Name: Quantificar intermembranar distâncias com dilatações imagem Serial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a medir distâncias intermembranares com dilatação de imagem e algoritmos de busca de caminho. Este método computacional oferece alta resolução espacial para estudos de eletrofisiologia cardíaca e biologia estrutural.

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Os autores gostaria de agradecer Kathy Lowe na faculdade a Virgínia-Maryland de medicina veterinária para processamento e coloração amostras TEM. Financiamento: Institutos nacionais de saúde R01-HL102298 Institutos nacionais de saúde F31-HL140873-01

Nota: O Software necessário são ImageJ (ou software de modificação de imagem similar) e Matlab R2015. O usuário pode encontrar problemas de compatibilidade com outras versões do Matlab.
1. pré-processamento de imagens
<ol><li>Para qualquer imagem em tons de cinza, certifique-se do valor de intensidade máxima de qualquer determinado pixel é < 255. Isto é normalmente feito subtraindo um valor de 1 da imagem no programa Matlab personalizada "ImageSub.m", incluído no arquivo suplementar S1.</li>
</ol>2. a Perinexus de estrutura de tópicos
<ol><li>Delinear o perinexus no ImageJ ou outro software de processamento de imagem.</li>
	<li>Certifique-se que o contorno é um pixel de espesso e é definido como o valor mais alto de intensidade em uma imagem (255 em uma imagem em tons de cinza de 0 a 255).</li>
	<li>Identificar o GJ por estrutura pentalaminar11,12e definir o início da perinexus como o ponto no qual os dois opostos da membrana celular bilayers divergem, como mostrado na Figura 1A. Begin ~ 200 nm da borda da GJ, rastreamento da membrana interna da célula primeira e volta ao longo da membrana interna da segunda célula. No ImageJ, solte a caneta para automaticamente fechar o contorno. Este fechamento artificial será cortado para fora mais tarde. Nota: É fundamental delinear o perinexus com grande cuidado em como alta uma ampliação possível, pois mesmo pequenas aplicações mis da estrutura de tópicos podem resultar em vários nanômetros de erro na medição final.</li>
</ol>3. criação de algoritmo e selecionar Perinexus de interesse
Nota: O algoritmo de pathfinding requer o autógrafo, borda, gráfico, nó e Pathfinding funções9 para estar no mesmo diretório que o arquivo MembraneSepDist-m. Todos os arquivos podem ser encontrados no arquivo suplementar S1.
<ol><li>Selecione salvar locais para dados e números. Estes são atualmente embutido no arquivo-m. Nota: A primeira linha do programa é uma função para limpar todas as variáveis, feche todas as janelas e limpar a janela de comando. Salve qualquer variáveis desejadas ou figuras antes de executar o arquivo de m. Nota: O Software screenshots são incluídos no arquivo suplementar S2 para todos os valores codificados.</li>
	<li>Execute o programa "MembraneSepDist.m".</li>
	<li>Definir parâmetros. Nota: Um GUI pop-up com parâmetros padrão para o limite de gradiente, escala, região de interesse e inicialização manual. Os valores padrão podem ser alterados no arquivo-m, ou podem ser mudados para cada imagem individual.<ol>
<li>Conjunto espacial derivado gradiente limiar. Nota: Valores mais altos resultam em mais pontos selecionados no isolamento da linha central. Valores que são muito alto ou muito baixo (fora de um intervalo de aproximadamente 3.0-7,9) podem resultar em ineficiência computacional ou uma seleção imprecisa dos pontos da linha central, gerando isolamento imprecisa da linha central (ver Figura 2A-C).</li>
		<li>Definir a escala em unidades de pixels/escala.</li>
		<li>Defina os limites superiores e inferiores espaciais para a região de interesse. Nota: Por convenção do nosso laboratório, a região definida de interesse é entre 30 e 105 nm da borda do GJ2,3,10.</li>
		<li>Definido início automático/manual. Na maioria dos casos, o algoritmo detecta com precisão o ponto de partida onde as extremidades de junção de lacuna e perinexus começa. No entanto, em alguns casos de perinexi irregulares, o usuário deve identificar o ponto de partida manualmente. Defina esse valor como 0 para automático, 1 para manual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione a imagem desejada. Nota: Seleccione a pasta do arquivo pode ser alterada no arquivo-m.</li>
	<li>Recorte a imagem para selecionar o perinexus de interesse.<ol>
