Name: Análise da síntese proteica epidídimo e secreção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda técnicas de imunofluorescência e isolamento de proteínas secretadas no epidídimo de camundongos. Este método permite estudar a localização de dinamina e a composição proteica do fluido epididimário em biologia reprodutiva.

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Os autores que gostaria de agradecer a nacionais de saúde e médico pesquisa Conselho de Austrália projeto Grant APP1103176 pelo apoio deste trabalho.

Todos os procedimentos experimentais envolvendo a coleção de tecidos animais foram aprovados pelo cuidado Animal e Comitê de ética da Universidade de Newcastle.
1. imunofluorescência coloração das seções parafina epidídimo (figuras 1 e 2)
<ol><li>Imediatamente após a eutanásia de ratos adultos através da inalação de CO2 (camundongos suíços, mais de 8 semanas de idade), dissecar cuidadosamente o epidídimo (utilizando tesouras cirúrgicas e uma pinça) livre de sobrejacente do tecido conjuntivo e gordura e mergulhe no fixador de Bouin solução (> 10 vezes o peso do volume/tecido) para fixação durante a noite.</li>
	<li>Lave o tecido com etanol a 70% com 2 × alterações diariamente por 2 dias e em seguida, desidrata-se através de classificados etanol (70%, 95% e 100%) em preparação para a infiltração e incorporação em um bloco de parafina.</li>
	<li>Seção os blocos de parafina em uma espessura de 4-6 µm e montagem nos slides em preparação para a mancha da imunofluorescência.</li>
	<li>Em uma coifa, dewax as secções de parafina epidídimo, adicionando uma quantidade suficiente de xileno na jarra de slide para imergir completamente a secção de tecido (3 × 5 min cada vez).</li>
	<li>Hidratar as secções de tecido pela imersão em soluções gradual do etanol diluído em purificado H2O (100% etanol 5 min, 5 min, 90% etanol 1 min, 80% de etanol 1 min, 70% de etanol 100% de etanol 1 min e 50% de etanol 1 min).</li>
	<li>Lave as seções em um frasco de slide uma vez por 5 min com suficiente salina tamponada fosfato (PBS) para imergir completamente a seção inteira de tecido (siga estas instruções para todas as lavagens subsequentes).</li>
	<li>Decantar a solução de recuperação de antígeno apropriado (i. e., 10 mmol/L citrato de sódio, 50 mmol/L Tris pH 10,5 ou da antígeno alternativos de recuperação ou mais soluções, dependendo do antígeno a ser detectado) em um porta-lâminas e microondas até ferver. Mergulhe os slides para esta solução e sujeita as secções de tecido para condições de recuperação de antígeno induzida por calor otimizadas para anticorpos individuais (ver tabela 1). Cuidado: Certifique-se que os slides estão totalmente imersos em solução de recuperação de antígeno durante o processo de recuperação de antígeno.</li>
	<li>Retire o recipiente de slide do microondas e esfriar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os slides com PBS e use uma caneta de marcador de slide líquido repelente para rastreamento em torno da seção de tecido.</li>
	<li>Coloque as lâminas em um recipiente umidificado (criado por um tecido umedecido na base do recipiente) e aplicar solução de bloqueio (3% BSA/PBS, previamente filtrada através de um filtro de 0,45 µm) para 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Enxágue as lâminas uma vez com PBS.</li>
	<li>Incubar as secções com anticorpo primário apropriado diluído a uma concentração experimentalmente otimizada no filtrado 1% BSA/PBS a 4 ° C durante a noite (1: 60 para anti-DNM1, DNM2 e DNM3 anticorpos; 1: 100 para o anticorpo anti-ATP6V1B1, ver tabela de materiais para obter detalhes de anticorpo). Nota: Para distinguir específica de ligação do anticorpo específico, é necessário incluir rigoroso negativo (i. e., anticorpo secundário primário, único anticorpo preabsorbed contra Imunizar do peptide) e controlos positivos24.</li>
	<li>Reaquecer os slides, colocando-se à temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Lave os slides 3 × com PBS em uma plataforma de agitação (60 rpm) por 10 min cada.</li>
	<li>Incubar as secções com anticorpo secundário apropriado, diluído em 1% BSA/PBS (filtrada através de um filtro de 0,45 µm) a 37 ° C por 1h (diluição de 1: 400 para todos os anticorpos secundários, consulte Tabela de materiais para obter detalhes de anticorpo). Atenção: Manter o recipiente do slide no escuro desta etapa em diante. Para a dupla rotulagem, escolher uma combinação compatível de anticorpos secundários (i. e., anticorpos secundários têm sido levantados em espécies diferentes).</li>
