Name: Fígado-on-a-Chip culturas de hepatócitos primários e células de Kupffer para infecção pelo vírus da hepatite B (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a cultivar hepatócitos primários e células de Kupffer em plataforma microfluídica para estudar infecção pelo vírus da hepatite B. Este modelo 3D recria o microambiente hepático fisiológico por períodos prolongados.

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Este trabalho foi financiado por uma concessão do acionador de partida do Conselho Europeu de investigação (637304), um Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z) e pelas inovações de Bio CN.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os desafios em manter culturas a longo prazo de poeira têm impulsionado o desenvolvimento de diversos modelos de cultura com maior funcionalidade e longevidade, cada um exibindo diferenciais vantagens e desvantagens. Agora é amplamente reconhecido que culturas 2D estáticas de poeira estão imitando certos aspectos da biologia do hepatócito para quantidades muito limitadas de tempo. Assim, micropatterned cocultures12,13, esferoide culturas14,15, e culturas de fígado-em-um-microplaqueta 3D16,17 estão rapidamente substituindo estes sistemas mais básicos. Especialmente quando estudar doenças infecciosas, que evoluíram com seu anfitrião para utilizar específico microambiente, o requisito de fornecer ambientes fisiológicas é sustentado pela natureza muitas vezes desafiador de cultivo humano-tropic doenças infecciosas, incluindo o vírus da hepatite C, HBV e malária.
O passo mais crítico no desempenho 3D fígado-em-um-microplaqueta de culturas é a qualidade dos tipos inicialmente origem célula primária. Estas células devem ser testadas pela sua capacidade de aderência e apenas montes de poeira plateable devem ser usados para assegurar a formação de tecido de sucesso e geração de cultura. Mesmo que PHH recentemente isolado pode ser usado, sua criopreservação é geralmente complicada e requer especiais congeladores taxa-controlada.
Em contraste com culturas convencionais de 2D estáticas, o fundo genético de anfitrião é insignificante em relação à susceptibilidade à infecção pelo VHB, e todos os doadores do hepatócito testado até agora são capazes de estabelecer de infecção pelo VHB4.
Mesmo que o paciente-derivado HBV estabelece infecções das culturas 3D, é imperativo utilizar PEG-precipitado e sacarose coxim-purificado HBV sempre usando célula de produtor HBV inducible linhas para a geração de inóculos virais. Sobrenadantes de cultura celular aplicados diretamente às culturas de fígado-em-um-microplaqueta 3D, quer através da presença de fatores inibitórios ou devido a uma incompatibilidade de fatores de crescimento presentes com hepatócitos, prontamente não resultar em infecção. Além disso, ao selecionar paciente-derivado de inóculos virais, só soro deve ser usado, desde que o plasma, inevitavelmente, coagula e obstrui a circulação microfluidic da plataforma de cultura.
Independentemente do inóculo viral utilizado, assegurando a viabilidade celular e diferenciação, bem como assegurar a remoção completa do inóculo inicial HBV, é chave para o sucesso a longo prazo estudos de infecção. A maneira mais conveniente de fazer isto é amostragem culturas após a remoção do inóculo viral, bem como medir os níveis de albumina de soro humano durante todo o período de cultura. Da nota, da mesma forma para todas as outras plataformas descritas, infecção pelo VHB, uma vez estabelecida, não prontamente espalha para células não infectadas. O mecanismo subjacente para isto continua elusivo, já que a infecção pelo VHB em vivo prontamente infecta a maioria dos hepatócitos no fígado.
No que se refere cocultures de poeira, células de Kupffer, é aconselhável realizar testes de monte de células de Kupffer para avaliar a secreção IL6 e TNFa em resposta à estimulação de LPS, uma vez que nem todos os dadores de células de Kupffer comercialmente disponíveis têm uma capacidade de resposta igual.
Importante, para todos os tratamentos com drogas ou infecção inicial das culturas com HBV, o volume total do poço (1,4 mL), bem como a partir do canal microfluidic (0,2 mL), devem ser tomadas em consideração para o cálculo das concentrações de droga ou de inóculo. Para garantir a dosagem exata, uma etapa de lavagem com meio contendo HBV ou drogas é executada para prime o canal microfluidic.
A plataforma usada utiliza PHH 600.000 por bem, o que garante várias camados hepatócitos dentro os andaimes. Mesmo que o número de células pode ser variado, a concentração de células escolhido garante resultados óptimos. O formato da placa possui um total de 12 andaimes, que pode ser actualizada para 36 andaimes. No entanto, devido às exigências de microfluidic, intensificação para números bem mais altos não é possível até à data.
Usando essas abordagens, as culturas podem ser mantidas com desempenho de célula ideal pelo menos 40 dias, que, até então, oferece oportunidades sem precedentes para avaliar candidatos a novos fármacos, bem como estudar a complexa interação entre diferentes células hepáticas populações durante a infecção pelo VHB.