<li>Quando a imagem aparece, o cursor mudará automaticamente para uma cruz. Recorte a imagem arrastando uma caixa ao redor da perinexus de interesse (ver Figura 3). A caixa de colheita pode ser ajustada usando-se os quadrados sobre os lados e cantos para torná-lo maior ou menor.</li>
		<li>Ao corte, certifique-se a extremidade "aberta" do perinexus (mais afastada do GJ, ver Figura 3) é cortada para que a dois membrana contornos atingir a borda da imagem recortada. Nota: É recomendável tornar a imagem em tela inteira para ver o perinexus de interesse e mais facilmente cortar adequadamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione a safra final clicando com o cursor entre as bordas opostas a ser medido. Nota: É fundamental que o clique duplo ser realizada dentro do perinexus. Se o programa não consegue identificar uma linha de centro, reinicie o programa e certifique-se de que o clique ocorre dentro do perinexus.</li>
	<li>Observe o final da linha central após todas as dilatações e erosões pop para uma avaliação de usuário final da eficácia do programa. Nota: Uma caixa de diálogo aparecerá na tela enquanto o programa está sendo executado para informar ao usuário que o Matlab será incapaz de processar quaisquer comandos adicionais, até que o programa tenha terminado. Quanto tempo leva este processo depende do tamanho da matriz (imagem) e poder de processamento de computador.</li>
	<li>Se o ponto de partida manual é habilitado, observar a imagem da linha de centro pop-up sobre a imagem anatômica original, juntamente com um cursor de mira (ver Figura 2). Selecione um ponto fora do perinexus perto do ponto inicial desejada. Nota: O programa irá encontrar o ponto da linha central mais próximo ao pixel selecionado e usar isso como o ponto inicial.</li>
	<li>Registro de dados. Nota: Quando o programa tiver terminado, o programa retornará uma linha central mapeada, trama de largura perinexal em função da distância da borda da GJ. Além disso, o programa irá retornar a largura média perinexal até 150 nm da borda do GJ, bem como a média de dentro da região definida do interesse na linha de comando do Matlab. Valores dep W e distâncias desde o GJ são armazenadas na variável "WpList" ou o usuário pode registrar manualmente-los separadamente.</li>
</ol>4. algoritmo de solução de problemas
<ol><li>Se a central não estiver devidamenteidentificados (Figura 2),Abra a figura "Gmag" e usar o índice para identificar um limite de gradiente apropriado (Figura 2C).</li>
	<li>Se o ponto de partida não é identificado corretamente, defina o ponto inicial manualmente (ver protocolo 3.8).</li>
</ol>

<ol><li>Rhett, J. M., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perinexus%3A+a+new+feature+of+Cx43+gap+junction+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">The perinexus: a new feature of Cx43 gap junction organization.</a> Heart Rhythm. 9 (4), 619-623 (2012).</li>
<li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+may+constitute+a+cardiac+ephapse%3A+an+experimental+and+modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li>
<li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+sodium+dependence+of+the+conduction+velocity-calcium+relationship%3A+evidence+of+ephaptic+self-attenuation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).</li>
<li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+modulate+ephaptic+coupling%3A+an+experimental+and+modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Potassium channels in the Cx43 gap junction perinexus modulate ephaptic coupling: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2016).</li>
<li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx43+associates+with+Na%28v%291.5+in+the+cardiomyocyte+perinexus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus.</a> Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).</li>
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<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+methods+of+automated+quantification+of+gap+junction+distribution+and+interstitial+collagen+quantity+from+animal+and+human+atrial+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections.</a> PLoS One. 9 (8), 104357(2014).</li>
<li>Papari, G., Petkov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+pseudo+dilation+for+gestalt+edge+grouping+and+contour+detection%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Adaptive pseudo dilation for gestalt edge grouping and contour detection.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 17 (10), 1950-1962 (2008).</li>
