Name: Avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos Neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a isolar núcleos cerebrais de ratos neonatais para estudar sinalização de estresse antes e depois da primeira mamada de colostro. Este método permite analisar vias de desenvolvimento pós-natal.

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Os autores agradecer Manon Ranger e Alexandra Schulz por sua assistência na elaboração deste protocolo.

Este estudo foi aprovado pelo cuidado de Animal institucional e comissões de uso na Universidade de Columbia e o Instituto de Psiquiatria de Nova York estado.
1. tecido preparação
<ol><li>Ordem cronometrado de ratos grávidos de fornecedor.</li>
	<li>Siga cronometrado de ratos grávidos observando seus abdomens crescentes nas semanas após a sua chegada e posteriormente procurando por filhotes na data prevista de entrega inspecionando a gaiola cada 2h até entrega começa.</li>
	<li>Remover os filhotes com uma mão enluvada pelo seu rabo antes de sua primeira alimentação para filhotes unprimed (sem barriga branca leite é aparente ao exibir o abdômen) ou a primeira mamada para filhotes aprontadas (no ponto em que um estômago branco será visível no seu abdómen) conforme descrito no timeli ne (Figura S1). Nota: O primeiro sinal de colostro é denominado como primer o filhote; assim, um filhote é unprimed até o primeiro feed, após o qual eles são aprontadas de colostro.</li>
	<li>Rapidamente decapitar o filhote sem anestesia, com uma tesoura afiada, limpeza cirúrgica.</li>
	<li>Remova o cérebro por um corte a pele para baixo da linha média e superfície superior do crânio ao nariz. Em seguida, usando a pinça, separando cuidadosamente afastado o osso para expor o cérebro (figura 1A) e localizar o bregma, marcando-o com uma caneta como as placas ósseas são removidas (figura 1B).</li>
	<li>Coloque rapidamente o cérebro inteiro em um molde de cérebro polimetacrilato metacrilato em temperatura ambiente por coronal corte à temperatura ambiente (Figura 1).</li>
	<li>Sem demora, fazer 500 milímetros de espessura fatias usando uma lâmina de barbear a fresca. Deite as fatias rostrais caudal em uma placa de Petri para manter a orientação das seções (Figura 2).</li>
	<li>Rapidamente adicionar artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF; 1,0 mM KH2PO4, 26mm NaHCO3, 118,6 mM NaCl, 3,0 mM KCl, 203,3 mM MgCl2-6 H2O) sem glicose e incubar as fatias para 60 min a 28-30 ° C, mexendo constantemente em um agitador orbital metabolicamente e diferencialmente desafiar a unprimed contra tecidos colostro-preparado.</li>
	<li>Identifica os núcleos do cérebro que são necessárias para um soco usando um cérebro atlas33 e Marcos anatómicos na seção de tecido. Coloque esta fatia com os núcleos de interesse em uma placa de Petri e movê-lo para o microscópio de dissecação.</li>
	<li>Uma vez visualizado, rapidamente um soco 4 de 6 núcleos diferentes usando uma ferramenta de retirada do dielétrico, selecionando o tamanho melhor bater o núcleo em questão e consistentemente entre as amostras (Figura 2). Nota: A fatia restante do cérebro agora terá um buraco onde o tecido cerebral era removido. Neste estudo, nós extirpado os seguintes núcleos usando o abaixo as coordenadas. Tudo anterior/posterior (A / P) coordenadas são de Bregma (exceto NTS, que é com referência a Calamus Scriptorius). Todas as coordenadas (D/V) de dorsal/ventral são da superfície do córtex (exceto NTS, que é a partir da superfície da medula). As coordenadas a seguintes incluem A / P, medial/lateral (M/L) e D/V em mm: 1) núcleo do trato solitário (NTS, A / P, 0.4 a 0.8; L, ± 0,2; D/V, 0.3 (da superfície da medula), 2) núcleo paraventricular (PVN,-0.8; ± 0,2; 0), 3) núcleo supraóptico (filho,-1.1; ± 1,4; 4.3), 4) córtex (CX, área do córtex parcial 1, -2.8; ± 1,5; 0,6), 5) núcleos striatum (STR,-0.0; ± 1,6; 1,8) e 6) medial após núcleo (MPO,-0.6; ± 0,2; 4.2).</li>