O estudo do HBV foi complicado pela pobre susceptibilidade dos sistemas de cultura, que requerem várias centenas de milhares de cópias do genoma HBV por célula para iniciar a infecção1. Além disso, os hepatócitos humanos primários geralmente são excepcionalmente frágil e dedifferentiate rapidamente durante as culturas convencionais2. Isto é principalmente devido ao fato de que as superfícies de plástico lisas e dura não imitar os ambientes naturais extracelulares encontrados dentro do fígado e a falta de oxigenação das culturas na ausência de circulação microfluidic geral. Culturas de hepatócitos estáticos convencionais em placas com revestimento em colágeno rapidamente dedifferentiate e perdem a sua susceptibilidade à infecção de VHB3. Aqui, descrevemos o set-up e infecção de poeira crescida em culturas de fígado-em-um-microplaqueta 3D, que são imensamente vantajosas sobre convencional 2D estáticas culturas PHH em placas com revestimento em colagénio devido a sua competência estendida de metabólica e funcional, facilitando culturas a longo prazo pelo menos 40 dias4. Neste sistema, PHH são semeados em andaimes colágeno-revestido, que continuamente são pintadas com meio de cultura para fornecer oxigênio e nutrientes para as células. Apesar dos sistemas de cultura alternativa para PHH baseados no complexos cocultures de fibroblastos murino ou crescimento 3D em esferoides foram validados e são suscetíveis à infecção pelo VHB usando multiplicidades de infecção de 500 equivalentes do genoma (GE) do HBV por célula, 3D fígado-em-um-microplaqueta culturas permanecem suscetíveis a 0,05 sistema único modelo in vitro GE de HBV por célula4. Isto adicionalmente é sustentado pela necessidade do uso de altas concentrações de Dimetilsulfóxido (DMSO) e polietileno glicol (PEG) para estabelecer a infecção pelo VHB nessas culturas, que é dispensável para a infecção dos sistemas de cultura de fígado-em-um-microplaqueta 3D 4. entre as principais marcas do HBV infecção é a piscina de cccDNA, que atua como o modelo transcriptional para todos de novo–produzido virions5,6. Mesmo que o cccDNA pode ser detectado em culturas de hepatócitos convencional7,8, permanece incerto sobre se o Regulamento da cccDNA e quaisquer abordagens terapêuticas vistas a sua eliminação são recapituladas em parcialmente ou completamente os hepatócitos. Demonstrámos que cccDNA funcionalmente é formada em culturas de fígado-em-um-microplaqueta 3D, responde a estímulos fisiológicos e pode ser direcionado, interferindo com a acessibilidade da maquinaria transcricional do genoma de cccDNA4.
Respostas de anfitrião para infecção pelo VHB em 3D fígado-em-um-microplaqueta imitam aqueles observaram em pacientes infectados pelo VHB, permitindo a identificação de biomarcadores para infecção, bem como sucesso terapêutico. Entre as características únicas do fígado-em-um-microplaqueta culturas é a capacidade de avaliar as respostas de acolhimento a longo prazo entre a poeira e outras células parênquimas dentro do fígado, incluindo células4Kupffer, células estreladas9e fígado sinusoidal células endoteliais10,11. Isto oferece uma oportunidade única para avaliar interações célula/célula em um microambiente 3D complexa.
Além disso, o período prolongado de cultura desta plataforma facilita a avaliação dos tratamentos medicamentosos sequencial e seu impacto sobre a persistência do VHB, que não são possíveis usando sistemas de cultura hepatócito convencional.
Este protocolo descreve como 3D fígado-em-um-microplaqueta culturas são geradas, monoculturas de poeira ou para cocultures de poeira com células de Kupffer. Além disso, descrevemos a produção do HBV purificado para estudos de baixo-multiplicidade de infecção, bem como a análise posterior de host e respostas virais.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte>William's</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>E Médio, sem fenol vermelho</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>Meio de descongelamento de hepatócitos</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr><tr><td>Suplementos primários de descongelamento e revestimento de hepatócitos</td><td>GIBCO</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Suplementos primários de manutenção de hepatócitos</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>avançado 12491023</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos não essenciais (NEAA) 100x</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal, origem dos EUA, inativado por calor, filtrado estéril, adequado para cultura de células</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Azul tripano</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno da pele de bezerro</td><td>Merck</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>SIGMA</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>SIGMA</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sódio anidro</td><td>SIGMA</td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico, 99,999%</td> <td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Albumina (humana)</td><td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagent&nbsp; Albumina de Soro Bovino, Fração V, Tratamento com Choque Térmico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, não UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo de Escherichia coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Kits/Consumíveis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana