipiente de detergente da entrada para a câmara de órgão. Para a tomada de detergente, use um outro tubo de silicone de 3 x 5 mm e conectar o órgão câmara através da bomba peristáltica para o recipiente de detergente da tomada. As setas vermelhas mostram a direção do fluxo da câmara do órgão para o recipiente de detergente da tomada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. preparação de soluções de Decellularization
<ol><li>Solução 1 (tampão fosfato salino [PBS]): adicionar 8 g de cloreto de sódio (137 mM), 0,2 g de cloreto de potássio (2.7 mM), 1,44 g de fosfato de sódio (10 mM) e 0,24 g de fosfato de potássio (1,8 mM) para 1 litro de água ultrapura e mexa até dissolver. Ajuste o pH para 7,4 com ácido clorídrico (HCl). No total, 3,2 L desta solução é necessária.</li>
	<li>Solução 2 (PBS + heparina): para 1 L de solução 1, adicionar 3,4 mL de heparina (17 unidades internacionais [IU] /mL). Preparar esta solução fresca e mantê-lo no gelo, até que ele se torna frio. No total, 1,2 L desta solução é necessária.</li>
	<li>Solução 3 (água ultrapura, azida de sódio + dissódico ácido etilenodiaminotetracético [EDTA]): para 1 L de água ultrapura, adicionar 1,86 g de EDTA (5 mM) e 200 mg de azida de sódio (0.02%). Mexa até que os sais são dissolvidos. Legal a solução a 4 ° C antes do uso. No total, 22 L desta solução é necessária.</li>
	<li>Solução 4 (PBS, azida de sódio + EDTA): para 1 L de solução 1, adicionar 200 mg de azida de sódio (0.02%) e 1,86 g de EDTA (5 mM). Mexa até que os sais são dissolvidos. Legal a solução a 4 ° C antes do uso. No total, 1 L dessa solução é necessária.</li>
	<li>Solução 5 (água ultrapura + azida de sódio): para 1 L de água ultrapura, adicionar 200 mg de azida de sódio (0.02%). Mexa até que os sais são dissolvidos. Legal a solução a 4 ° C antes do uso. No total, 260 L desta solução é necessária. Nota: O EDTA forma um precipitado com SDC e foi excluído da solução 5, uma vez que será usado para a lavagem imediata, antes e após o tratamento da SDC.</li>
	<li>Solução 6 (SDC + Triton X-100): A 940 mL de água ultrapura, adicionar 40 g (4%) SDC, 60 mL de (6%) Triton X-100, 200 mg de azida de sódio (0.02%) e 69,6 mg de fluoreto de phenylmethylsulfonyl (0,4 mM) (PMSF). Mexa até dissolver. Legal a solução a 4 ° C antes do uso. Adicione PMSF antes do uso. No total, 9,6 L desta solução é necessária.</li>
	<li>Solução 7 (DNase): Unidades adicionar 10.000 Kunitz de DNase-eu em 250 mL de PBS de Dulbecco (40 Kunitz unidades/mL) contendo CaCl2 e MgCl2. Prepare fresco e usá-lo imediatamente. Aquecer a solução a 37 ° C antes do uso.</li>
	<li>Solução 8 (PBS + sódio azida): para 1 L de solução 1, adicionar 200 mg de azida de sódio (0.02%). Mexa até que os sais são dissolvidos. Legal a solução a 4 ° C antes do uso. No total, 1 L dessa solução é necessária.</li>
</ol>3. dissecação do pâncreas dos suínos
Nota: Neste estudo, pancreases suínos foram dissecados de sacrificados, porcos feminino heparinizado (400 UI/kg), com 45 kg de peso de uma fazenda.