	<li>Mergulhe rapidamente os núcleos perfurados em 0,06 mL de tampão de extração de proteína gelada, contendo inibidores de protease e inibidores da fosfatase durante 60 minutos (ver passo 2.3).</li>
</ol>2. extração da proteína
<ol><li>Prepare a solução de extração de proteínas usando o kit de lise de proteínas (Tabela de materiais) no dia antes da entrega do filhote esperado.</li>
	<li>Degelo (no gelo) a solução aquosa de congelados (-20 ° C) dos inibidores de protease e fosfatase do kit de tampão de Lise e coloque a solução de DMSO dos inibidores de proteases/fosfatases e lise no gelo.</li>
	<li>Adicione 1,85 mL de tampão de Lise em um tubo de 15ml limpa e gelada. Em seguida, adicione 0,1 mL de solução aquosa de inibidores e 0,05 mL de inibidores de DMSO-dissolvido. Finalmente, cap e brevemente o tubo de vórtice e mantê-lo a-20 ° C até o uso.</li>
	<li>Rotule 24 tubos microcentrifuga limpo (0,5 mL cada uma) para o processo de Lise. Designados 12 tubos por cérebro para o grupo colostro-unprimed (U) [6 esquerda (L) e 6 núcleos de cérebro direito (R)] e o rótulo de acordo com a sigla de núcleos, lateral e condição (ex., NTS-L-U, NTS-R-U, etc.). Rotule o segundo grupo de 12 tubos para as amostras preparadas de colostro.</li>
	<li>Rotule dois conjuntos adicionais de tubos como feito no passo 2.4 para os extratos de banco de proteína (usando tubos de 1,5 mL Eppendorf-estilo) e para o primeiro conjunto de preparação de amostra (usando tubos de 0,5 mL). Manter estes tubos em duas separadas, etiquetadas congelamento caixas (cada um projetado para 100 tubos). Uma caixa será usada para as amostras unprimed e outro para as amostras condicionadas.</li>
	<li>Descongelar a solução de Lise no gelo, no dia em que os filhotes são entregues e ao mesmo tempo incubando fatias de cérebro em ACSF, alíquota 0,06 mL de solução de Lise para os tubos de procedimento de lise (da etapa 2.4) e adicionar socos de núcleos e incubar no gelo por 60 min.</li>
	<li>Centrifugue os núcleos lisados incubados por 30 min em uma centrífuga mini refrigerada a 14000 rpm (10.000 x g) e Aspire cuidadosamente com 0,055 mL do sobrenadante com uma pipeta corretamente ajustada. Transferir o sobrenadante para os tubos de estoque do pre-cooled 1,5 mL (da etapa 2.5) e colocá-los no gelo. Antes de congelar (a-20 ° C) os tubos de estoque de proteína, transferir 0,012 mL do sobrenadante para os tubos de pre-refrigeração de 0,5 mL para a preparação de amostra a primeira (da etapa 2.5) e deixá-los no gelo.</li>
</ol>3. amostra preparação para medição de proteína no capilar
<ol><li>Usar um kit e preparar os reagentes para a separação de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 0,003 mL de reagente de mestre-mistura para cada uma das 12 amostras no 0,5 mL rotulados tubos (da etapa 2.5) no gelo que contêm 0,012 mL dos extratos de proteína.</li>
	<li>Ligar o bloco de aquecimento para 95 ° C e adicionar 0,004 mL do reagente preparado no passo 3.1 para uma escada de (MW) de peso molecular biotinilado em um tubo com 0,016 mL de água desionizada. Para desnaturar a escada e amostras, colocar o tubo da escada e as 12 amostras dos extratos de proteína unprimed no calor bloqueiam a 95 ° C por 5 min e armazená-los em 4 ° C até o uso.</li>