<li>Limprasert, W. PathFinding. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34966-pathfinding">www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34966-pathfinding</a> (2012).</li>
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<li>Hosny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+vendor-specific+tags%3A+Three-dimensional+printing+of+echocardiographic+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Unlocking vendor-specific tags: Three-dimensional printing of echocardiographic data sets.</a> Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 155 (1), 143-145 (2018).</li>
<li>Cretoiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiac+telocytes%3A+3D+imaging+by+FIB-SEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human cardiac telocytes: 3D imaging by FIB-SEM tomography.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2157-2164 (2014).</li>
<li>Risi, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28607071">Ca(2+)-induced movement of tropomyosin on native cardiac thin filaments revealed by cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6782-6787 (2017).</li>
<li>Dhindwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-EM-based+model+of+phosphorylation-+and+FKBP12.6-mediated+allosterism+of+the+cardiac+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">A cryo-EM-based model of phosphorylation- and FKBP12.6-mediated allosterism of the cardiac ryanodine receptor.</a> Science Signaling. 10 (480), (2017).</li>
<li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cardiac+magnetic+resonance+imaging+with+three-dimensional+electroanatomic+mapping+to+guide+left+ventricular+catheter+manipulation%3A+feasibility+in+a+porcine+model+of+healed+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).</li>
<li>van Heeswijk, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Self-Navigated+T2+Mapping+for+the+Detection+of+Acute+Cellular+Rejection+After+Orthotopic+Heart+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Direct%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Self-Navigated T2 Mapping for the Detection of Acute Cellular Rejection After Orthotopic Heart Transplantation.</a> Transplant Direct. 3 (4), 149(2017).</li>
<li>Valinoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+patient-specific+models+for+left+atrium+characterization+to+support+ablation+in+atrial+fibrillation+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">3D patient-specific models for left atrium characterization to support ablation in atrial fibrillation patients.</a> Magnetic Resonance Imaging. 45, 51-57 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O algoritmo usa dilatações imagem serial para contar o número de pixels entre duas arestas opostas de 2D em uma imagem binária, que neste caso é a separação de membrana inter do perinexus2,3,14. Um derivado espacial e um algoritmo de pathfinding são usados para isolar a linha central, seguida por uma sequência de dilatação e erosão secundária para preencher as lacunas na linha central, semelhante ao que foi feito antes de15. A linha central é então combinada com a imagem de dilatação-contagem final para representar a largura de perinexal em função da distância do início da separação de borda, neste caso, o fim do GJ e o início do perinexus16.
Quatro parâmetros primários são definidos pelo usuário em uma GUI no início do programa:
<ol><li>Limite de gradiente</li>
	<li>Escala</li>
	<li>Região de intervalo de interesse</li>
	<li>Iniciar o método de seleção de ponto (manual ou automático)</li>
</ol>O mecanismo mais comum de falha para o algoritmo é o fracasso da linha de centro para alcançar a borda da imagem, que é como o ponto de extremidade é determinado para o algoritmo de pathfinding. Para corrigir um problema, o usuário pode aumentar o limiar de gradiente descrito na etapa 3.3.1, que fará com que o programa selecionar mais pontos fora a imagem espacial de derivativos, que irá aumentar o tempo de computação necessário pelo algoritmo de pathfinding. Portanto, este algoritmo requer um compromisso entre a integridade de velocidade e a linha central de computação. É importante observar que enquanto todos os pontos da linha de centro são identificados a partir da derivada espacial, juntamente com um ponto de partida adequado, o limiar de derivativos espacial não terá efeito sobre a medição de separação de borda.