estéril</td><td>CN Bio inovações</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Placa de cultura de células de perfusão</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>Tampa da placa de cultura LiverChip</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro redondo estéril</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Andaime de fixação de células</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Anel de retenção</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Êmbolo estéril</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy kit de sangue e tecido</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de Luminex Magnético Humano</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set</td><td>Qiagen</td><td>1048147</td><td>Contendo RNA transportador</td></tr><tr><td>Millicell HY Frasco de cultura de células de 5 camadas, T-1000, Millipore estéril</td><td>(Merck)</td><td></td><td></td>PFHYS1008</tr><tr><td>Placa de reação óptica de 384 poços MicroAmp com tecnologias de vida de código de barras</td><td></td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>Filme adesivo óptico MicroAmp</td><td>Life technologies</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços imuno não estéreis de fundo plano transparente</td> Fita de vedação <td>de 442404</td><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td>para placas de 96 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Garrafa Descartáveis Estéreis de Fluxo Rápido Nalgene com Membrana PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Marca Fisher&nbsp; Lâminas microscópicas com bordas retificadas, Tubo</td><td>de FB58628</td><td></td>Twin <td>Frost Fisher Scientific</td></tr><tr><td>, Thinwall, Ultra-Clear, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Células primárias / Linhas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepatócitos plaquetáveis humanos, transportador qualificado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HMCPTS</td><td></td></tr><tr><td>Células Kupffer humanas criopreservadas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>HepDE19 linha celular</td><td>Haitao Guo (Indiana University, IN, EUA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa </td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Primers/Probes/Standards</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNA forward primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA probe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA forward primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA</td></tr> <tr><td>reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'RPS11</td></tr> <tr><td>forward primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11</td></tr> <tr><td>reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV</td></tr> <tr><td></td><td>Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, EUA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hepatite B vírus anti-núcleo do antígeno IgG fração (policlonal)</td> <td>DAKO</td><td>descontinuado</td><td>Lote 10102505</td></tr><tr><td>Anticorpo de albumina humana, A80-129A</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-129A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de albumina humana adsorvido cruzada, A80-229P</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-229P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário de adsorção cruzada anti-coelho IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#&nbsp; A-11072</td><td>Lote 1431810</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo LiverChip</td><td>CN Bio inovações</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Conexão pneumática</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma LiverChip CN</td><td>Bio innovations</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip doca de lavagem de chapas</td><td>CN Bio innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça metálica autoclavável</td><td>VWR</td><td>232-0106</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries</td><td>SKU: SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004500</td><td></td></tr><tr><td>SAM-12 Sucção Médica Alto Vácuo Alto Fluxo</td><td>MGE em todo o mundo</td><td>&nbsp; SAM12/01010101</td><td></td></tr><tr><td>incubadora NUAIRE 5800 SERIES</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5841</td><td></td></tr><tr><td>Torgue de precisão automatizado</td><td>CN Bio innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Torque manual</td><td>CN Bio innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compressor LiverChip</td><td>CN Bio innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloco Separador Magnético Portátil Millipore</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Millipore&trade; 40-285</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de Placas FluoStar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Chaves de fenda elétricas de precisão</td><td>VTECH ltd</td><td>FAB10RE/FR</td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Fonte de alimentação</td><td>VTECH ltd</td><td>EDU1FR</td><td></td></tr><tr><td>BAMBI VTS75D</td><td>Equipamento de Ar</td><td>Descontinuado</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR em tempo real Integra Vacuboy</td><td>INTEGRA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 com bloco de 384 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453536</td><td></td></tr></tbody></table>

