Aprendizagem avançada stress medo, um modelo robusto de roedor do transtorno de estresse pós-traumático
13 de outubro de 2018
Aqui descrevemos a metodologia detalhada necessária para realizar experiências de aprendizagem (Autoprodutores) medo stress avançado, um modelo pré-clínicos de transtorno de estresse pós-traumático, em ratos e camundongos. O modelo utiliza aspectos do pavloviano medo condicionado e congelar-se como um índice do medo reforçado em roedores.
Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da neurociência comportamental, como como entender melhor os mecanismos biológicos subjacentes do TEPT. A principal vantagem dessa técnica é que ela é robusta, confiável, quantitativa, e pode ser realizada em várias espécies. Comece criando um conjunto de câmaras de condicionamento do medo para servir como contexto A, e um segundo conjunto de câmaras de condicionamento do medo para servir como contexto B.Coloque cada câmara de condicionamento do medo dentro de um cubículo atenuante de som para evitar a intrusão de ruído externo.
Em seguida, coloque os pisos da grade em cada câmara de condicionamento do medo para a entrega de choque de pé, usando um padrão de grade diferente para cada contexto para diferenciar a textura do piso entre os contextos. Em seguida, coloque as pastilhas triangulares de plexiglass preto no contexto B para diferenciar o layout interno dos dois contextos. Limpe as paredes e portas da câmara e pulverize as panelas sob os pisos da grade com uma solução de limpeza diluída.
Depois que o piso da rede for limpo, conecte um gerador de choque e um embaralhador capaz de fornecer um choque de amplitude de 1 miliamp ou menor em cada piso da grade para entrega de choque no pé. Por fim, use um multímetro para testar a corrente que está sendo fornecida pelo gerador de choque colocando cada sonda em uma barra diferente do piso da grade, e confirmando que a amplitude de choque desejada é produzida. No primeiro dia, configure o contexto A com pisos de grade e luz visível.
Certifique-se de que o multimetro está ligado a diferentes barras para confirmar a amplitude de choque desejada. Transportar animais do vivarium para a sala experimental em suas gaiolas de origem colocadas em uma carroça, e colocar individualmente nas quatro câmaras de condicionamento do medo. Para experimentos com camundongos, use o gerador de choque e os embaralhadores para entregar 10 choques de pé de um miliamp apresentados aleatoriamente ao longo de 60 minutos através dos pisos da grade das câmaras contendo indivíduos condicionados ao trauma.
Para experimentos com ratos, use o gerador de choque e os embaralhadores para entregar 15 choques de pé de um miliamp apresentados aleatoriamente ao longo de 90 minutos através das barras de grade das câmaras contendo indivíduos condicionados ao trauma. Após 90 minutos para o rato, ou 60 minutos para os experimentos do rato, devolva todos os animais para suas gaiolas domésticas e prontamente retorne ao vivarium. No segundo dia, configure o contexto A e transporte de animais para a sala experimental como feito no primeiro dia.
Coloque os animais no contexto A por oito minutos, sem entrega de choque, e o vídeo grave o comportamento durante toda a sessão. Após oito minutos, devolva todos os animais para suas gaiolas e retorne prontamente ao vivarium. No terceiro dia, configure o contexto B com um conjunto diferente de pisos de grade dos usados no contexto A e inserções de plexiglass curvo triangular ou branco preto.
Use luz infravermelha ou infravermelha próxima, se necessário, para iluminar as câmaras e verifique a amplitude de choque com o multímetro. Limpe as câmaras e pulverize as panelas sob os pisos da grade com a solução não utilizada no contexto A.Next, transporte animais do vivarium para a sala experimental em uma banheira de plástico preto, e coloque-os individualmente em câmaras de condicionamento do medo. Depois de um período de 180 segundos de linha de base, entregue um único segundo, um choque de pé miliamp para ratos, ou um único segundo, um choque de pé miliamp para ratos, para todos os animais.
Em seguida, remova todos os animais 30 segundos após o parto do choque e retorne prontamente ao vivarium. No quarto dia do procedimento, configure o contexto B como feito no terceiro dia. Transporte de animais do vivarium para a sala experimental no mesmo transporte que feito no terceiro dia.
Coloque os animais no contexto B por oito minutos sem entrega de choque, e o registro de vídeo congele durante toda a sessão. Por fim, remova todos os animais após oito minutos e retorne prontamente ao vivarium. Os resultados indicam que os animais em condição de trauma apresentaram níveis significativamente maiores de congelamento no contexto A em comparação com os controles de não trauma, indicando aquisição de medo ao contexto do trauma.
Tanto o trauma quanto nenhum animal de trauma apresentaram níveis mínimos de congelamento que não diferem um do outro. Além disso, os animais de trauma apresentaram menor reatividade de choque em comparação com os não controles de trauma, e os animais de trauma apresentaram maior congelamento em comparação com os controles de trauma, indicando que a exposição ao estresse traumático aumentou o medo imediatamente após o leve estressor. Após este procedimento, outros métodos como o labirinto mais elevado, campo aberto e caixa escura-clara podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como como o trauma afeta fenótipos semelhantes à ansiedade.