Orientação de imagem parece afetar valores de dilatação, porque o kernel dilata em passos de 90 graus, o que podem introduzir um erro se a maioria da região de interesse é em um ângulo de 45° para os eixos de matrizes de dilatação. Consequentemente, a contagem de dilatação não pode ser sempre uma representação exata do espaço entre as bordas. Essa limitação tem sido abordada por um fator de correção trigonométrica, mas potencialmente poderia ser ignorada, se todas as imagens em um dataset são alinhadas na mesma orientação. Além disso, o cuidado deve ser usado na interpretação de resultados, como é possível que os planos de corte não são perfeitamente perpendiculares às duas membranas. Figura 9B, usamos GJW para sugerem que nossas imagens perinexus no plano. Ainda assim, é imperativo que os tamanhos de amostra ser suficientemente grande para conta para qualquer corte variações entre imagens. Além disso, nossas medições de largura de perinexal não devem ser interpretadas para refletir na vivo espaços, mas esta abordagem é usado para medir diferenças de largura de perinexal em relação a algum estado de intervenção ou doença.
O algoritmo atual também exige um contorno manualmente tracejamento das bordas como uma entrada. É importante notar que enquanto a escala é definida corretamente, resolução espacial não tem efeito sobre as medições do algoritmo, como demonstram as diferentes resoluções de imagens na Figura 6 e uma imagem de baixa resolução adicional em suplementar arquivo S6. O próximo passo para melhorar o algoritmo está removendo a intervenção humana de geração de contorno juntamente com uma ferramenta que pode selecionar a área de interesse. Estas características provavelmente iria melhorar a precisão da medição e reduzir o viés de usuário.
Este algoritmo computacionalmente eficiente fornece um método mais rápido, que requer aproximadamente um quinto as horas de trabalho, de quantificar o perinexus sem pena detectável de reprodutibilidade quando comparado com o processo de segmentação manual. Além disso, o processo de segmentação manual utiliza uma medição cada 15 nanômetros para quantificar a largura de perinexal, que pode levar a sob amostragem como a separação de membrana da perinexus pode mudar substancialmente dentro do intervalo 15 nm. Em contraste, o programa automatizado tem uma igual da modalidade de imagem, neste caso 2,9 pixels por nanômetros, o comprimento do perinexus, portanto, entregando uma média mais finamente resolvida de perinexal largura de resolução espacial.
Enquanto as aplicações no campo da biologia estrutural cardíaca são promissores e excitante, usos deste algoritmo não se limitam às imagens TEM. Qualquer campo que exijam uma medição precisa, de alta resolução de duas bordas 2D quase paralelas pode usar desse algoritmo. O algoritmo pode ser usado para rastrear qualquer coisa a partir de padrões de erosão e inundação de margem de imagens de satélite para desenvolvimento vascular com microscopia brightfield ou fluorescente. Uma das mais promissoras aplicações potenciais é no campo da Cardiologia e medir a fração de ejeção ventricular (EF) com ecocardiografia cardíaca point-of-care. Atualmente, a norma técnica é o método de biplano de discos17, embora um algoritmo mais recente, AutoEF, atualmente é o método de vanguarda EF-quantificando18,19. Para método de biplano de discos, a câmara em questão é traçada manualmente e quantificados usando o método de um modificado de Simpson, pelo qual volume global é automaticamente calculado pelo somatório de discos empilhados de elípticos. A principal limitação deste método é que ele pode retornar apenas a área transversal total da câmara desejada, com nenhuma resolução para identificar regiões específicas de interesse e também exige especialização e substancial entrada humana. O método mais recente, AutoEF, identifica e descreve a borda do ventrículo usando um algoritmo de salpicar 2D e depois calcula a área de seção transversal ventricular. Neste processo, enquanto precisos e eficientes para medir a área bruta ventricular, também tem uma semelhante limitação inerente de apenas medir a área de seção transversal total. Este inconveniente principal limita as capacidades de diagnóstico e tratamento clínicos. Em contraste, o algoritmo apresentado neste manuscrito pode identificar uma linha média e tem uma resolução igual à resolução da modalidade de imagem para identificar regiões específicas de interesse. Isto é importante porque scanners de ultra-som com resolução espacial de micrômetro são comercialmente disponíveis20,21, implicando que este algoritmo poderia detectar anormalidades de movimento de parede localizada na resolução de micrômetros em vez de centímetros. Enquanto este aplicativo precisa ser validado experimentalmente, é uma das aplicações mais imediatamente promissoras deste algoritmo. Na verdade, ele poderia facilmente ser combinado com o salpico recursos de AutoEF de controle ou os traços manuais utilizaram em planimetria manual para fornecer informações de alta resolução em paralelo com dados EF convencionais.