	<li>Lave os slides 3 × com PBS em uma plataforma de agitação (60 rpm) por 10 min cada.</li>
	<li>Counterstain as seções com iodeto de propidium (PI, 7.48 μmol/L) ou 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) por 2 min à temperatura ambiente para rotular o núcleo da célula.</li>
	<li>Lave as lâminas duas vezes com PBS em uma plataforma de agitação (60 rpm) por 5 min cada.</li>
	<li>Montar as seções com Mowiol 4-88 preparada em uma solução de 30% de glicerol em 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) de 10% e 2,5% 1, 4 - diazabiciclo-(2.2.2)-octano.</li>
	<li>Selar a lamela com verniz das unhas e armazenar os slides a 4 ° C para observação futura. Atenção: É aconselhável realizar a imagem dos slides, logo que prático após o preparo para evitar a perda excessiva de fluorescência.</li>
</ol>2 isolamento do Epididymosomes do Mouse Caput epidídimo (Figura 3)
<ol><li>Imediatamente após a eutanásia de ratos adultos através da inalação de CO2 (mais de 8 semanas de idade de camundongos suíços), perfundir sua vasculatura com PBS (pré aquecido a 37 ° C) para minimizar a contaminação de sangue do tecido do epidídimo. Atenção: o plasma sanguíneo contém diversas populações de exosomes, que são de tamanho similar a epididymosomes25. A eficácia da liberação de sangue do tecido do epidídimo pode ser acessada através da inspeção do segmento inicial, um segmento altamente vascularizado e epidídimo localizado proximal ao segmento caput (i. e., zona 1 na figura 1A)</li>
	<li>Dissecar cuidadosamente o epidídimo livre de gordura sobrejacente e tecido conjuntivo e enxágue com meio Biggers, Whitten e Whittingham modificado (BWW; pH 7,4, osmolalidade de 300 mmol/kg água26,27) para reduzir qualquer potencial de superfície contaminação do sangue.</li>
	<li>Borre o epidídimo tecido para retirar o excesso mídia, dissecar o epidídimo caput (i. e., zonas de 2-5 na figura 1A) e transferir para um prato de Petri fresco (35 × 10mm) contendo meio BWW. Certifique-se de que a quantidade do meio é suficiente para a recuperação final. Nota: Para 6 caput epidídimos, é recomendável usar 1,1 mL do meio para permitir uma recuperação de ~ 900 µ l, que é então uniformemente dividida e aplicada em cima de 2 gradientes pré-preparadas (ver passo 2.9).</li>
	<li>Fazer um número de pequenas incisões no caput tecido com uma lâmina de barbear. Não picar o tecido e, assim, evitar contaminar a amostra com excessivo conteúdo citosólica. Incube a placa contendo o tecido com agitação suave a 37 ° C por 30 min liberar o conteúdo luminal.</li>
	<li>Filtre a suspensão resultante 70 µm membranas para remover os restos celulares.</li>
	<li>Recolher o filtrado e submeta este a etapas sucessivas de centrifugação a 4 ° C, com o aumento da velocidade para eliminar restos celulares (i. e., 500 × g, 2.000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min cada; 17.000 × g por 20 min e finalmente 17.000 × g por um adicional 10 min ou até que nenhum sedimento é formado após centrifugação). Atenção: É importante para avaliar a cor da pelota após 500 × g centrifugação passo inicial para garantir a contaminação de sangue mínima está presente. Descarte qualquer amostras em que este sedimento exibe coloração rosa.</li>
	<li>Prepare-se descontínuo do iodixanol (composto por 40%, 20%, 10%, 5% camadas) diluindo um meio de gradiente de densidade (composta por 60% (p/v) aquosa iodixanol) com uma solução 0,25 mol/L sacarose e 10 mmol/L Tris (pH 7,5).</li>
	<li>Prepare o gradiente em um tubo se (11 × 35 mm), com cada fração de 450 µ l (Figura 3). Inspecione visualmente o gradiente após a aplicação de cada fração, para garantir que as interfaces com êxito são formadas entre cada camada antes de carregar a epidídimo amostra de fluido. Preparar cada gradiente fresco no dia do uso, no entanto, a amostra de fluido luminal epidídimo pode ser preservada a 4 ° C por até 2 h antes do carregamento.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 450 µ l de epidídimo luminal fluido suspensão (correspondente ao material coletado desde o caput 3 epidídimos) no topo de um gradiente simples.</li>
	<li>Se os gradientes a 160.000 × g a 4 ° C por 18 h. Atenção: Desde que esta centrifugação é conduzida em alta velocidade, todos os tubos se devem ser emparelhados e equilibrados precisamente. Verifique se os tubos para garantir que eles estão livres de danos visíveis, o que poderiam comprometer sua integridade.</li>