<ol><li>Coloque o porco na mesa de dissecação na posição supina.</li>
	<li>Faça uma incisão na linha média do processo de xiphoidal ao osso púbico (cerca de 40 cm) usando um bisturi, expondo todos os órgãos abdominais.</li>
	<li>Localize o esplênica, duodenal e lóbulos de conexão.</li>
	<li>Localize o nível da papila duodenal maior e ligate duodeno oralmente de que site usando duas suturas separadas.</li>
	<li>Ligate do esôfago inferior com dois fios de sutura separados e corte entre as ligaduras com uma tesoura para tirar o estômago.</li>
	<li>Separe o tecido conjuntivo do cólon para atingir o intestino delgado.</li>
	<li>Separe o tecido conjuntivo do cólon que atribui ao lobo esplênico do pâncreas.</li>
	<li>Remova o cólon do intestino após ligar as artérias.</li>
	<li>Encontrar a veia mesentérica inferior e a árvore da artéria mesentérica inferior e ligate com uma sutura onde aparecem caudalmente do pâncreas.</li>
	<li>Ligar a artéria esplênica e veia juntamente com uma sutura, perto do baço, em Hilo e distalmente cortar com uma tesoura para remover o baço.</li>
	<li>Siga o duodeno até os lóbulos duodenais e conexão estão desmarcados e ligam duodeno no final com duas suturas separadas.</li>
	<li>Dissecar a veia porta, ligam com uma sutura para evitar qualquer perda de sangue do fígado e cortar proximalmente a ligadura. A veia porta serve como uma saída durante a decellularization.</li>
	<li>Dissecar e ligar o ducto biliar e artéria hepática com dois fios de sutura. Corte distal para suturas.</li>
	<li>Encontrar a aorta sob a veia renal e dissecá-lo na direção cranial do músculo e do tecido conjuntivo, até atingir a área do pâncreas.</li>
	<li>Vire o pâncreas suavemente e dissecar a aorta, mantendo intacta, a SMA e o CT e cortar a aorta superior ao CT e inferiores à SMA com uma tesoura.</li>
	<li>Cortar o restante dos tecidos circundantes, com uma tesoura... e tirar o pâncreas.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de 50 mL, conectada à cânula de 4mm arteriotomia, irrigue os órgãos através da aorta com solução 2 até que ele perfuses o órgão inteiro ou o órgão inteiro se torna frio.</li>
</ol>4. preparação do pâncreas dos suínos para Decellularization
<ol><li>Manter o pâncreas a 4 ° C ou em gelo durante todo o processo.</li>
	<li>Cortar as suturas do duodeno usando a tesoura, limpá-lo de comida nivelando 50-150 mL de água ultrapura, usando uma pipeta de 25 mL e ligá-lo novamente com suturas.</li>
	<li>Ligar uma das extremidades da aorta e todas as filiais, além da SMA e CT com suturas para evitar fugas.</li>
	<li>Inserir, do outro lado da aorta, uma cânula de 4mm arteriotomia e ligá-lo com suturas.</li>
	<li>Perfundir o pâncreas com solução de 3 para 1 h a 20 mL/min usando a instalação do decellularization. Nota: Prefill os tubos da bomba com solução 3 tal que nenhuma bolha entra o pâncreas. Procure qualquer fugas de todos os lados do órgão e ligate todas abertos ramos vasculares com suturas, exceto a veia porta.</li>
	<li>Congele o pâncreas a-20 ° C em solução 4 até o início da decellularization.</li>
</ol>5. decellularization do pâncreas dos suínos
<ol><li>Descongelar o pâncreas a 4 ° C.</li>
	<li>Execute a bomba peristáltica na configuração decellularization com solução de 3 a 20 mL/min, até que nenhuma bolha de ar é vista no tubo de entrada de detergente.</li>
	<li>Coloque o pâncreas no recipiente decellularization e conecte o tubo de entrada de detergente para a aorta do pâncreas. Lavar o órgão por perfusão com solução 3 durante a noite a 20 mL/min a 4 ° C.</li>
	<li>Despeje a solução deixada na câmara de órgão.</li>
	<li>Substitua a solução 3 solução 5 e perfundir o pâncreas por 30 min em 20 mL/min a 4 ° C. Despeje a solução na câmara de órgão.</li>
	<li>Adicionar a solução 6 e perfundir o pâncreas para 8 h a 20 mL/min a 4 ° C. Despeje a solução na câmara de órgão.</li>
	<li>Lavar o órgão por perfusão com solução 5 para 96 h a 20 mL/min a 4 ° C. Despeje a solução na câmara de órgão.</li>
	<li>Preparar o pâncreas para tratamento de DNase recirculando 500ml de PBS de Dulbecco contendo CaCl2 e MgCl2 por 30 min a 37 ° C. Despeje a solução na câmara de órgão.</li>
	<li>Adicionar 250 mL de solução 7 e perfundir o pâncreas por 4 h a 20 mL/min a 37 ° C. Despeje a solução na câmara de órgão.</li>
	<li>Lavar o órgão por perfusão com solução 5 para 120 h a 20 mL/min a 4 ° C.</li>