	<li>Repita as etapas de 2.0 para 3.2, de extração de proteínas para a preparação da amostra, para os núcleos de um soco de colostro-aprontadas ratos.</li>
</ol>4. eletroforese preparação
<ol><li>Descongelar a biotina rotulagem reagente (armazenado no congelador profundo no-80 oC) no banco e preparar o kit de deteção de proteínas no gelo a 4 ° C, seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Misturar 0,15 mL de luminol com 0,15 mL de peróxido e carregar 0,01 mL em 25 poços (linha E, poços 1-25) da placa para a máquina automatizada ocidental. Carregar 0,008 mL de Streptavidin HRP do kit em poços D1 para D25</li>
	<li>Carrega a 0,01 mL de solução diluente de anticorpo em poços C1 C25 e B1.</li>
	<li>Gire a 24 amostras de proteínas e tubos escada brevemente (2-3 segundos) em um minicentrifuge ao pool de água evaporada em baixo das capas do tubo.</li>
	<li>Carrega 0,003 mL de 12 amostras unprimed em poços A2 A13, 0,003 mL de 12 amostras de colostro-aprontadas para poços A14 a A25 e 0,005 mL da escada no poço A1 biotinilado.</li>
	<li>Deixe a linha F vazio e carregar 0,45 mL de tampão de lavagem em cada um dos 5 compartimentos em cada uma das 3 linhas abaixo da linha F. tampa da placa com a tampa de plástico para evitar a evaporação durante os demais procedimentos.</li>
	<li>Brevemente o vórtice a biotina descongelada rotulagem reagente e adicionar 0,15 mL do reagente para seu tubo designado; em seguida adicionar-lhe 0,15 mL de agente de reconstituição da proteína total e misturá-los a homogeneidade.</li>
	<li>Remova a tampa da placa e carregar 0,01 mL de agentes 1 e 2 em poços B2 para B25. Cobrir a placa e centrifuga-lo durante 10 minutos a 1.000 g de x para remover quaisquer bolhas de ar das várias soluções. Use um prato vazio na centrífuga para equilíbrio.</li>
</ol>5. eletroforese
<ol><li>Enquanto a placa está girando, abra um arquivo executado no computador ocidental automatizado conectado à máquina indicando na página de menu suspenso "arquivo" para executar um ensaio de proteínas totais e o respectivo local, clicando em.</li>
	<li>Anote as amostras por bem no computador. Em seguida, retirar a placa da retire centrifugador a tampa e cuidadosamente retire a tampa de alumínio dos compartimentos de solução de separação.</li>
	<li>Coloque a placa no instrumento ocidental automatizado, retire a tampa da caixa de cartucho capilar, insira o cartucho no seu lugar designado e feche a porta.</li>
	<li>Clique no botão "Executar" e quando solicitado com o tipo de ensaio ("proteína total"), digite o nome das amostras (por exemplo, "unprimed 2-13 e colostro-aprontadas 14-25"). Clique em "Okey" e quando solicitado pela data de execução ativada e número de identificação do arquivo de execução, anote o tempo quando a corrida termina.</li>
	<li>No final da corrida (170 min após o início), abra a porta do aparelho, remova o cartucho capilar e descartá-lo para a eliminação de objectos cortantes. Descarte a placa em dispor a matéria biológica.</li>
	<li>Clique no ícone de curvas de separação na página de análise do arquivo de execução e verificar que todas as amostras têm executado corretamente e estão mostrando várias curvas de proteína em todos os vasos capilares.</li>
</ol>6. análise de proteínas de sinalização