	<li>Remova cuidadosamente a 12 fracções iguais (cada um composto por 185 µ l) a partir da camada superior e progredindo em direção a parte inferior do gradiente. Reunir as fracções equivalentes recuperadas de cada gradiente se aplicável (até dois gradientes). Nota: O Mouse epididymosomes são mais altamente enriquecido em frações 9-11,22, ver Figura 4 e discussão.</li>
	<li>Após a recuperação e o pool de frações 9 – 11, diluir em 2 mL de PBS e se as amostras a 100.000 × g a 4 ° C por 3 h (13 × 56 mm tubo) para o epididymosomes de Pelotas. Atenção: Desde a pelota de epididymosome pode ser difícil de ver, certifique-se de que a orientação dos tubos é notar como eles são colocados em um rotor e marcam o tubo para indicar a posição expectante da pelota de epididymosome. Certifique-se de que cada tubo contém um volume suficiente (i. e., superior a 50% da capacidade total) para evitar o risco de colapso do tubo.</li>
	<li>Cuidadosamente, aspirar e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento de epididymosome.</li>
	<li>Avalie a pureza de epididymosome (Figura 4).</li>
	<li>Ressuspender o epididymosome no meio desejado de acordo com o aplicativo (s) a jusante. Por exemplo, meio BWW geralmente é usado para os experimentos envolvendo co incubação com espermatozoides ou, alternativamente, um tampão de Lise apropriado em preparação para a resolução do epidídimo proteome através de SDS-PAGE.</li>
</ol>3. imunofluorescência coloração de células mECap18
<ol><li>Preparação de lamelas estéril (para ser realizado em uma capa de cultura de células)<ol>
<li>Mergulhe as lamelas (12 × 12 mm) em etanol a 70% por 10 min e desinfectar por secagem sob a alta temperatura acima de uma lâmpada de etanol.</li>
		<li>Legal a lamela para 10 s antes de transferir para um prato bem 12.</li>
		<li>Aplica a solução estéril de poli-L-lisina para cobrir a lamela e se contentar com 10 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Descartar a solução de poli-L-lisina e enxaguar a lamela com estéril H2O ou médio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Células mECap18 de preparação<ol>
<li>Passagem as alíquotas de 2 × 105 mECap18 células em cada poço da placa bem 12 contendo as lamelas.</li>
		<li>Cultura de células com mECap18 celular médio (DMEM suplementado com 1% L-glutamina, piruvato de sódio 1%, 1% penicilina/estreptomicina e 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/L) com vitela fetal 10% soro (FBS) em uma incubadora de 37 ° C sob uma atmosfera de 5% CO2 durante a noite.</li>
		<li>Uma vez que as células aderirem a lamela, descartar o meio e enxágue as células duas vezes com PBS.</li>
		<li>Adicione uma quantidade suficiente de paraformaldeído 4% (PFA) diluída em PBS, mergulhe a lamela toda e corrigir as células à temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Descartar a solução PFA e enxágue as lamelas duas vezes em PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mancha da imunofluorescência<ol>
<li>Permeabilize mECap18 células por imersão em 0,1% Triton X-100 em PBS por 10 min.</li>
		<li>Enxague as lamelas com PBS.</li>
		<li>Bloquear células mECap18 com 3% de BSA e proceder com immunolabeling de células utilizando protocolos equivalentes àquelas descritas para o epidídimo cortes histologicos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. isolamento de proteínas do meio de cultura celular condicionado
<ol><li>Coleção de meio de cultura celular condicionado<ol>
<li>Alíquotas de passagem de 4 × 105 mECap18 células em cada poço de 6 bem a placa com meio de célula mECap18 suplementado com 10% FBS por 24 h.</li>
		<li>Lavar as células mECap18 três vezes com meio de celular mECap18 (preparado sem FBS) para remover FBS residual e qualquer associado contaminantes de proteína.</li>
		<li>Adicione 1,5 mL de meio de celular mECap18 (preparado sem FBS) a cada poço e incubar com células mECap18 para 12h em uma incubadora de 37° C abaixo de 5% de CO2. Nota: mECap18 células neste passo podem ser avaliadas por antígenos alvo diferentes de acordo com o projeto experimental.</li>
		<li>Após a incubação de 12 h, colete o meio celular e centrifugar a 2.000 × g por 10 min remover todos os restos celulares. Nota: A duração da incubação é capaz de ser alterada de acordo com a avaliação do projeto experimental/ponto de extremidade e tendo em consideração a tolerância da célula de treatment(s) aplicada. Recomenda-se ajustar o tempo de incubação, com base em regimes experimentais específicos para assegurar que sejam alcançados resultados óptimos.</li>