Tão versátil e aplicável, como é o algoritmo atual, ele foi desenvolvido para imagens 2D. No entanto, como tecnologias de imagem continuam a melhorar, há uma crescente demanda por tecnologias de quantificação de D 3 e 4. Portanto, a próxima iteração do algoritmo é adaptar-se a mesma abordagem, dilatando serialmente uma imagem binária, para um objeto 3-dimensional, onde automaticamente definir uma linha de centro é atualmente além das capacidades dos programas de imagem atuais. Tal algoritmo teria aplicações largas tanto clinicamente e experimentalmente no campo cardíaco sozinho, incluindo 3D ecocardiogramas cardíaca22,23, microscopia de elétron 3D24,25, 26e 3D ressonância magnética de28,de27,29.

O seguinte algoritmo foi desenvolvido para medir a distância intermembranar entre dois cardiomyocytes estruturalmente acoplados no ponto separam uns dos outros na borda de uma chapa de junção de lacuna em um nanodomain o perinexus1, que tem sido implicada em ephaptic acoplamento2,3,4,5. Em processo de análise de centenas de imagens de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão de perinexi usando um método de segmentação manual em um anterior estudo6, identificou-se a necessidade para um método de maior rendimento que amostradas largura perinexal no mais alto resolução espacial preservando a precisão do processo de segmentação manual anterior durante a segmentação manual, as linhas são desenhadas em intervalos de 15 nm, aproximadamente ortogonais à linha central, para medir a largura de perinexal. O novo algoritmo leva um contorno binário grosso de um pixel de duas linhas paralelas e usa dilatações imagem serial para contar o número de pixels entre as duas membranas. Enquanto dilatações de imagem comumente têm sido usadas em uma infinidade de aplicações de processamento de imagem, incluindo o contorno ou borda deteção7,8, este algoritmo usa dilatações como um mecanismo de contagem. A linha central é então isolado usar uma largura de9 e perinexal de algoritmo pathfinding é então medido com uma resolução ao longo do comprimento de perinexus igual a resolução da imagem. Neste caso, a diferença de resolução é 1 medição por 15 nm para segmentação manual e 1 medição por 0,34 nm com o novo algoritmo, um 44-fold aumento da frequência de amostragem espacial. Além disso, este aumento frequência de amostragem é realizada em aproximadamente 1/5th o tempo necessário para segmentação manual.
Este algoritmo será usado em sua forma atual para medir a largura de perinexal para o convencional 0-150 nm da borda de um fosso junção placa5 (GJ), bem como dentro de uma região especificada de interesse, onde o perinexus platôs entre 30 e 105 nm2 , 3 , 10. a maior frequência de amostragem reduz a variabilidade nas medições individuais perinexus comparado a segmentação manual e significativamente encurta o tempo de análise, permitindo processamento eficiente de grandes conjuntos de dados. No entanto, este programa não está limitado a imagens de nanoescala TEM de discos intercalados cardíacas. A mesma abordagem pode ser usada para quantificar o diâmetro vascular, fração de ejeção ventricular ou até mesmo não-biológico fenômenos como Rio erosão ou inundações. Este algoritmo é apropriado para quantificar a distância entre quaisquer duas bordas quase paralelas.