	<li>Armazene o órgão em solução 8 a 4 ° C por curtos períodos ou a-20 ° C por longos períodos.</li>
</ol>6. verificação de Decellularization
<ol><li>Usando a tesoura, corte - a 10-3mm biópsias de todos os lóbulos do pâncreas e corrigi-los em formol para 48 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as peças em água ultrapura durante 15 min, processá-los em um processador de tecido seguindo protocolos padrão e incorporá-los em parafina.</li>
	<li>Corte 5 µm seções usando o micrótomo e manchá-las por hematoxilina e 0,2% alcoólica eosina Meyer (HE seguindo protocolos padrão).</li>
	<li>Ver os slides sob um microscópio para verificar se há perda de núcleos. Nota: Um pedaço de um tecido fresco processado da mesma forma pode ser usado como um controle para verificar a presença de núcleos.</li>
</ol>

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</ol>

S.S.H. detém ações da Verigraft, uma empresa que licenciou a tecnologia da engenharia de tecidos de vasos sanguíneos. Os outros autores não têm nada a divulgar.

O protocolo proposto, usando de perfusão de SDC e Triton X-100 a 4 ° C, será decellularize o pâncreas inteiro porcina com êxito. O desafio nesta técnica é a dissecação do pâncreas intacto contendo todos os três lóbulos sem danificar o parênquima e seus navios de fornecimento, bem como a ligadura dos outros ramos vasculares da amostra para perfundir o órgão sem fugas. O pâncreas suíno tem uma anatomia diferente em comparação com o pâncreas humano. Ele consiste de três lobos e fica em contato com o intestino delgado por em parte ao seu redor. Dissequei o duodeno juntamente com o pâncreas, como vários pequenos vasos sanguíneos do pâncreas conecta o intestino. Durante os estudos de otimização, corte brusco destas embarcações de sangue mostrou escapamento e uma perfusão incompleta de soluções.
Desde que a aorta se conecta ao pâncreas através das artérias mesentéricas superiores e celíacos, escolhemos a aorta como uma entrada para manter a perfusão simples usando apenas uma cânula e, portanto, uma entrada. Em nossa experiência, a ligadura da aorta acima o CT e abaixo o SMA diminuirá o tempo de dissecação e reduz o risco de danificar qualquer um dos dois navios. Além de um porco heparinizado, notamos também que uma perfusão de heparina frio através da aorta imediatamente após a dissecação ajuda a alcançar a perfusão de soluções em todo o órgão. Podemos especular se isso ocorrer, impedindo a formação de coágulos de sangue nos vasos sanguíneos. A perfusão inicial de um pâncreas com água ultrapura após a dissecação irá lisar células vermelhas do sangue e remover os vestígios de sangue no órgão, prevenindo a formação de coágulos de sangue. Este período também pode ser usado para encontrar qualquer unligated pequenos ramos de veias e artérias, como o fluxo de sangue pode ser facilmente notado acima do fundo.
Optamos por manter o procedimento inteiro decellularization em baixas temperaturas (4 ° C), como isso vai dificultar a ação das enzimas exócrinas que liberam de células exócrinas do pâncreas. As enzimas exócrinas, quando não inibida, podem causar um efeito deletério sobre as células e o ECM, como eles podem digerir as membranas celulares e proteínas12. Como congelar e descongelar efetivamente podem estourar as células, nós incluímos uma etapa de congelamento/descongelamento, inicialmente antes mesmo da perfusão de detergentes4,13. A lavagem inicial após a descongelação irá remover os restos de estouros de pilha. O detergente tratamento usamos é uma mistura de SDC e Triton X-100 em concentrações anormalmente elevadas e a uma velocidade de perfusão elevada. Optamos por esta abordagem para atingir mais rápido decellularization, removendo as células exócrinas que danificam o ECM. Podemos especular que um protocolo duro e rápido é benéfico para decellularization do pâncreas, como menos tempo estará disponível para as enzimas pancreáticas interagir com o ECM, preservando assim boas componentes de ECM. Para preservar os componentes do ECM, nós também adicionamos inibidor de protease de serina (PMSF) para as soluções de detergente, como isso vai inibir a ativação de enzimas liberado das células exócrinas14. Azida de sódio é adicionada a todas as soluções de decellularization, como ele atua como um agente bacteriostático, inibindo assim a chance de contaminação bacteriana15.