"fígado-on-a-chip" culturas de hepatócitos primários e células de kupffer para infecção pelo vírus da hepatite b

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

Apesar da excepcional infectividade do vírus da hepatite B (VHB) em in vivo, onde apenas três genomas virais podem resultar em uma cronicidade de chimpanzés experimentalmente infectados, mais modelos in vitro requerem várias centenas de milhares de genomas virais por célula em ordem para iniciar uma infecção transitória. Além disso, o estáticas 2D culturas de hepatócitos humanos primários (PHH) permitem apenas estudos de curto prazo devido a sua rápida quê. Aqui, descrevemos 3D culturas fígado-em-um-microplaqueta de poeira, monoculturas ou em cocultures com outras células do fígado-residente de parênquimas. Estes oferecem uma melhoria significativa ao estudo a longo prazo infecções HBV com respostas de célula fisiológico do hospedeiro. Além de facilitar estudos de eficácia de drogas, análise toxicológica e investigações sobre patogênese, estes sistemas de cultura microfluidic permitem a avaliação de terapias curativas para infecção pelo VHB, tendentes a eliminar covalentemente fechado, circular (ccc) DNA. Este apresentado método descreve o set-up de monoculturas PHH e culturas co de células de Kupffer/PHH, a infecção com o VHB purificado e a análise das respostas do hospedeiro. Este método é particularmente aplicável à avaliação dos efeitos a longo prazo da infecção pelo VHB, combinações de tratamento e patogênese.

Nós descrevemos uma plataforma simples e versátil para a cultura a longo prazo das células de Kupffer humanas primárias e/ou hepatócitos e sua infecção com o VHB. Células humanas primárias são semeadas em andaimes de poliestireno revestido de colágeno dentro de um assembly de placa microfluídicos, que continuamente perfuses as células com o meio de crescimento (Figura 1a).
PHH, que geralmente são apenas estável para uma quantidade limitada de tempo nos sistemas de cultura convencional, pode ser funcionalmente mantida por longos períodos de tempo. Albumina humana, que é secretada pelos hepatócitos funcionais e é considerada o melhor marcador para a avaliação do metabolismo hepático, é estável e altamente expressa por culturas 3D até dia 40 pós-semeadura (Figura 2). Para cocultures, a viabilidade e a funcionalidade de células de Kupffer podem ser avaliadas pela secreção de citocinas específicas (por exemplo, IL6 e TNFa). Para medir a produção de citocinas, a utilização de meios de detecção baseada em captura sobre LPS-estimulação de cocultures é recomendada (Figura 3).
Células formam microtissues hepática, geralmente dentro de 3 dias da semeação de poeira, demonstrando canalículos biliares funcional e polarização de célula completa (Figura 2). Além de manter seu metabolismo celular fisiológico, essas culturas tornam-se excepcionalmente suscetíveis à infecção pelo VHB. DNA do HBV e outros marcadores virais, em contraste com outros sistemas de cultura, tornam-se prontamente detectáveis de pós-infecção do dia 2 (Figura 4). Além secretados marcadores de infecção viral, contendo hepatócito andaimes podem ser obtidas de culturas e usados para detecção de antígenos virais imunofluorescência (por exemplo, HBsAg, HBcAg) (Figura 4). Onde culturas de hepatócitos convencionais exigem inoculação pelo menos 500 GE HBV por célula e a adição de DMSO de 2% e 4% PEG, sómente 0,05 HBV GE são capazes de iniciar a infecção em culturas em 3D sem a necessidade de DMSO ou PEG (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> Figura 1: configuração das culturas de fígado-em-um-microplaqueta 3-d. (um) este é um layout esquemático para a montagem da placa de cultura para garantir o estabelecimento de circulação microfluidic. (b) este painel mostra uma visão mais apurada dos poços de cultura, incluindo o papel de filtro, andaime e anel de retenção. (c) este painel mostra o processo de equilíbrio de placa antes da semeadura das culturas. Os próximos dois painéis mostram o processo de propagação para monoculturas de hepatócitos (d) e (e) células de Kupffer/hepatócito cocultures. (f) este painel mostra as etapas de lavagem envolvidos em alterações médias. (g) este painel mostra a afinação de infecção pelo VHB, incluindo a remoção de um inóculo. S.M. = meio de semeadura, M.M = meio de manutenção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> Figura 2: viabilidade de formação e hepatócito hepática microtissue. (um) este painel mostra imagens brightfield longitudinal de monoculturas hepatócito 3D demonstrando a formação de microtissue após semeadura. (b) este painel mostra imagens de imunofluorescência de culturas para núcleos (azul) e a albumina humana (verde). (c) este painel mostra longitudinal albumina total, bem como por célula ajustado produção de albumina, durante 40 dias de monoculturas de hepatócitos, conforme determinado pelo ELISA. Os dados mostrados são média ± SD Esta figura é adaptada de Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> Figura 3: funcionalidade de células de Kupffer em 3-d cocultures. Estes painéis mostram a secreção de (um) IL6 e (b) TNFa em monoculturas de hepatócitos e células de Kupffer/hepatócito cocultures 11 dias pós-semeadura em resposta a LPS exogenamente adicionados no dia 9 post de semeadura, conforme determinado usando humana magnético Ensaio de Luminex. Esta figura é adaptada de Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> Figura 4: infecção pelo VHB em culturas de fígado-em-um-microplaqueta. (um) este painel mostra a detecção de microscopia de imunofluorescência de HBcAg (vermelho), HBsAg (verde) e núcleos (azul) 10 dias após a infecção das culturas com o VHB. (b) este painel mostra a susceptibilidade das culturas à infecção pelo VHB, usando diferentes multiplicidades de infecção, conforme determinado por uma quantificação do ADN do HBV nos sobrenadantes de cultura. (c) este painel mostra a quantificação da acumulação longitudinal de HBV pgRNA relativo para o gene de limpeza RPS11. Os dados mostrados são média ± SD Esta figura é adaptada de Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O objetivo do presente protocolo é fornecer um guia passo a passo para realizar experiências em 3-d "fígado-on-a-chip" infecção com o vírus da hepatite B.