<table><tbody><tr><td>Monitor Touchscreen</td><td>Dell</td><td>S2240T</td><td>Precisa de caneta de ponta macia</td></tr><tr><td>Desktop</td><td>Dell</td><td>Precision T1650</td><td>8GB RAM</td></tr><tr><td>Sistema operacional</td><td>Microsoft</td><td>Windows 7 Enterprise</td><td>SO de 64 bits</td></tr><tr><td>Plataforma do programa</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2015b</td><td>O programa pode ser incompatível com versões mais recentes/antigas do Matlab</td></tr></tbody></table>

quantificar intermembranar distâncias com dilatações imagem serial

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

Um nanodomain recentemente descrito extracelular, denominado o perinexus, tem sido implicada em ephaptic de acoplamento, que é um mecanismo alternativo para a condução elétrica entre cardiomyocytes. O método atual de quantificar este espaço por segmentação manual é lento e tem baixa resolução espacial. Desenvolvemos um algoritmo que usa dilatações imagem serial de um contorno binário para contar o número de pixels entre dois opostos 2 bordas dimensionais. Este algoritmo requer poucos homens-horas e tem uma resolução espacial maior do que o método manual, preservando a reprodutibilidade do processo manual. Na verdade, experientes e investigadores de principiante foram capazes de recapitular os resultados de um estudo anterior com esse novo algoritmo. O algoritmo é limitado pelo humana entrada necessários manualmente delinear o perinexus e o poder computacional principalmente oneradas por um algoritmo de pathfinding pré-existente. Entretanto, o algoritmo para recursos de alta produtividade, alta resolução espacial e reprodutibilidade tornam uma ferramenta de medição versátil e robusto para uso através de uma variedade de aplicações que exigem a medição da distância entre quaisquer 2-dimensional (2D ) as bordas.

O objetivo desse algoritmo é continuamente medir a distância entre duas arestas 2-dimensional usando pathfinding e dilatações imagem serial. Esse algoritmo pode ser aplicado a uma variedade de campos como cardíaca biologia estrutural, biologia vascular e engenharia civil.

Quantificar intermembranar distâncias com dilatações imagem Serial

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo eletrofisiológico cardíaco, sobre a estrutura do espaço extracelular e mecanismos de comunicação celular. As principais vantagens desta técnica são que ela tem alta capacidade de rendimento e uma melhor frequência de amostragem espacial. Essencialmente, podemos obter medições mais rapidamente e com maior confiança do que antes.A identificação perinexus e a solução de problemas do programa são difíceis de aprender sem demonstração visual, porque o perínxo é uma estrutura relativamente recém-definida, e a solução de problemas pode não ser intuitiva para investigadores que não estão familiarizados com o MATLAB. Para imagens em escala de cinza, use um software de computação numérica para garantir que nenhum pixel tenha uma intensidade superior a 255. Em seguida, abra nossa imagem emparelhada no software de processamento de imagens e amplie o perinexus.É fundamental identificar adequadamente o perínxo. O primeiro passo é identificar uma placa de junção de lacunas, que tem uma aparência listrada. Então, procuramos por duas membranas opostas, em avião, para cerca de 200 nanômetros.Identifique a placa de junção da estrutura pentylaminer. O início do perínxo é o ponto em que as duas bicamadas de membrana celular oposta divergem. Exibir uma barra de escala em nanômetros.Os pontos de partida e final do contorno perínxo serão de 200 nanômetros desde o início do perínxo. Em seguida, selecione a ferramenta de seleção à mão livre. Clique e arraste, ou use uma caneta para traçar cuidadosamente ao longo da membrana interna de uma célula, até o início do perínxo, e voltar ao longo da membrana interna da segunda célula.Feche a área selecionada liberando o botão do mouse ou levantando a caneta. Em seguida, defina a largura da linha para um pixel, e a cor do primeiro plano para o valor de maior intensidade para o tipo de imagem. Como branco, para imagem em escala de cinza.Crie um esboço traçado a partir da seleção e salve a imagem resultante como um tipo de arquivo compatível com o software de análise, como JPEG ou TIFF. Se necessário, abra o software de análise de distância de separação da membrana e altere os locais de salvamento para que os dados e números sejam gerados. Salve o arquivo e feche-o.Então, execute o programa. Defina o limiar de gradiente de derivada espacial adequadamente para identificação da linha central. Defina a escala e os pixels por comprimento da unidade.Estabeleça os limites espaciais inferiores e