		<li>Avalie a viabilidade de celular mECap18 através da aplicação de um padrão trypan azul exclusão do ensaio28. Descarte todo o material em que a viabilidade celular tem diminuído abaixo de 90% para eliminar o viés introduzido por proteínas libertadas de células mortas ou moribundas.</li>
		<li>Isolar proteínas do meio celular como segue ou preservar médio a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento da proteína (a ser realizado em uma coifa)<ol>
<li>Adicione 20% do volume de refrigerados ácido tricloroacético de 100% para 80% volume de meio de celular condicionados para precipitar as proteínas libertadas das células cultivadas mECap18. Incube a 4 ° C durante a noite com uma mistura constante.</li>
		<li>Após a incubação, pelota proteína precipitada por centrifugação (17, 000 × g, 4 ° C por 10 min). Nota: Devido a quantidade limitada de proteína que esperava para ser secretado para o meio, é possível que o sedimento não ser facilmente visualizado após a centrifugação. Portanto, é imperativo para orientar o tubo antes da centrifugação e tome cuidado para não perturbar o local da pelota expectante durante a remoção do líquido sobrenadante corretamente.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com acetona gelada antes da re-centrifugação a (17, 000 × g, 4 ° C por 10 min).</li>
		<li>Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante antes de secando qualquer acetona residual dentro de uma coifa.</li>
		<li>Resuspenda o pellet de proteína em um buffer de extração adequada em preparação para a análise de ponto de extremidade detectar a proteína secretora completa de perfis e/ou proteínas individuais do alvo (ex., SDS-PAGE, immunoblotting).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Estes estudos incorporaram o uso de tecido do Bouin fixo epidídimo que tinha sido submetido a incorporação de parafina e protocolos padrão de corte. Fixador solução de Bouin é composto por uma mistura de formol, ácido pícrico e ácido acético, com cada componente tem uma função específica e complementar. Assim, formaldeído reage com aminas primárias para formar ligações cruzadas de proteína, ácido pícrico lentamente penetra o tecido formando sais e, portanto, coagulação das proteínas básicas e por outro lado, o ácido acét...

Os espermatozoides de todas as espécies de mamíferos adquirem o potencial para exibir motilidade progressiva e para fertilizar um óvulo durante a sua descida prolongada através do epidídimo, uma região altamente especializada do sistema masculino adesiva extra testicular, que pode 7-14 dias para navegar (dependendo da espécie)1. Devido a extrema condensação da cromatina a paterna e o derramamento da maioria do citoplasma que acompanha a cytodifferentiation de espermatozoides nos testículos, sua maturação funcional subsequente é conduzida exclusivamente por sua interação com o microambiente epidídimo. Neste meio é, por sua vez, criado pela atividade secretora e absorvente da soma de epidídimo forro e exibe um nível excepcional de variação de segmento-segmento1. Assim, os segmentos mais ativos em termos de síntese proteica e secreção são aqueles localizados na porção proximal do epidídimo (ou seja, o caput e corpus)2. Esta actividade espelha o perfil funcional de espermatozoides, com o início de primeira células para exibir marcas de competência funcional (i. e., motilidade progressiva e a capacidade de ligar a zona do ácido-solubilizado glicoproteínas) seguir seus passagem do caput epidídimo3. Esses atributos funcionais continuam a desenvolver-se antes de atingir os níveis ideais como o esperma alcançar o segmento distal epidídimo (cauda), onde eles são armazenados em estado quiescente em prontidão para a ejaculação. A formação e a manutenção deste reservatório de armazenamento de esperma está também intimamente ligada do epitélio de revestimento, que na cauda é dominado pela forte atividade de absorção4,5. Apesar de diferenças anatômicas foram relatados6,7,8, tal divisão regionalizada do trabalho parece ser uma característica do epidídimo que é compartilhado entre a maioria das espécies de mamíferos estudou até à data, incluindo a nossa própria9,10. Com efeito, do ponto de vista clínica, é conhecido que disfunção do epidídimo faz uma importante contribuição para a etiologia do fator masculino infertilidade11, destacando assim a importância de compreender o Regulamento deste tecido especializado.
