Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo dos biomateriais, como como as interações de matriz celular afetam o sulfato. A principal vantagem dessa técnica é que ela gera o primeiro material que reflete com precisão os microambixos bioquímicos do córtex renal nativo. Forrar um capuz de cultura de tecido com um bloco.

Coloque um béquer de um litro contendo uma barra de agitação, um prato de cultura de tecido estéril de 150 milímetros e todo o rim no capô. Encha o béquer com 500 mililitros de solução 1%SDS. Coloque o rim no prato de cultura tecidual estéril.

Remova toda a gordura perirenal raspando levemente ao redor da cápsula renal com um bisturi. Em seguida, faça uma incisão superficial de 8 a 10 centímetros através da extremidade superior do rim, para quebrar a cápsula renal sem danificar o tecido córtex subjacente. Use dois grampos de hemostat para remover a cápsula renal descascando-a do tecido córtex.

Bissecte o rim ao longo do plano coronal usando o bisturi ao longo do lado lateral do rim. Isole o tecido córtex de ambas as metades esculpindo a região do medullar com o bisturi. Em seguida, pique o tecido do córtex em pedaços cubos de 0,5 centímetros, e remova quaisquer vasos grandes e visíveis.

Para isolar a matriz extracelular do rim, coloque o tecido córtex picado no béquer contendo solução SDS. Cubra o béquer com papel alumínio autoclavado e coloque-o em uma placa de mexida a aproximadamente 400 RPM, fora da capa de cultura tecidual. Depois de 24 horas de agitação, traga o béquer para um capuz de cultura de tecidos.

Adicione um coador de células estéreis de 40 mícrons feito com malha de nylon. E então, encha um béquer separado de 1000 mililitros com 200 mililitros de alvejante, e coloque-o no capô da cultura tecidual. Descarte a solução SDS através do coador de células, no béquer contendo alvejante.

Pipet fora qualquer solução SDS restante, até que apenas tecido descelularizado e o coador celular permanecem no béquer. Deixe o coador de células no béquer e adicione 500 mililitros de solução SDS fresca. Cubra o béquer com a mesma folha de alumínio e coloque em uma placa de mexida na mesma velocidade de antes.

Após a descelularização e lavagem, transfira o tecido descelularizado, chamado de ECM renal a partir deste ponto, para um tubo cônico auto-permanente de 30 mililitros. E preenchê-lo com água de grau de cultura celular, até que todo o tecido esteja submerso. Primeiro, use um homogeneizador de tecido para homogeneizar o ECM renal no tubo cônico por dois minutos, até que uma solução opaca sem pedaços visíveis de ECM seja obtida.

Em seguida, submergir o tubo cônico contendo o ECM renal em nitrogênio líquido até que a ebulição ao redor do tubo não persista mais. Armazene o ECM do rim a menos 4 graus Celsius durante a noite. Para liofilizar o tecido descelularizado congelado, solte ligeiramente a tampa cônica do tubo para permitir a troca de gás e coloque o tubo em uma máquina de liofilização.

Lyophilize o ECM do rim por três dias, ou até que se assemelhe a um pó branco fino. Para digerir quimicamente e solubilizar o gel, adicione a pepsina gástrica porcina cuidadosamente ponderada e 0,01 ácido clorídrico normal a uma vile de cintilação contendo uma barra de agitação. Mexa a aproximadamente 500 RPM, até que toda a pepsina tenha dissolvido.

Em seguida, transfira o ECM renal liofilizado para o vile de cintilação e deixe a solução em uma placa de agitação a aproximadamente 500 RPM por três dias para fazer o hidrogel ECM do rim de estoque. Em uma capa de cultura de tecido, pipet os volumes necessários de mídia de cultura celular, um hidróxido de sódio normal e suplemento M199, em um tubo cônico auto-permanente de 30 mililitros estéreis. Misture a solução de reagente neutralizante com uma micro espátula.

Use uma seringa estéril de um mililitro para transferir o volume apropriado de hidrogel ECM do rim de estoque para a solução de reagente neutralizante. Use uma micro espátula para misturar suavemente a solução até obter uma solução de hidrogel homogênea. Evite introduzir bolhas de ar mexendo lentamente e suavemente.

Para incorporar células no hidrogel ECM do rim, resuspenncie 300 mil células em 10 microliters de médio para cada hidrogel. Pipet 10 microliters de suspensão celular no gel ECM do rim final. Misture a solução com uma micro espátula até que as células sejam distribuídas uniformemente.

Use uma seringa de um mililitro para preencher o dispositivo de cultura celular desejado com o hidrogel ECM rim. Deixe que o gel se estafina a 37 graus Celsius durante uma hora antes de transferir ou emplacar as células para o ECM renal no dispositivo de cultura celular. A análise do tecido córtex descelularizado por espectrometria de massa revelou a presença de proteínas associadas à lâmina de manjericão, sendo o Colágeno-IV e o Colágeno-I os mais representados.

As cadeias de colágeno-IV, A1 e A2, onipresentes em todas as membranas do porão foram conservadas. Também foram detectadas cadeias de colágeno-IV, A3 e A5, presentes apenas em membranas de porão do glomerulus. Formas iso comuns de Laminins e Colágeno-I também foram detectadas.

As células endoteliais microvasculares peritubulares peritubulares do rim humano, ou HKMECs, cultivadas em Colágeno-I, ECM renal, e um gel de mistura 1:1, apresentaram diferenças no fenótipo. HKMECs cultivados em Colágeno-I, exibiram expressão cd31 uniforme, visto em vermelho. Enquanto os HKMECs cultivados nos dois géis contendo ECM renal, exibiram expressão cd31 reduzida em distribuições irregulares.

O tipo de matriz não parecia afetar a expressão VWF, mostrada em verde. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de homogeneizar totalmente o tecido do córtex renal descelularizado. Além disso, ao misturar o gel com reagentes neutralizantes, evite a introdução de bolhas de ar.

Sistemas micro fisiológicos permitem o estudo da função do órgão em um ambiente laboratorial controlado. A criação desses sistemas requer a implementação de células, matrizes e estímulos. O hidrogel kECM fabricado aqui.