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Visão Geral
Este artigo descreve a metodologia para realizar experimentos de aprendizado do medo potencializado pelo estresse (SEFL), um modelo pré-clínico para o estudo do transtorno de estresse pós-traumático (PTSD) em roedores. A abordagem integra o condicionamento clássico do medo e avalia as respostas de medo por meio do comportamento de imobilidade.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência Comportamental
- Psicobiologia
- Modelos Animais de TEPT
Antecedentes
- SEFL é um modelo utilizado para investigar os mecanismos subjacentes ao TEPT.
- O método é aplicável tanto a ratos quanto a camundongos.
- Ele utiliza paradigmas estabelecidos de condicionamento do medo.
- Compreender as respostas de medo pode orientar estratégias terapêuticas.
Objetivo do Estudo
- Elucidar os mecanismos biológicos associados ao TEPT.
- Fornecer uma estrutura confiável para o estudo da aprendizagem do medo.
- Aprimorar o entendimento das respostas comportamentais em roedores.
Métodos Utilizados
- Configuração de câmaras de condicionamento de medo para diferentes contextos.
- Uso de cubículos atenuadores de som para minimizar interferências sonoras.
- Implementação de pisos em grade para a aplicação de choque nos pés.
- Modificação dos layouts das câmaras para distinguir entre contextos.
Resultados Principais
- O método demonstra robustez e confiabilidade na medição de respostas de medo.
- Dados quantitativos podem ser obtidos em múltiplas espécies.
- Aprendizado aversivo aumentado pode ser efetivamente modelado em ambientes controlados.
- Os resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos do TEPT.
Conclusões
- SEFL fornece uma ferramenta valiosa para o estudo do TEPT em ambientes pré-clínicos.
- A metodologia pode ser adaptada para diversos desenhos experimentais.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para explorar opções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A aprendizagem de medo potencializada pelo estresse (SEFL) fornece um modelo pré-clínico robusto para investigar mecanismos de desregulação do medo relevantes para a validação de alvos em TEPT. O modelo permite a avaliação quantitativa da sensibilização induzida por trauma na aprendizagem do medo, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Ao recapitular a hiper-mnésia de medo de longo prazo após estresse agudo, o SEFL auxilia na avaliação do engajamento de alvos e da modulação de vias em sistemas relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas relativas à disregulação do circuito do medo e à neuroplasticidade induzida pelo estresse.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos envolvidos na consolidação e extinção da memória do medo.
- Valor Preditivo: Apoia a avaliação da modulação de alvos sobre respostas ao medo sensibilizadas por trauma, orientando a seleção de compostos líderes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Estabelece protocolos padronizados e reprodutíveis de condicionamento ao medo com leituras quantificáveis do comportamento de imobilização.
- Utilidade Entre Espécies: Compatível com modelos de ratos e camundongos, permitindo escalonamento translacional e validação de alvos entre espécies.
- Discriminação de Contexto: Utiliza estímulos ambientais distintos (pisos em grade, inserções contextuais) para isolar a generalização específica ao trauma, aumentando a especificidade do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela fenótipos relevantes ao TEPT, incluindo sensibilização persistente ao medo e extinção do medo prejudicada.
- Continuidade Mecanística: Conecta a validação inicial de alvos com a avaliação pré-clínica de moduladores dos circuitos do medo.
- Tomada de Decisão Ajustada ao Risco: Fornece métricas quantitativas de imobilidade por medo para orientar critérios de avanço ou interrupção com base no engajamento do alvo e na recuperação comportamental.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
SEFL insere-se no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a otimização de compostos líderes e a avaliação de eficácia pré-clínica, especialmente para alvos do SNC que modulam respostas de medo e estresse.
- Biologia da Descoberta: Facilita a investigação baseada em hipóteses das vias da memória do medo e dos sistemas de resposta ao estresse por meio da exposição controlada a trauma.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantificáveis de condicionamento ao medo, adequadas para triagem de bibliotecas de compostos e campanhas de validação de alvos.
- Análises: Gera medições confiáveis da porcentagem de imobilidade, permitindo comparação estatística entre grupos submetidos a trauma e grupos controle em diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade desde a identificação de alvos até a validação pré-clínica, modelando a hiper-memória do medo relevante ao TEPT.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma comportamental escalável e transespécie, aplicável a diversas áreas terapêuticas envolvendo transtornos de ansiedade, medo e relacionados ao estresse.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao modelar a sensibilização ao medo induzida por trauma, relevante para a fisiopatologia do TEPT.
- Valor Operacional: Fornece desfechos comportamentais robustos, reprodutíveis e quantificáveis em diferentes laboratórios e locais.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao reduzir falsos positivos na validação de alvos por meio de fenotipagem relevante para a doença.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos no sistema nervoso central com base na eficácia em reverter o aprendizado do medo potencializado pelo estresse.
Considerações sobre a Implementação
- Exige conhecimento especializado em neurociência comportamental, paradigmas de condicionamento de medo e manejo de roedores.
- Depende de câmaras de condicionamento de medo, sistemas de aplicação de choque, gabinetes atenuadores de som e infraestrutura de rastreamento de vídeo.
- Necessita de protocolos padronizados de trauma e testes para garantir a reprodutibilidade entre operadores e locais.
- Envolve considerações de adaptação entre espécies quanto aos parâmetros de choque, duração e discriminação contextual entre ratos e camundongos.
- Limita-se à medição de respostas de medo aprendidas; ensaios complementares são necessários para fenótipos mais amplos relacionados à ansiedade, afeto ou estresse.