Assim, é lamentável que o nosso entendimento da fisiologia do epidídimo e os mecanismos que regulam as fases sequenciais de maturação de espermatozoides e armazenamento dentro deste tecido, continuam a ser totalmente resolvido. Entre os fatores que contribuem, limitantes avanços na pesquisa do epidídimo são a complexidade geral deste tecido e conhecimento dos mecanismos que exercem o controlo regulamentar sobre seu microambiente luminal. Anatomicamente, sabemos que, para além da distinção de segmentos caput, corpo e cauda, epidídimo pode ser subdividido em várias zonas (figura 1A), cada um separados por septos12 e caracterizada por perfis distintos de gene/proteína expressão13,14,15,16,17,18. Com efeito, com base em detalhada transcriptional perfilamento segmental da expressão do gene no epidídimo, até 6 e 9 zonas epidídimo distintas têm sido relatadas em modelos do rato e do rato, respectivamente de19,20. Tal complexidade presumivelmente reflete a composição da soma do epidídimo, um epitélio pseudoestratificado composto por numerosos tipos de células diferentes; cada diferindo em relação a suas atividades de abundância, distribuição e secretora/absorção ao longo do comprimento do trato. Assim, as células principais são de longe a mais abundante epidídimo célula tipo que constituem mais de 80% de todas as células epiteliais. Assim, as células principais são responsáveis pela maior parte da proteína epidídimo biossíntese e secreção de5. Em contraste, a população de células claras, que classificar como o tipo de célula a segunda mais abundante dentro do epidídimo soma, está principalmente envolvida na absorção seletiva de componentes luminal e a acidificação deste microambiente5. Adicionar outra camada de complexidade, andrógenos e outros fatores de lumicrine de origem testicular exercem controle diferencial sobre cada um desses tipos de células do epidídimo, dependendo de seu posicionamento ao longo do trato.
Apesar das limitações impostas pelo tal complexidade, incursões significativas continuam a ser feito para resolver a base mecanicista da função do epidídimo. Uma chave para estes estudos tem sido a aplicação de estratégias avançadas espectrometria de massa para estabelecer inventários de larga escala de proteome o epidídimo, em conjunto com análises detalhadas das proteínas individuais, seleccionadas de entre essas pesquisas iniciais. Uma ilustração desta abordagem é nossa recente caracterização da família de mechanoenzymes no rato modelo21de DNM. Nosso interesse inicial em DNM foi alimentado por sua ação dupla no acoplamento de exo - e processos endocytotic. Baseando-se estas observações, fomos capazes de demonstrar que as três isoformas canônicas de DNM (DNM1 - DNM3) são altamente expressa no epidídimo de rato e adequadamente posicionadas para atender funções reguladoras na secreção de proteínas e absorção21 . Além disso, fomos capazes de diferenciar claramente cada isoform DNM com base em sua localização celular e sub celular, sugerindo que eles possuem complementares, em oposição à atividade redundante, dentro do epitélio do epidídimo21.
