Fabricação de anisotrópica poliméricas Artificial células apresentadoras para ativação de células T CD8 +

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da aminoengenharia. Como, qual é o papel das propriedades físicas de partículas nas interações e ativação de células imunes biomaterial. A principal vantagem desta técnica é que ela permite um controle independente do tamanho e forma das partículas biomiméticas.

As implicações dessa técnica se estendem para a terapia do câncer, pois é uma terapia de partículas fora da prateleira que pode causar respostas imunes mediadas por células in vivo. Embora este método possa fornecer insights sobre a aminoterapia do câncer, ele também pode ser aplicado a outros sistemas. Como, doença infecciosa ou diabetes tipo Um.

Para a síntese de micropartículas, comece pesando 100 miligramas de poli (ácido cótico-coglicólico)ou PLGA, em um frasco de cintilação e dissolvendo o PLGA em cinco mililitros de diclorometano por vórtice. Coloque um homogeneizador em um béquer contendo 50 mililitros de 1%de álcool polivinyl, ou solução PVA, de modo que o homogeneizador esteja o mais próximo possível do fundo do béquer sem tocá-lo. Ligue o homogeneizador à velocidade apropriada e adicione a solução PLGA ao béquer por um minuto de homogeneização.

Ao final da homogeneização, despeje a solução de micropartículas PLGA de álcool polivinyl em um béquer contendo 100 mililitros de solução de 5%PVA em uma placa de mexida em uma capa química e mexa a solução por pelo menos quatro horas. Quando o solvente evaporar, despeje a solução de partículas em tubos cônicos de 50 mililitros e colete as partículas por centrifugação. Substitua o supernasal em cada tubo por 20 mililitros de água desionizada e suspenda as partículas por vórtice.

Em seguida, traga o volume final em cada tubo até 50 mililitros com água desionizada fresca e lave as partículas mais duas vezes como apenas demonstrado. Para a síntese de nanopartículas, dissolva 200 miligramas de PLGA em cinco mililitros de diclorometano e coloque uma sonda sonicator em um béquer contendo 50 mililitros de solução de 1%PVA no gelo sem tocar no fundo do béquer. Inicie a sônica em 12 watts e adicione imediatamente a solução PLGA ao béquer por uma sônica de dois minutos para gerar nanopartículas com aproximadamente 200 nanômetros de diâmetro.

Após a sônicação, despeje a solução de nanopartículas PLGA de 1%polivinyl em um béquer contendo 100 mililitros de solução de 5 PVA em uma placa de agitação durante quatro horas de evaporação de solvente em um capô de fumaça química. Quando todo o solvente for evaporado, despeje a solução de partículas em tubos cônicos de 50 mililitros para centrifugação para remover quaisquer micropartículas e remover os sobrenantes. Em seguida, transfira as nanopartículas em tubos de centrífugas de alta velocidade para três lavagens em água desionizada como demonstrado.

Para a fabricação de partículas poliméricas, após a última lavagem, suspenda as partículas em aproximadamente um mililitro de água desionizada fresca e adicione a solução de fundição de filme às partículas a uma concentração final de 2,5 miligramas por partículas mililitros. Transfira a suspensão de partículas em alíquotas de 10 mililitros em placas de Petri retangulares de 75 por 50 milímetros para alongamento unidimensional. Ou em alíquotas de 15 mililitros em 100 por 100 milímetros quadrados placas de Petri para alongamento bidimensional.

Depois de secar durante a noite em um capô químico, use pinças para remover os filmes e corte as bordas com uma tesoura. Para alongamento 1D, coloque as duas bordas curtas de uma película entre duas peças de borracha neoprene para montagem nos blocos de alumínio de um eixo de um dispositivo automatizado de alongamento de filme fino. Em seguida, use uma chave Allen para ferrar as garras metálicas em cima da borracha para manter o filme no lugar.