O pâncreas decellularized seguindo este protocolo mostrou uma preservação de estruturas ECM elastina e colágeno de proteínas de ECM. No entanto, observou-se uma perda significativa de glicosaminoglicanos no pâncreas decellularized. O pâncreas decellularized desta forma também mostrou a promessa para a fixação de células estaminais fetais no pâncreas e a expressão de marcadores endócrino e exócrinas em pedaços recellularized por 14 dias12. No entanto, para gerar uma pâncreas intacta e funcional, uma pesquisa mais adicional é exigida na avaliação de fontes de célula correta, tipos de células, estratégias de propagação celular e cultura de biorreator.

Diabetes mellitus é caracterizada pela presença de aumento dos níveis de glicose no sangue. É reconhecido como um desafio de saúde pública na maioria dos países1. Níveis elevados de glicose no sangue afetam os vasos sanguíneos e sistema nervoso, causando danos para os olhos, o coração e os rins e isquemia de extremidade. Os métodos tradicionais de tratamento incluem injeções de insulina exógena, drogas e mudanças de estilo de vida. Deixando de lado uma cura para a doença, em alguns casos, tratamentos disponíveis não conseguem manter a insulina em níveis terapêuticos, resultando em hiperglicemia. Embora o transplante de ilhotas ou pâncreas inteira elimina a doença, isso não é feito comumente por causa de uma escassez de órgãos de doador e os riscos e dificuldades de imunossupressão e encapsulamento2.
Melhorias atuais no campo da medicina regenerativa e engenharia de tecidos possuem a capacidade para fornecer uma solução para estas questões. Com a técnica de decellularization, o material celular de um doador humano ou animal pode ser removido enquanto as proteínas importantes da matriz extracelular (ECM), fatores de crescimento, e moléculas sinalizadoras são preservadas no cadafalso. Tais andaimes podem potencialmente ser transplantados sem a necessidade de imunossupressão, para restaurar a função do órgão após recellularization com a células-tronco não-imunogênico3,4 do próprio destinatário. Os órgãos de engenharia de tecidos de alogênico ou xenogénicas fontes podem ser usados em transplante clínico, como as proteínas da matriz extracelular principais são conservadas entre as espécies e não podem ser rejeitadas após transplante5.
Decellularization é um método bem explorado envolvendo o uso ideal de forças físicas, detergentes químicos e enzimas num ambiente fisiológico para remover o material nuclear e células de um tecido ou órgão. Recellularization é um procedimento de semeadura de células volta para o órgão acelular. É um procedimento intelectualmente difíceis, que exigem um grande número de células, uma melhor estratégia de célula-semeadura e um sistema de biorreator para a cultura do órgão em condições fisiologicamente aceitáveis, como temperatura, pressão e gases6.
O pâncreas pode ser considerado um tecido desafiador para a engenharia de tecidos por causa de suas capacidades exócrinas e endócrinas. O tecido exócrino secreta várias enzimas digestivas, enquanto que a parte endócrina segrega hormonas, incluindo a insulina. O decellularization de pancreases intactas de rato7,8, humano9e porco10 já foi relatado usando enzimas (tripsina, desoxirribonuclease [DNase]) e não-iônicos (Triton X-100) e detergentes iônicos ( de sódio Deoxycholate. do [SDC] e sulfato dodecyl de sódio [SDS]). No entanto, seguindo os protocolos publicados, lutamos com um bem sucedida dissecação e perfusão completa e decellularization, mantendo uma estrutura de ECM. Nós especulamos que os detergentes aplicados durante a decellularization causam a Lise das células, assim liberando enzimas digestivas para o órgão. As enzimas lançadas irão causar um dano irreversível para o cadafalso de ECM e torná-lo ineficiente para decellularization e recellularization. Um projeto do método que efetivamente decellularizes pâncreas ao inibir a ação de enzimas digestivas pode resolver o problema. Escolhemos a estratégia da Peloso et al, do decellularization do pâncreas em uma temperatura fria, embora eles não informaram sobre por que a temperatura fria é usado9. Ao mesmo tempo, desenhamos uma estratégia de dissecação com modificações de Taylor et al , escolhendo a aorta como uma entrada de perfusão ao longo do tronco celíaca (CT) e a artéria mesentérica superior (SMA)11.
