Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em vários campos de pesquisa de doenças metabólicas sobre alterações moleculares de energia hepática e biossíntese de proteínas na obesidade, fígado gorduroso não alcoólico e diabetes tipo dois. As principais vantagens dessa técnica são que facilita o isolamento de hepatócitos funcionais do camundongo primário e a detecção de proteínas nascentes hepáticas através de um substrato de rotulagem nãoradioativa. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o passo de perfusão é difícil de aprender por causa dos pequenos e finos vasos sanguíneos do rato.

Para perfusão hepática, insira cuidadosamente um cateter de calibre 24 na Veia Cava inferior ou IVC apenas na bifurcação com a veia renal direita. Remova a agulha do cateter mantendo a posição da cânula dentro do IVC e conecte uma cânula de 24 bitola com tubo de perfusão usando o conector. Comece a perfundar o fígado com HBSS quente menos a uma taxa de fluxo permanente de quatro mililitros cortando rapidamente a veia esplênica para drenar o sangue interno.

Após 10 minutos, perfume o fígado do rato com 35 mililitros de HBSS mais complementado com Colagenase Tipo X a uma taxa de fluxo de quatro mililitros por minuto, fixando a veia esplênica por cerca de 10 segundos a cada poucos minutos para facilitar a distribuição do perfusato em todo o fígado. Quando toda a Colagem foi perfundida, transfira o fígado para um tecido de laboratório antes de parar a bomba para evitar o fluxo de sangue no fígado. Use fórceps para remover a vesícula biliar e limpe suavemente o fígado com um tecido de laboratório fresco para remover qualquer sangue.

Coloque o fígado em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo cinco mililitros de HBSS fresco e quente, além de suplementado com Colagenase e use fórceps de ponta perdida para remover suavemente a cápsula hepática. Use os fórceps para dispersar cuidadosamente o tecido parenchímico e adicionar 15 mililitros de DMEM frio à placa de Petri. Agite o fígado rasgado suavemente para liberar as células parênquicas residuais no meio e adicione outros 15 mililitros de DMEM frio ao prato para adquirir o resto das células.

Em seguida, filtrar o chorume tecidual através de um coador de células de 100 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Para isolar os hepatócitos do camundongo primário, coletar as células por centrifugação e resuspensar a pelota em 10 mililitros de DMEM fresco. Camada cuidadosa das células sobre um buffer de gradiente de 40% de densidade para separação de gradiente de densidade, descartando as células das camadas superior e média após a centrifugação.

Resuspende a pelota hepatócida parêncal primária com dois a três mililitros do Médio E de William para evitar coletar células mortas da parede do tubo e transferir as células para um novo tubo de 50 mililitros. Misture as células com um adicional de sete a oito mililitros do William's E Medium antes da centrifugação e resuspenda a pelota em 10, 20 ou 30 mililitros de William's Medium E fresco, dependendo do tamanho da pelota. Após a contagem, semente seis vezes 10 para as quintas células para cada poço de uma placa de seis poços para uma incubação de duas a três horas a 37 graus Celsius.

Ao final da incubação, substitua o meio por DMEM suplementado com soro bovino fetal de 10% e anti-anti para remover as células mortas e nãoectadas e devolver as células à incubadora durante a noite. Para rotulagem de proteína nascente modificada por azida, adicione 20 a 40 microgramas de liseto celular a 50 microliters de tampão de reação 2X. Leve o volume para 80 microliters com água desorganizada desorganizada e vórtice a solução de proteína por cinco segundos.

Adicione cinco microliters de sulfato de cobre às células para outro vórtice de cinco segundos, seguido por cinco microliters de aditivo tampão de reação um com cinco segundos de vórtice. Após uma incubação de três minutos, adicione 10 microlitadores de aditivo tampão de reação reconstituída dois às células para outro vórtice de cinco segundos e gire a amostra por 20 minutos a quatro graus Celsius em uma máquina multi-rotadora protegida da luz. No final da rotação, adicione 300 microliters de metanol ao liseto, seguido por 75 microliters de clorofórmio, e 200 microliters de água dupla destilada.

Colete a proteína rotulada por centrifugação e adicione 250 microliters de metanol fresco à pelota. Após o vórtice, centrifufique o lise novamente e cubra a pelota nua com um tecido sem fiapos por 15 minutos à temperatura ambiente. Para análise page, solubilize a pelota seca em 20 microliters de tampão de carga sem beta-mercaptoetanol e vórtice a pelota por 10 minutos.

Em seguida, aqueça a proteína em um bloco de calor de 70 graus Celsius por 10 minutos e carregue a amostra em um gel de sulfato de dodecil de 10%sódio para detecção de tetrametillamina. Em seguida, use um scanner laser de modo variável para a quantitação precisa das proteínas nascentes rotuladas pela AHA. Histologicamente, hepatócitos primários vivos e ligados parecem tipicamente poligonais ou hexagonais em forma com um limite membrano claramente delineado após 24 horas de cultura.

Para confirmar se as células isoladas são hepatócitos primários, neste experimento, os níveis de expressão de proteína de albumina foram comparados em fibroblastos embrionários de camundongos, uma linha celular hepatoma de camundongos, hepatócitos primários isolados e fígados de camundongos. A expressão da proteína albumina foi detectada em hepatócitos de camundongos primários e fígados de camundongos, mas não foi detectável em ambos os fibroblastos embrionários do camundongo ou células da linha celular hepatoma. O tratamento primário de hepatócitos com rotenona micromolar por quatro a seis horas revelou uma indução robusta da quinase proteica resistente à proteína hepática amp, detectada pelo aumento dos níveis de fosforilação na kinase de proteína hepática ativada por AMP T172 semelhante à observada in vivo.

De fato, cinco horas de 10 tratamentos rotenonas micromolar tiveram efeitos inibitórios profundos na síntese de proteínas nascentes em hepatócitos primários tratados em comparação com células de controle não tratadas, como demonstrado por um ensaio de reação de ligadura quimosequitiva. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar todos os reagentes e médiuns necessários com antecedência. Essa técnica abriu caminho para o pesquisador no campo da fisiopatologia metabólica hepática explorar o mecanismo molecular de regulação de proteínas energéticas na obesidade e diabetes tipo dois em hepatocitte de camundongos primários isolados.