Detecção e isolamento de corpos Apoptotic de alta pureza

O objetivo geral deste protocolo é detectar e isolar corpos apoptóticos em alta pureza. Os corpos apoptóticos são um tipo de vesículas extracelulares geradas para ajudar na indução da hematose. Eles são o maior tipo de família física extracelular, normalmente variando de um a cinco micrômetros de diâmetro.

Agora está se tornando aparente que os corpos apoptóticos podem ajudar nos processos celulares, como a depuração celular apoptótica e a comunicação intracelular. Portanto, o desenvolvimento de uma metodologia precisa para detectar, quantificar e isolar corpos apoptóticos é fundamental para a personalização de suas funções e mecanismos. Nesta série de preparações, mostraremos como detectar, quantificar e isolar corpos apoptóticos de amostras apoptóticas.

Parte A, a indução da apoptose. Para induzir a apoptose em linhagens celulares, como os monócitos THB1, primeiro comece coletando as células. Conte as células e colete aproximadamente 10 milhões de células ou conforme necessário.

Recomendamos 10 milhões para análise de corpos apoptóticos. Aloqua dois milhões de células por poço de uma placa de seis poços. Remova a tampa da placa de seis poços e das células UV usando o UV Stratalinker 1800.

Irradiar células a 150 milijules por centímetro quadrado. Essa irradiação deve levar aproximadamente 30 a 60 segundos. Após a conclusão da irradiação, incube as células por duas a oito horas, dependendo da linhagem celular.

Nesse ponto, as células devem exibir morfologias apoptóticas, como sangramento apoptótico e formação de corpo apoptótico. Colete células apoptóticas com uma pipeta P1000. Colete aproximadamente 1/10 da amostra apoptótica para todo o controle da amostra apoptótica.

Colete também uma amostra não tratada ou viável. Centrifugar a amostra apoptótica inteira e a amostra não tratada a 3 000 g durante seis minutos. Suspenda novamente no PBS e reserve no gelo.

Para isolamento de corpo apoptótico, continue para a etapa B ou CB, Isolamento de corpo apoptótico usando FACS. Centrifugar a amostra apoptótica restante a 3 000 g durante seis minutos. Remover o sobrenadante da amostra apoptótica restante.

Suspender novamente a amostra apoptótica restante numa solução de coloração contendo a coloração nexum 550 e topo three durante 10 minutos, à temperatura ambiente, na obscuridade. Após a centrifugação, ressuspenda em tampão FACS e, em seguida, filtre através de um filtro de células de 70 mícrons para garantir que as células sejam separadas com eficiência. Execute uma configuração padrão da máquina FACS.

Adquira toda a amostra apoptótica e altere as configurações de tensão para garantir que todos os eventos estejam dentro dos bots FACS e as populações possam ser facilmente separadas. Configure a estratégia de gating conforme descrito na seção de estratégia de gating de citometria de fluxo posteriormente. Selecione a população de corpos apoptóticos fechados e o número desejado de corpos apoptóticos para coleta.

Execute uma classificação inicial para confirmar as configurações de classificação e a pureza do corpo apoptótico. Depois que uma classificação for executada, execute um black flush do sistema e analise novamente a amostra classificada. Se a alta pureza for alcançada, continue a classificar o número desejado de corpos apoptóticos.

Quando a classificação estiver concluída, pegue uma pequena porção da amostra de corpo apoptótico pro sort e analise novamente para confirmar a pureza. Parte C, isolamento do corpo apoptótico por centrifugação diferencial. Centrifugue a amostra apoptótica restante a 300g por 10 minutos.

Esta etapa de centrifugação separará as células, incluindo células apoptóticas, células viáveis e células necróticas de pequenas vesículas extracelulares, que permanecerão no sobrenadante. Em um novo tubo de falcão, colete o sobrenadante contendo as vesículas extracelulares. Suspenda novamente a facção enriquecida com apoptose em PBS e reserve no gelo com as amostras apoptóticas não tratadas e inteiras.