Em um artigo recentemente publicado12, vamos demonstrar um método para o isolamento eficaz e decellularization do pâncreas de suínos, preservando alguns componentes de ECM. Neste trabalho, podemos mostrar uma descrição detalhada de como dissecar um pâncreas todo porcino contendo esplênica, duodenal e lóbulos de conexão e apresentar um protocolo gradual para decellularization bem sucedido.

<table><tbody><tr><td>Cânula de arteriotomia DLP de 4 mm</td><td>Medtronic</td><td>31104</td><td></td></tr><tr><td>2ml Pipeta não marcada</td><td>vWR</td><td>612-3720</td><td></td></tr><tr><td>Degasser</td><td>Biotech AB</td><td>0001-6484</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco com CaCl2 e MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico EDTA di-hidratado</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161. </td><td></td></tr><tr><td>OB Heparina</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Luer Macho com 1/8" ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>Para tubo de silício de 3X5mm</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Oina</td><td>SP-1X4</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Roche</td><td>10837091001</td><td>Instável em solução aquosa. Deve ser adicionado fresco antes da perfusão.</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>SDC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silício 3X5mm</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato de sódio</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td>V&ouml; mel</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 50mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046. De</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e decellularization de um pâncreas todo porcino

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Engenharia de tecidos do pâncreas inteiro pode melhorar os tratamentos atuais para diabetes mellitus. O objetivo final é pâncreas de engenheiro de tecido de uma origem xenogénica ou alogênico com células humanas. Uma demonstração de métodos para a dissecção eficiente, decellularization e recellularization do pâncreas de suínos pode beneficiar o campo. Semelhante à humanas pancreases, pancreases porcinos tem um arranjo anatômico especial com três lóbulos (esplênica, duodenal e conexão) arredondado pelo duodeno e intestino delgado. O lobo duodenal do pâncreas ligada ao duodeno por vários pequenos vasos sanguíneos. Engenharia de tecidos do pâncreas é complicada por causa de sua natureza endócrino e exócrina. Neste trabalho, mostramos um protocolo detalhado para dissecar o pâncreas inteiro suíno e decellularize-lo com detergentes, poupando sua estrutura e alguns componentes de matriz extracelular. Para alcançar a completa perfusão, a aorta é escolhida como entrada e a veia porta como saída. São ligados a outros vasos sanguíneos (artéria hepática, veia esplênica, artéria esplênica, árvore de artéria e veia mesentérica) e ducto biliar. Para evitar a formação de trombos, o porco é heparinizado e, imediatamente após a dissecação, o órgão é lavado com heparina fria. Para inibir a ação das enzimas exócrinas, o decellularization do pâncreas situa-se a 4 ° C. O decellularization é realizado por perfusão de Triton X-100 Deoxycholate do sódio e desoxirribonuclease, com uma lavagem extensiva intermitente e final. Com uma decellularization bem sucedida, o pâncreas aparece branco, e uma avaliação histológica com hematoxilina e eosina mostra uma ausência de núcleos com estrutura preservada da matriz extracelular. Assim, o método proposto pode ser usado para dissecar e decellularize pâncreas inteiro porcina com êxito.