"Fígado-on-a-Chip" culturas de hepatócitos primários e células de Kupffer para infecção pelo vírus da hepatite B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em infecções hepatotrópicas e campos de doenças hepáticas. Como a contribuição de populações de células residentes hepáticas, para a patogênese viral, cinética de infecção longitudinal, mecanismos de replicação viral, invasão imunológica, em um sistema de modelo fisiológico e estudos de teste de drogas. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de recapitular um microambiente hepático.Que pode ser mantido por longos períodos de tempo e é naturalmente suscetível à infecção por hepatite B em níveis fisiológicos relevantes. Isso já foi uma restrição fundamental no campo da hepatite B. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia ou diagnóstico da infecção por HBV porque estudos de testes medicamentosos podem ser realizados em uma plataforma fisiológica por longas duraçãos.Isso permite a avaliação de tratamentos medicamentosos sequenciais, juntamente com a análise da eficácia das estratégias de tratamento existentes e novas. Este método pode fornecer compreensão sobre a hepatite B, e também pode ser aplicado a outros estudos da doença, incluindo outras infecções hepatotrópicas, doenças hepáticas ou estudos de metabolismo medicamentoso. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão, pois requer atenção a detalhes específicos para permitir a manutenção bem sucedida do tecido hepático por longos períodos de tempo.E também familiarização com as ferramentas e equipamentos especializados. A demonstração visual deste método é crítica. Incluindo montagem das placas, bem como descongelamento e semeadura das células.Uma vez que as etapas envolvidas na cultura de longo prazo das células derivadas do fígado são desafiadoras ao usar um novo sistema cultural. Primeiro, ligue o compressor e a bomba de vácuo associada à plataforma do chip de fígado. Vá para um armário de tubo de vidro para montar e equilibrar as placas.Coloque uma membrana estéril na base da placa para começar a montar as placas microfluídicas. Certificando-se de que a membrana estéril repousa suavemente sobre os dois pinos da placa base. Em seguida, adicione a placa superior bem contendo.Adicione uma tampa de placa estéril. E use um torque de precisão automatizado, definido para 33 libras. Usando uma sequência de aperto em espiral para apertar os parafusos na base da placa.Usando um torque manual, certifique-se de que todos os parafusos estão apertados a 35 libras. Em seguida, pré-aqueça a semeadura de hepatócitos de médio a 37 graus Celsius antes de priming. Coloque a placa completamente montada na doca de lavagem.E certifique-se de que a placa se encaixa completamente. Adicione 400 microliters de hepatócitos médios ao lado do reservatório de cada poço para preparar a placa. Depois disso, inicie o fluxo na direção ascendente por 3,5 minutos a um microliter por segundo.Os indicadores vermelhos na lateral da placa indicarão se a circulação microfluidica está funcionando corretamente. Uma vez que o meio seja bombeado para o lado de crescimento celular da placa, adicione um adicional de 1,2 mililitros de meio de semeadura hepatócida. Transfira cuidadosamente a placa para a estação de acoplamento dentro de uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5%CO2.Iniciar o fluxo na direção ascendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo durante 16 horas. Depois disso, transfira a placa para uma doca de lavagem. Pipeta suavemente para cima e para baixo para eliminar quaisquer bolhas.Usando um fórceps estéril, adicione um papel filtro redondo estéril a cada poço. Em seguida, adicione um andaime de fixação celular e um anel de retenção a cada poço. Use um êmbolo estéril para empurrar cada poço e bloquear os anéis de retenção e andaimes no lugar.Em seguida, aspirar todo o meio. E adicione suavemente 400 microliters de meio de semeadura de hepatócito pré-aquecido sobre o andaime. Inicie o fluxo em direção descendente a um microliter por segundo durante 3 minutos e meio.Aspire todos os meios bombeados para fora do lado do reservatório da placa. Adicione 1,4 mililitros de hepatocitado semeando meio a cada poço. Em seguida, devolva a placa para a doca para trazer o volume total por poço até 1,6 mililitros.Primeiro, pré-aqueça o meio de descongelamento de hepatócitos e a semeadura de hepatocitte de média a 37 graus Celsius. Em seguida, descongele um frasco de hepatócitos humanos primários de acordo com as instruções do fornecedor. Em um armário de tubo de vidro, resuspenque as células em um mililitro de meio de semeadura hepatócida.Em seguida, coloque as células resuspended no gelo. Usando o azul trypan, conte as células para garantir que a viabilidade das células esteja acima de 90% Transfira a placa