Aqui, descrevemos a metodologia experimental empregada para o estudo da expressão de DNM no epidídimo de rato com a esperança que esta informação será encontrar ampla aplicação na caracterização de proteínas epidídimo alternativas e, assim, contribuir para nossa compreensão da função desse elemento importante do aparelho reprodutor masculino. Especificamente, descrevemos o desenvolvimento da metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas seções epidídimo parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através de imunofluorescência microscopia. Documentamos ainda mais nossos protocolos recentemente otimizado22 para o isolamento e caracterização de epididymosomes; exossomo-como pequenas vesículas que constituem elementos-chave do epidídimo perfil secretora e parecem manter um papel de destaque na promoção de maturação do esperma23. Como uma abordagem complementar, descrevemos também a detecção de imunofluorescência de proteínas do alvo em uma linhagem de células do rato imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18) e o uso deste recurso como um modelo com o qual deseja explorar o Regulamento do epidídimo a atividade secretora em vitro.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo Dynamin 1</td><td>Abcam</td><td>ab108458</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Coelho, <forte>Isótipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: anticorpo policlonal</td></tr><tr><td>Dynamin 2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6400</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Cabra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: anticorpo policlonal</td></tr><tr><td>Dynamin 3</td><td>Proteintech</td><td>14737-1-AP</td><<td>forte>Espécie hospedeira</forte>: Coelho, <forte>Isótipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: anticorpo ATP6V1B1 policlonal</td></tr><tr><td></td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Cabra, <forte>Isótipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: anticorpo policlonal</td></tr><tr><td>CD9</td><td>BD Pharmingen</td><td>553758</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Rato, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: anticorpo monoclonal</td></tr><tr><td>Flotilina-1</td><td>Sigma</td><td>F1180</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Coelho, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: anticorpo policlonal</td></tr><tr><td>ALOX15</td><td>Abcam</td><td>ab80221</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Coelho, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: anticorpo policlonal</td></tr><tr><td>TUBB</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Camundongo, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: anticorpo monoclonal</td></tr><tr><td>PSMD7</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Coelho, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Coelho Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Cabra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11055</td><td>Espécies hospedeiras: Burro, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11058</td><td>Espécies hospedeiras: Burro, Isotype: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Rato Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Cabra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Coelho HRP</td><td>Millipore</td><td>DC03L</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Cabra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Rato HRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Cabra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonal</td></tr><tr><td>Anti Rato HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td><forte>Espécie hospedeira</forte>: Cabra, <forte>Isotipo</forte>: IgG, <forte>Classe</forte>: policlonal</td></tr><tr><td>4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>iodeto de propídio (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>soro bovino fetal (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Thermo</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&alfa;-androstan-17&beta;-ol-3-onaC-IIIN</td><td>Sigma</td><td>A8380</td><td></td></tr><tr><td>piruvato de sódio</td><td>Thermo</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-etilenodiaminatetracético ácido (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Astral</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1, 4-diazabiciclo- (2.2.2)-octanagem</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-gisina</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>78787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>Sigma</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2.5 L GL</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poli (álcool vinílico)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-Glicose</td><td>Ajax Finechem</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Gradiente de Densidade Médio</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia de fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífugas</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Heracell</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>Grande Agitador Orbital</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>Microondas</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH de Laboratório</td><td>MeterLab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de lâmina repelente de líquidos</td><td>Daido Sangyo</td><td>Mini</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Mikro-Glass</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; filtro m</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Papel sem poeira</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga (2,2 ml, 11 &vezes; 35 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga (3,2 ml, 13 &vezes; 56 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células 70 &micro; m Nylon</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 35 &vezes; 10 mm com cames</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Jarra deslizante</td><td>TRAJAN</td><td>#23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

análise da síntese proteica epidídimo e secreção

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

O epidídimo mamíferos gera um dos mais complexos fluidos intraluminal de qualquer glândula endócrina para oferecer suporte a maturação pós-testicular e armazenamento de espermatozoides. Tal complexidade surge devido a atividade secretora e absorvente combinada das pilhas epithelial forro. Aqui, descrevemos as técnicas para a análise da secreção e síntese de proteínas epidídimo, centrando-se sobre a família de proteínas de modelo de Dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPases grandes que têm o potencial para regular eventos de tráfico membrana bi-direcional. Para o estudo da expressão da proteína no tecido epidídimo, descrevemos a metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas secções de parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através microscopia de imunofluorescência. Também descrevemos a metodologia otimizada para o isolamento e caracterização de exossomo como vesículas, conhecido como epididymosomes, que são secretadas no lúmen epidídimo para participar na comunicação intercelular com maturação de células de esperma. Como uma abordagem complementar, também descrevemos a detecção de imunofluorescência de proteínas alvo em uma linhagem de células do rato SV40-imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18). Além disso, podemos discutir o utilitário da linha de celular mECap18 como um modelo adequado em vitro com para explorar a regulação da atividade secretora epidídimo. Para este fim, descrevemos as exigências de cultivo para a manutenção da linhagem celular mECap18 e o uso de esquemas de inibição farmacológica seletiva que são capazes de influenciar seu perfil de proteínas secretoras. Os últimos são prontamente avaliaram através da colheita de condicionados de meio de cultura, concentração de proteínas secretadas através de precipitação do ácido tricloroacético/acetona e sua posterior análise através de SDS-PAGE e immunoblotting. Podemos afirmar que esses métodos combinados são apropriados para a análise de alternativas de proteína epidídimo alvos como um prelúdio para determinar seu papel funcional na maturação do esperma e/ou armazenamento.