superiores para a região de interesse, no que diz respeito à borda da junção de lacunas. Selecione a detecção automática ou manual do ponto de partida. A detecção manual do ponto de partida pode ser necessária para perinexi em forma irregular.Em seguida, abra a imagem com o perinexo delineado. Clique e arraste para desenhar uma caixa ao redor do perínxo, excluindo a extremidade fechada. Clique duas vezes dentro do contorno perínxo traçado para cortar a imagem e identificar a linha central.Se o ponto de partida for selecionado manualmente, um cursor de mira e linha central aparecerão sobre a imagem original. Selecione um ponto fora do perínxo perto do ponto de partida desejado para continuar o processo. Uma vez terminado o processo, confirme que a linha central permanece dentro do perínxo, e cruza adequadamente o ponto de partida.Revise os dados gerados e plote a largura perinexal. Se a linha central não estiver devidamente identificada e isolada, abra a matriz de imagem g-mag para determinar um limiar de gradiente apropriado. Usamos a ferramenta de índice para clicar em torno da linha central, e o array g-mag para ter uma ideia de qual pixel queremos que o algoritmo de localização da linha central selecione.O limiar de gradiente deve então ser definido um pouco acima do valor de intensidade desses pixels. Selecione a ferramenta de índice e clique na linha central e ao redor para exibir o valor do índice dos pixels que devem ser selecionados. Defina o limiar de gradiente de derivativo espacial para um pouco acima do valor do índice e execute o processo novamente.Se o ponto de partida não for detectado corretamente no processo automatizado, execute o programa novamente usando detecção manual de ponto de partida. Neste processo, contornos manuais são dilatados em incrementos de um pixel para contar o número de pixels entre as duas bordas. Cada incremento é adicionado a uma imagem de trabalho para gerar uma derivada espacial.O contorno original e a linha central são descontinuidades em sua magnitude. Depois de isolar a linha central, ela é refinada por dilatação, erosão e um algoritmo de pathfinding. A largura perinexal é apresentada em função da distância desde o início do perínxo, ou dentro de uma região de interesse, e como uma média de ambas as funções.À medida que a orientação perínxo mudou, foram observadas subestimações na largura perínxe, dependendo do padrão de dilatação. A correção trigonométrica produziu resultados fortemente correlacionados com imagens giradas para orientar horizontalmente o perínxo. O algoritmo foi validado para diferentes resoluções espaciais, unidades de referência e tamanhos de imagem.Usuários experientes e inexperientes rastrearam o contorno mais rápido do que segmentaram manualmente a imagem. E o processo automatizado teve uma resolução espacial significativamente maior. Observadores experientes e inexperientes identificaram com precisão diferenças significativas na largura perinexal entre pacientes com e sem fibrilação atrial pré-existente.Esses observadores também não identificaram com precisão nenhuma diferença significativa entre as larguras absolutas de junção de lacunas na mesma população. As larguras de junção perinexal e gap foram consistentes com os relatórios anteriores. Ao tentar este procedimento, lembre-se de tomar seu tempo com o contorno, pois mesmo pequenos desvios da membrana podem produzir erros substanciais nesta escala.Geralmente, indivíduos novos neste método lutam porque não estão familiarizados com a estrutura que estão medindo, ou não têm certeza de como solucionar problemas para iniciar a identificação de pontos ou desvio de linha central. Ver esse método de processamento de imagem realizado é fundamental. Como a identificação perinexus e a solução de problemas de algoritmo são difíceis de aprender sem ele.E queremos garantir que estamos quantificando o que dizemos que estamos medindo. Essa técnica abre caminho para pesquisadores do campo da saúde cardíaca, explorar maior quantificação de resolução de muitos níveis de função cardíaca. Da nanoescala, espaços extracelulares à determinação clínica de eficiência ventricular ou disfunção.Embora este método tenha sido demonstrado com imagens de eletromicroscopia, também pode ser aplicado a outras técnicas de imagem, como a ecocardiografia cardíaca para quantificar com mais precisão a função mecânica do coração. Este método pode encontrar aplicações em qualquer campo de imagem porque o programa pode medir o espaço entre duas bordas definidas, se a escala for definida adequadamente, e as bordas estiverem quase paralelas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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