Para alongamento 2D, monte todas as quatro bordas em quatro blocos de alumínio para esticar a película em ambos os eixos e regissue o comprimento da película entre os blocos de alumínio em um eixo para um alongamento D ou ambos os eixos para alongamento 2D e calcule a distância necessária para esticar o filme em uma ou duas direções com base no trecho da dobra desejada. Em seguida, coloque o dispositivo de alongamento carregado em um forno a 90 graus Celsius ao lado de um béquer maior de uma pequena quantidade de água para levar o filme à temperatura acima de 10 minutos. Quando o alongamento estiver completo, deixe o filme esfriar à temperatura ambiente por 20 minutos.

Para alongamento 1D, corte o filme do dispositivo de alongamento nas bordas. Para alongamento 2D, corte e salve o quadrado central do filme que é uniformemente estendido em ambos os eixos. Coloque os filmes em tubos cônicos de 50 mililitros com não mais do que dois filmes por tubo e adicione aproximadamente 25 mililitros de água desionizada a cada tubo para vórtice.

Quando os filmes se dissolverem, lave as partículas três vezes em água desionizada como demonstrado. Re-suspendendo as partículas em aproximadamente um mililitro de água desionizada fresca por tubo após a última lavagem. Em seguida, congele as partículas a menos 80 graus Celsius durante uma hora ou lyofilização durante a noite.

Na manhã seguinte, suspenda a micro ou nanopartículas liofilizadas a 20 miligramas por mililitro em um buffer MES recém-preparado com vórtice. Adicione 100 microliters da solução de partículas a um tubo de micro centrífuga de micropropileno contendo 900 microliters de buffer MES e adicione 100 microliters de solução EDC NHS recém-preparada. Misture as partículas por vórtice e incuba as partículas em um inversor à temperatura ambiente por 30 minutos.

No final da incubação, colete as partículas por centrifugação e suspenda as pelotas de micropartículas em um mililitro de PBS por vórtice ou suspenda as nanopartículas em um mililitro de PBS por cinco segundos de sônica em dois a três watts. Em seguida, adicione oito microgramas de um sinal adequado uma proteína e 10 microgramas de anticorpos CD28 anti-rato às micropartículas, ou 16 microgramas do sinal de uma proteína e 20 microgramas de CD28 anti-rato para as nanopartículas. Leve o volume final em cada tubo para 1,1 mililitro com PBS e incubar as partículas durante a noite em um inversor a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, lave as partículas três vezes em água desionizada como demonstrado. Estas nano e micropartículas PLGA foram sintetizadas usando as técnicas únicas de emulsão, como demonstrado e imageado usando a microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Após a homogeneização, as micropartículas demonstraram um diâmetro médio de cerca de três micrômetros.

As micropartículas esféricas tinham uma ração de aspecto de cerca de uma, enquanto as partículas elipsoidais esticadas em 1D tinham uma proporção maior de cerca de três e meio e as partículas elipsoidais esticadas em 2D tinham uma proporção de cerca de 1,2, aproximadamente mantendo uma proporção de uma. Os resultados da eficiência conjugal revelam as quantidades similares de proteína na superfície do antígeno microaroidal esférico e elipsoidal que apresenta células, ou AAPC e nano-AAPC, demonstrando que o acoplamento de proteínas durante a síntese da AAPC ocorre de forma dependente da concentração. A AAPC prolate elipsoidal foi encontrada para induzir níveis mais elevados de proliferação de células T em doses subsaturantes do que a AAPC esférica com a melhor separação alcançada em uma dose de 01 miligramas.

Após sete dias, a contagem manual das células T revelou que a AAPC elipsoidal prolate estimula mais eficazmente as células T em comparação com suas contrapartes esféricas na micro e nano escala de uma maneira dependente de dose. Após este procedimento, a AAPC pode ser administrada in vivo para medir sua eficácia terapêutica e farmacocinética. Após seu desenvolvimento, essa técnica ajudou a pavimentar o caminho para pesquisadores da área de imunoengenharia explorarem o efeito da anisotropia na eficácia da AAPC.