Figura 1 e Figura 2 mostram resultados representativos de localização de imunofluorescência de DNM no epidídimo caput do mouse. Cada um das três isoformas DNM investigado exibir localização distintos perfis. Assim, DNM1 caracteriza-se por rotulagem difusa relativamente modesto das células epidídimo durante todo o epidídimo inicial do segmento e caput (Figura 2A). Por outro lado, a is...

Aqui, nós relatamos a localização de imunofluorescência de Dinamina para ilustrar os protocolos para a detecção de proteínas em seções epidídimo de rato de parafina e aqueles de uma linhagem de células epidídimo imortalizado (mECap18). Também descrevemos os protocolos para o isolamento de proteínas secretoras do epidídimo fluido e mídia celular condicionados.

Análise da síntese proteica epidídimo e secreção

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Esses mestres combinados podem responder a questões-chave no campo da pesquisa epididimal, como quais alvos de proteínas estão envolvidos na regulação da maturação e armazenamento de espermatozoides. A principal vantagem da técnica de isolamento epididimal é que ela também é aplicável para isolar uma população semelhante de outras regiões da epiderme entre diferentes espécies. Para iniciar este procedimento, transfira as seções de parafina do epidídimo para uma capela de exaustão.Adicione xileno suficiente ao frasco deslizante para mergulhar completamente a seção de tecido. Reidrate as seções de tecido imergindo-as em soluções graduadas de etinol diluídas em água purificada, conforme descrito no protocolo de texto. Lave as seções em um frasco deslizante por cinco minutos com PBS suficiente para mergulhar completamente toda a seção de tecido.Em seguida, transvase a solução apropriada de recuperação de antígenos em um suporte de lâminas. Microondas a solução até que esteja fervendo. Mergulhe completamente as lâminas na solução, submetendo as seções de tecido a soluções de recuperação de antígeno induzidas por calor.Depois disso, retire o recipiente de lâminas do micro-ondas e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Enxágue as lâminas em uma jarra contendo PBS por cinco minutos. Usando uma caneta marcadora de lâminas repelente de líquidos, trace ao redor da seção de tecido.Transfira as lâminas para um recipiente umidificado. Aplique a solução de bloqueio por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, enxágue as lâminas uma vez com PBS.Incube as seções com um anticorpo primário apropriado diluído a uma concentração experimentalmente otimizada em PBS 1% BSA filtrado a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de reaquecer as lâminas à temperatura ambiente, lave-as com PBS em uma plataforma agitável a 60 RPM por 10 minutos. Repita esta lavagem mais duas vezes.Incube as seções com um anticorpo secundário apropriado diluído em PBS 1% BSA filtrado a 37 graus Celsius por uma hora. Daqui em diante, mantenha os slides no escuro. Lave as lâminas três vezes com PBS em uma plataforma vibratória a 60 RPM por 10 minutos por lavagem.Em seguida, pinte, monte e sele as amostras conforme descrito no protocolo de texto. Imediatamente após a eutanásia dos camundongos adultos, profunda sua vasculatura com PBS que foi pré-aquecido a 37 graus Celsius para minimizar a contaminação do sangue do tecido epididimal. Dissecar cuidadosamente o epidídimo livre de gordura sobrejacente e tecido conjuntivo e enxaguar com meio BWW modificado para reduzir qualquer potencial de contaminação superficial do sangue.Seque o tecido epididimal para remover o excesso de meio e dissecar o epidídimo caput. Em seguida, transfira o epidídimo do caput dissecado para uma placa de Petri fresca contendo meio BWW, certificando-se de que a quantidade de meio seja suficiente para a recuperação final. Usando uma lâmina de barbear, faça uma série de pequenas incisões no tecido caput.Não pique o lenço. Incube a 37 graus Celsius com agitação leve por 30 minutos para liberar o conteúdo luminal. Usando membranas de 70 micrômetros, filtre a suspensão resultante e remova os detritos celulares.Recolha a suspensão e submeta-a a sucessivas etapas de centrifugação a quatro graus Celsius com velocidade crescente para eliminar os detritos celulares. Em seguida, prepare gradientes descontínuos de iodixanol conforme descrito no protocolo de texto. Preparar o gradiente num tubo de ultracentrífuga utilizando cada fracção de 450 microlitros.Inspecione visualmente o gradiente depois que cada fração for aplicada para garantir que as interfaces sejam formadas com êxito entre cada camada. Adicione cuidadosamente 450 microlitros de suspensão de fluido luminal epididimal em cima de um único gradiente. Ultracentrifugar os gradientes a 160.000 vezes g e quatro graus Celsius por 18 horas.Remova