totalmente montada para a doca de lavagem. E aspirar todos os meios dos poços.Recupere as células do gelo, e adicione 600.000 hepatócitos a cada poço em um volume de 500 microliter de meio de semeadura de hepatócitos. Iniciar fluxo na direção descendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo. Adicione 900 microliters de meio de semeadura de hepatócitos a cada poço para trazer o volume total em cada um para 1,6 mililitros.Transfira a placa para a estação de acoplamento dentro de uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e com 5% de CO2. Inicie o fluxo na direção descendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo durante oito horas. Depois disso, inverta o fluxo para a direção ascendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo durante oito horas.Em seguida, transfira a placa para a doca de lavagem, e aspire todos os meios dos poços. Adicione 400 microliters de meio de manutenção hepatocitar a cada poço. E iniciar fluxo na direção descendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo por 3 minutos e meio.Em seguida, aspire todos os meios do reservatório, e adicione 1,4 mililitros de meio de manutenção hepatocitar. Transfira a placa para a estação de acoplamento dentro de uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5%CO2. Iniciar o fluxo na direção ascendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo durante 48 horas.Depois de 48 horas, lave a placa transferindo-a para a doca de lavagem. Aspire todos os meios dos poços. E adicione 400 microliters de meio de manutenção.E iniciar fluxo na direção descendente a um microliter por segundo por 3,5 minutos. Em seguida, aspire todos os meios que aparecem no lado do reservatório dos poços. Adicione 1,4 mililitros de meio de manutenção hepatocitar.Em seguida, transfira a placa de volta para a estação de acoplamento na incubadora umidificada. Iniciar o fluxo na direção ascendente a uma taxa de fluxo de um microliter por segundo durante 48 horas. Substitua o meio usando este processo de lavagem e substituição a cada 48 horas.Hepatócitos humanos primários são geralmente apenas estáveis por um período limitado de tempo ao usar sistemas de cultura convencionais. No entanto, usando o protocolo aqui descrito, eles podem ser mantidos funcionalmente por longos períodos de tempo. A albumina humana é secretada por hepatócitos funcionais, e é considerada o melhor marcador para avaliar a funcionalidade hepática.Albumina é visto como sendo estável e altamente expresso por culturas 3D até pelo menos o dia 40 pós-semeadura. Para co-culturas, a funcionalidade e a viabilidade das células Kupffer são avaliadas medindo a secreção de citocinas específicas. Como visto aqui, os níveis medidos de IL-6 e TNF alfa indicam que as células foram funcionalmente mantidas e viáveis.Além de reter seu metabolismo celular fisiológico, essas culturas tornaram-se excepcionalmente suscetíveis à infecção pelo HBV. O DNA HBV e outros marcadores virais são facilmente detectáveis desde o segundo dia pós-infecção. Enquanto culturas convencionais requerem inoculação com pelo menos 500 equivalentes de genoma HBV complementados com DMSO e PEG, essas culturas 3D são infectadas com apenas 05 equivalentes de genoma não-upplementados.Além de marcadores secretos de infecção viral, andaimes contendo hepatócitos são recuperados dessas culturas. A microscopia de imunofluorescência revela que esses andaimes contêm antígenos virais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de ser gentil ao lidar com os hepatócitos antes de semear para evitar a morte celular.Além disso, é essencial garantir que as placas estejam corretamente montadas e todos os canais de fluxo estejam permitindo a circulação correta da mídia antes da semeadura dos hepatócitos. Após esse procedimento, outros métodos como a imunofluorescência podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Incluindo a localização e frequência de células infectadas dentro do tecido.O estado fisiológico dos hepatócitos também pode ser avaliado pela coloração para albumina ou estruturas hepáticas, incluindo proteína de junção apertada ZO-1. Após esse desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores da área de virologia explorarem a infecção por hepatite B e respostas imunológicas em um sistema modelo 3D fisiológico. Não se esqueça que trabalhar com o vírus da hepatite B pode ser perigoso, e precauções como vacinação prévia, uso de EPI apropriado e trabalho sob diretrizes adequadas de biossegurança devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Descrevemos aqui um vírus da hepatite B recentemente desenvolvido sistema de repórter (HBV) para monitorar as fases iniciais do ciclo de vida do HBV. Este simplificado sistema in vitro irá ajudar no rastreio de agentes anti-HBV, utilizando uma estratégia de alto rendimento.

Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

Aqui, mostramos uma abordagem enzimática para isolar hepatócitos primários a partir de ratos adultos, e descreve-se a quantificação de uma resposta inflamatória por meio de ELISA e PCR em tempo real.

A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV) em novas células 293T (293T-NE-3NRs, expressando NTCP humano, HNF4α, RXRα e PPARα) e células hepáticas tradicionais (HepG2-NE, expressando NTCP humano).

Modelagem da infecção por vírus da hepatite B em células não hepáticas 293T-NE-3NRs

Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Um sistema de cultura organoide 3D ex vitro de longo prazo foi estabelecido a partir de hepatócitos de camundongos. Esses organoides podem ser passagemdos e geneticamente manipulados por infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9.

Estabelecimento e Manipulação Genética de Organoides Hepatocitos De Murine

Apresentamos um protocolo para triagem de compostos anti-vírus da hepatite B (HBV) visando estágios do ciclo de vida pré e pós-entrada viral, usando calorimetria de titulação isotérmica para medir a afinidade de ligação (KD) com o polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio do hospedeiro. A eficácia antiviral foi determinada através da supressão de marcadores do ciclo de vida viral (formação, transcrição e montagem viral do cccDNA).

Um Modelo de Hepatócito Competente Examinando a Entrada do Vírus da Hepatite B através do Polipeptídeo Cotransportador de Taurocolato de Sódio como Alvo Terapêutico

Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Aqui, descrevemos uma plataforma que permite imagens in vivo não invasivas de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo. O fluxo de trabalho abrange desde a geração de esferoides de células hepáticas primárias até o transplante para o olho do camundongo e imagens in vivo em resolução celular por microscopia confocal.

Imagens in vivo de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Aprenda a cultivar hepatócitos primários e células de Kupffer em plataforma microfluídica para estudar infecção pelo vírus da hepatite B. Este modelo 3D recria o microambiente hepático fisiológico por períodos prolongados.

"Fígado-on-a-Chip" culturas de hepatócitos primários e células de Kupffer para infecção pelo vírus da hepatite B

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