Fotos de dissecação de pâncreas de suínos representativa, que podem ajudar a localizar e dissecando a artéria mesentérica inferior e veia a árvore, a veia porta, artéria hepática, ducto biliar e a aorta ramificando para CT e SMA, são mostradas na Figura 2A, 2Be 2C (amarelo flechas), respectivamente. A figura 3A mostra a morfologia bruta de um pâncreas normal, que aparece luz rosa e contém esplênica, conexão e lóbulos duodenais. Depois de decellularization, a cor rosa está perdida e decellularized pâncreas parece branco pálido na cor. O quadro de morfologia bruta mostrando esplênica, conexão e duodenais lóbulos de um pâncreas decellularized é mostrado na Figura 3B. A Figura 3 mostra a presença de muitos núcleos azuis em um pâncreas normal pela coloração com ele. Em um decellularized pâncreas, HE coloração mostrou uma perda de núcleos, como são vistos sem núcleos azuis (Figura 3D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2.jpg"> Figura 2: fotos de uma dissecação do pâncreas suíno. (A) localização da árvore inferior de artéria e veia mesentérica (seta amarela). (B) ligadura da veia porta, artéria hepática e ducto biliar (seta amarela). (C) Aorta ramificando-se para o tronco celíaca e artéria mesentérica superior (seta amarela). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig3.jpg"> Figura 3: bruta morfologia e ele mancha de pancreases normais e decellularized. (A) morfologia bruta de um pâncreas normal. (B) morfologia bruta de um pâncreas decellularized. Coloração (C), ele mostra a presença de núcleos azuis em um pâncreas normal. Coloração (D), ele mostra ausência de núcleos azuis em um pâncreas decellularized. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Engenharia de tecidos do pâncreas inteiro é um desafio por causa de suas funções endócrinas e exócrinas. Vamos mostrar um método para a dissecação de uma pâncreas de suínos intactas e o processo de decellularization bem sucedido por perfusão de detergentes Triton X-100 Deoxycholate do sódio e desoxirribonuclease.

Isolamento e Decellularization de um pâncreas todo porcino

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Este método pode ser usado para a dissecção de pâncreas suíno contendo conexão, lóbulos duodenais e esplênicos e eventual descelularização através da perfusão de detergentes a temperaturas frias. Embora este método de descelularização forneça uma visão do pâncreas suíno, ele também pode ser aplicado à pancreata de outros animais de grande porte. A principal vantagem dessa técnica é que facilita a recuperação intacta de um órgão complicado, como o pâncreas, para novas aplicações de engenharia de tecidos.Geralmente, indivíduos novos nesse método, eles vão lutar porque a dissecação do pâncreas intacto ao identificar e ligar todos os vasos sanguíneos circundantes requer muita prática para dominar. Antes de iniciar o procedimento, use um tubo de silicone de três por cinco milímetros para conectar o recipiente de detergente à bomba peristáltica e um segundo tubo de silicone de três por cinco milímetros para conectar a bomba peristáltica à câmara do órgão através do degasser. Conecte um Luer macho à extremidade livre do segundo tubo, e use um terceiro tubo de silicone de três por cinco milímetros para conectar a câmara de órgãos ao recipiente de coleta de detergente através da bomba peristáltica.Por fim, conecte uma pipeta sem rótulo de dois milímetros às extremidades livres dos tubos no recipiente de detergente e no recipiente de coleta de detergente. Em seguida, coloque a configuração de descelularização em quatro graus Celsius. Para colher o pâncreas, coloque uma heparinizada, 45 kg, uma porca feminina em uma mesa de dissecção na posição supina, e use um bisturi para fazer uma incisão de linha média de 40 centímetros do processo xiphoide até o osso púbico para expor os órgãos abdominais.Depois de identificar os lóbulos esplênicos, duodenais e de conexão, localize a papila duodenal principal e use duas suturas individuais para ligar oralmente o duodeno do local. Ligate o esôfago inferior com suturas adicionais, e corte entre as ligaduras com uma tesoura para facilitar a remoção do estômago. Separe os tecidos conjuntivos do cólon para alcançar o intestino delgado, e separe o tecido conjuntivo do cólon que se prende ao lobo esplênico do pâncreas.Intestinos delgados são ligados ao pâncreas por tecido conjuntivo no lobo esplênico, mas também circunda o pâncreas. Você tem que seguir cuidadosamente o caminho intestinal para desembaraçar e separar o tecido conjuntivo entre o intestino e o pâncreas. Depois de ligar as artérias, remova o cólon do intestino delgado.Identifique a veia mesentérica inferior, a árvore arterial mesentérica