suavemente 12 frações iguais do gradiente centrifugado, começando da camada superior e progredindo em direção à parte inferior do gradiente. Se aplicável, agrupar as frações equivalentes recuperadas de cada gradiente. Depois que as frações nove a 11 forem recuperadas e agrupadas, dilua-as em dois mililitros de PBS.Ultracentrifugar as amostras a 100 000 vezes g e quatro graus Celsius durante três horas para sedimentar os epidídimos. Em seguida, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante, certificando-se de não perturbar o pellet do epidídimo. É essencial avaliar a pureza do epidídimo antes de qualquer aplicação a jusante.Depois de preparadas as lamínulas estéreis, alíquotas de passagem de 200 000 mEcap 18 células em cada alvéolo da placa de 12 poços que contém as lamínulas. Cultive as células conforme descrito no protocolo de texto. Uma vez que as células tenham aderido à lamínula, descarte o meio e enxágue as células duas vezes com PBS.Adicione uma quantidade suficiente de 4% de paraformaldeído para imergir toda a lamínula e fixe as células em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, descarte a solução de paraformaldeído e enxágue as lamínulas duas vezes em PBS. Mergulhe as lamínulas enxaguadas em 0,1 Triton X-100 em PBS por 10 minutos para permeabalizar as células.Enxágue, bloqueie e imunomarque as células conforme descrito no protocolo de texto. Primeiro, alíquotas de passagem de células mEcap 18 em uma placa de 6 poços, conforme descrito no protocolo de texto. Uma vez aderidas, lave as células três vezes com meio celular mEcap 18 livre de FBS para remover o FBS residual e quaisquer contaminantes proteicos associados.Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio mEcap 18 células livre de FBS a cada poço. Incubar por 12 horas em uma incubadora de 37 graus Celsius sob uma atmosfera de 5% de CO2. Depois disso, colete o meio celular e centrifugue a 2.000 vezes g por 10 minutos para remover todos os detritos celulares.Usando um ensaio de exclusão padrão de azul de tripano, avalie a viabilidade celular mEcap. Adicione 20% do volume de ácido 100% tricloroacético resfriado a 80% do volume do meio celular para precipitar as proteínas liberadas das células mEcap 18 cultivadas. Incube a quatro graus Celsius durante a noite com mistura constante.Em seguida, centrifugue a 17.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Rejeitar o sobrenadante e lavar o grânulo proteico duas vezes com acetona gelada. Em seguida, centrifugue novamente a 17.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos.Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante mais uma vez. Em seguida, secar ao ar as amostras na hotte para remover qualquer acetona residual. Cada uma das isoformas de DNMI investigadas exibe um perfil de localização de imunofluorescência distinto.O DNMI é caracterizado por uma marcação difusa relativamente modesta das células do epidídimo em todo o segmento inicial e no epidídimo do caput. A isoforma DNM2 é detectada pela primeira vez nas proximidades da borda basal e apical oposta das células no segmento inicial, antes de se reposicionar no domínio supranuclear nas células dentro do segmento de caput a jusante adjacente. A intensidade dessa marcação diminui gradualmente entre as zonas dois e cinco do epidídimo de caput, o que reflete essencialmente a atividade secretora desses segmentos do epidídimo.A marcação supranuclear de DNM2 é subsequentemente vista como correspondendo à distribuição do aparelho de golgi dentro das células principais do caput. A isoforma DNM3 é detectada principalmente no domínio apical de um pequeno número de células epiteliais de caput, que correspondem à subpopulação de células claras por co-marcação com o marcador de células claras reconhecido ATP6V1B1. Em seguida, uma linhagem celular mEcap 18 imortalizada é utilizada como modelo in vitro para estudar a atividade secretora das células do epidídimo.Os padrões de distribuição são consistentes com os observados nas seções de tecido epididimal do caput, com DNM1 detectado em todo o citoplasma de células mEcap 18, DNM2 concentrado no supranuclear dessas células e DNM3 caracterizado por focos discretos de coloração de membrana dentro de um pequeno número de subpopulação. Ao tentar a detecção de imunofluorescência, é importante lembrar de otimizar as condições para cada antígeno. A população da zona epididimal isolada é prontamente passível de uso em aplicações a jusante, incluindo co-incubação com espermatozóides e ocalgo por análise de arquivamento, ambas abordagens poderosas para melhorar nossa compreensão do papel do epidídimo na regulação da maturação do esperma do epidídimo.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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