Centrifugar o sobrenadante recolhido contendo os corpos apoptóticos a 3 000 g durante 20 minutos. Remova o sobrenadante contendo as vesículas extracelulares menores, tomando cuidado para não romper o pellet que conterá os corpos apoptóticos. Suspenda novamente os corpos apoptóticos em PBS e colete 100 microlitros de cada amostra apoptótica inteira não tratada, as células apoptóticas enriquecidas e os corpos apoptóticos enriquecidos com a amostra e corar com a solução de coloração nexum cinco e topo três.

Fique no escuro por 10 minutos em temperatura ambiente antes de realizar a análise de citometria de fluxo. Analise conforme descrito na estratégia de gating definida. Parte D, estratégia de gating de citometria de fluxo.

Para iniciar a análise de citometria de fluxo, separe as células necróticas altas do topo três de todos os outros eventos, comparando os topos três e quatro. A partir dos eventos de não permeabilização, execute a próxima porta. Selecione os eventos de não permeabilização e compare uma dispersão lateral com um nexo cinco.

Selecione duas populações, incluindo uma dispersão lateral intermediária em alta, um nexo cinco células baixas a intermediárias. Esta população é P1. Crie também uma segunda população incluindo todos os outros eventos. Esta população é P2. P1 conterá células viáveis e células apoptóticas precoces.

P2 conterá todos os eventos apoptóticos e detritos. Selecione P2 para fechar mais. De P2, remova todos os detritos comparando o topo três com o nexum cinco.

Selecione todos os eventos intermediários e altos do nexum cinco. Essa população agora incluirá todos os corpos apoptóticos e células apoptóticas. Selecione essa população.

Para separar corpos apoptóticos de células apoptóticas, compare a dispersão total com o nexo cinco. Para selecionar corpos apoptóticos, selecione dispersão total baixa. Para selecionar células apoptóticas, selecione eventos intermediários a altos de dispersão total.

Ao realizar o isolamento de corpo apoptótico por FACS, recomendamos realizar uma estratégia final de gating selecionando a fração de corpo apoptótico e visualizando-a por topo três versus nexum cinco. Selecione todos os eventos. Isso é usado para selecionar a estratégia de passagem com base na florescência, em vez de dispersão total e nas propriedades de dispersão lateral para aumentar a precisão da classificação.

Para identificar células viáveis, volte para a população P1. Para análise geral de células viáveis, selecione P1 e compare a dispersão total com o nexo cinco. Selecione todas as células de dispersão completa intermediárias a altas.

Isso incluirá todas as células viáveis, removendo quaisquer detritos restantes. Alternativamente, para uma análise mais aprofundada da apoptose, as células apoptóticas viáveis e precoces podem ser separadas. Para isso, compare a dispersão total do topo três versos.

As células viáveis serão topo três baixo, dispersão total intermediária a alta. As células apoptóticas iniciais contêm coloração intermediária do topo três. Toda essa estratégia de gating pode então ser aplicada a todas as amostras que estão sendo analisadas.

Por exemplo, para os corpos apoptóticos isolados após FACS. Aplique a estratégia de gating a todas as amostras. A pureza corporal apoptótica pode então ser preparada.

Por exemplo, selecionando apenas as populações positivas do nexo cinco, comparando a dispersão total e o nexo cinco. Isso, portanto, demonstra os corpos apoptóticos pós-isolamento. Resultados representativos.

A análise por citometria de fluxo foi realizada para confirmar a indução de apoptose. Essa estratégia de gating permite a identificação de células viáveis, células apoptóticas precoces, células apoptóticas tardias e células necróticas na amostra irradiada por UV. Esta metodologia demonstrou o isolamento de corpos apoptóticos por duas abordagens.

Em primeiro lugar, uma abordagem baseada em FACS, onde os corpos apoptóticos foram enriquecidos a 99% de pureza e uma abordagem de centrifugação diferencial onde os corpos apoptóticos foram isolados a 97% de pureza. Isso foi confirmado por citometria de fluxo, onde os corpos apoptóticos foram separados por células, incluindo células viáveis, células apoptóticas e necróticas. Conclusão. Nossa abordagem pode fornecer uma nova ferramenta para apoptose e pesquisa corporal apoptótica.

Contribuindo, portanto, para seus avanços na personalização desses mecanismos e para ajudar a produzir novos desenvolvimentos no direcionamento desses processos.