inferior, e liga os vasos com uma sutura caudal ao pâncreas e corte com tesoura. Ligate a artéria esplênica e a veia juntas no hilum, perto do baço, e corte distally com uma tesoura para remover o baço. Siga o duodeno até que os lobos duodenais e de conexão sejam limpos, e ligate o duodeno no final com duas suturas separadas.A parte do duodeno que está em contato próximo com a conexão e lóbulos duodenais é removida com o pâncreas, pois a ligadura de todos os pequenos vasos sanguíneos entre os dois órgãos é muito difícil. Depois de dissecar a veia do portal, ligar o vaso com uma sutura para evitar qualquer vazamento de sangue do fígado, e dissecar e ligar o ducto biliar e artéria hepática com duas suturas. Em seguida, corte a veia portal, artéria hepática e ducto biliar com uma tesoura.Localize a aorta sob a veia renal, e disseca a aorta na direção craniana do músculo e tecido conjuntivo até que o vaso atinja o pâncreas. Agora, vire suavemente o pâncreas e disseque a aorta, mantendo intacta a artéria mesentérica superior e o tronco celíaco. Corte a aorta cranial ao tronco celíaco, e disseque sem cortes o tecido circundante restante para permitir a colheita do pâncreas.Em seguida, use uma seringa de 50 mililitros conectada a uma cânula de arteriotomia de quatro milímetros para lavar o órgão através da aorta com solução dois até que todo o órgão seja perfundido ou até que todo o órgão esfrie. Coloque a solução com dois pâncreas perfumados em uma bandeja de metal no gelo, com a aorta virada para cima, e use uma tesoura para cortar as suturas do duodeno. Use uma pipeta de 25 mililitros para lavar o duodeno com 50 a 150 mililitros de água ultrapura, e religar o tecido com suturas frescas.Ligate uma extremidade da aorta e todos os ramos, excluindo a artéria mesentérica superior e o tronco celíaco, para evitar vazamentos, e insira uma cânula de arteriotomia de quatro milímetros na outra extremidade da aorta. Em seguida, coloque o pâncreas na câmara do órgão, e conecte a cânula no pâncreas a um Luer macho. Em seguida, perfumar o pâncreas com solução três por uma hora a 20 mililitros por minuto, e congelar o pâncreas de dupla perfumada a menos 20 graus Celsius na solução quatro até o início da descelularização.No dia da descelularização inicial, descongele o pâncreas a quatro graus Celsius, e coloque o pâncreas descongelado na câmara do órgão de descelularização. Conecte o tubo de entrada de detergente à aorta do pâncreas e lave o pâncreas com a solução três a 20 mililitros por minuto durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, decante qualquer solução restante na câmara de órgãos, e perfunde o pâncreas por 30 minutos a 20 mililitros por minuto na solução cinco a quatro graus Celsius.No final da solução cinco perfusão, perfusam o pâncreas por oito horas a 20 mililitros por minuto na solução seis e quatro graus Celsius, seguido por uma lavagem de 96 horas em solução fresca cinco a 20 mililitros por minuto e quatro graus Celsius. Substitua a lavagem por 500 mililitros de DPBS suplementados com cálcio e magnésio por 30 minutos a 37 graus Celsius, seguido de perfusão com 250 mililitros de solução sete por quatro horas a 20 mililitros por minuto e 37 graus Celsius. Em seguida, lave o órgão por mais 120 horas com solução fresca cinco a 20 mililitros por minuto e quatro graus Celsius, e armazene o órgão na solução oito.Aqui, pode ser observada a morfologia bruta de um pâncreas normal, que parece rosa claro e contém lóbulos esplênicos, conexões e lobos duodenais. Após a descelularização, a cor rosa é perdida, e o pâncreas processado aparece branco pálido na cor. Em um pâncreas normal, muitos núcleos azuis são aparentes pela coloração de H e E, enquanto em um pâncreas descelularizado os núcleos não podem mais ser visualizados, confirmando sua perda.O pâncreas suíno intacto isolado, seguindo este procedimento, permitirá uma completa perfusão e descelularização bem sucedida, preservando a estrutura e também permitindo a obtenção de algumas proteínas de matriz extracelular. O pâncreas descelularizado pode ser usado para o desenvolvimento de estratégias de recelularização de órgãos inteiros em sistemas bioreatores com tipos celulares relevantes. Após a recelularização com células-tronco receptoras, o pâncreas projetado por tecido pode ser usado para aplicações clínicas e testes medicamentosos.Não se esqueça que trabalhar com Triton X-100 e SDC pode ser extremamente perigoso e que precauções, como usar luvas e preparar as soluções sob capô de fumaça, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

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Bioengineering

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