<ol><li>Em um tubo rotulado 1,5 mL, adicionar 0,003 mL de coelho anti Anticorpos fosfo-eIF2a (p-eIF2a) e suspendê-lo em 0,3 mL (diluição 1: 100) no diluente do kit apropriado deteção de anticorpo. Em seguida, mantê-lo no gelo.</li>
	<li>Rotular um tubo de luminol e adicionar 0,15 mL de luminol e 0,15 mL de peróxido deste kit de módulo de deteção e dispense 0,01 mL em poços E1 para E25 de um fresco e automatizado prato ocidental.</li>
	<li>Dispense a 0,01 mL a secundária anti anticorpo de coelho em poços D2 para D25 e adicionar 0,01 mL de streptavidin HRP do kit para bem D1.</li>
	<li>Dispense a 0,01 mL do anticorpo primário (da etapa 6.1) em poços C2 para C25 e adicionar 0,01 mL de solução 2 diluente anticorpo poços C1 e B1 para B25.</li>
	<li>Deixe em branco os poços da linha F e preencher 0,45 mL de tampão de lavagem em 5 compartimentos de 3 linhas abaixo da linha F.</li>
	<li>Brevemente, girar as amostras refrigeradas para 3 s e adicionar 0,003 mL de cada amostra com a linha A na mesma ordem que eles foram adicionados para o ensaio de proteínas totais, a partir de A2 para A25. Adicione 0,005 mL da escada MW biotinilado bem A1 e cobrir a placa.</li>
	<li>Centrifugue a placa como feito na etapa 4.8. Enquanto a placa está girando, abrir (no computador e software automatizado de Western-associado), um novo arquivo executado e indicar na página de "Arquivo" para executar um ensaio de tamanho molecular clicando o respectivo ponto de dropdown.</li>
	<li>Na página de teste, digite os nomes do amostra cada capilar e, em seguida, digite o nome do anticorpo primário o spot alocado e o anticorpo secundário de antiabaixo coelho dela.</li>
	<li>No final da centrifugação, repita etapas 5.3 – 5.5, exceto o nome dado ao arquivo de execução desta vez deveria ser "p-eIF2a na unprimed 2 – 13 e 14 – 25 colostro-preparado".</li>
	<li>Após a separação de electroforese, verifique o arquivo de execução para picos de imune-reatividade de antígenos em tamanhos de 40 – 43 kDa. Onde MW de picos deste tamanho estão faltando, botão direito do mouse abaixo da curva e indicar dentro da lista suspensa para adicionar MW para o pico, o que garante que o tamanho e quantidade arbitrária abaixo da curva são gravados.</li>
</ol>7. tratamento dos resultados
<ol><li>Abrir um arquivo de planilha para proteína total executado em ocidental automatizado execute arquivo e fornecer um número de identificação.</li>
	<li>Abra o arquivo de execução do ensaio da proteína total na página de análise em modo de curva e marcar todos os picos em capilares individuais. Em seguida, copiar e colá-los para a planilha e soma as áreas sob a curva de todos os picos registrados no capilar inteiro.</li>
	<li>Em uma coluna separada, organize a quantidade total de proteína para cada coluna com números capilares, nomes dos núcleos do cérebro respectivos e os números de identificação dos arquivos de execução.</li>
	<li>Abrir uma planilha para o antígeno de p-eIF2a e em uma única coluna, gravar a área sob a curva de cada capilar lado a lado com seu respectivo número de capilar, o nome do núcleo do cérebro e o número de identificação do arquivo de execução.</li>
	<li>Copie a coluna de proteínas totais (paralelo com as quantidades de curva de p-eIF2a) em uma terceira planilha e calcular p-rácios de proteínas eIF2a:total em uma terceira coluna.</li>
	<li>Coletar resultados dos passos 4 a 6 para cada núcleo do cérebro, organizá-los em grupos de núcleos e gerar um gráfico de barras.</li>
</ol>

<ol><li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrigenetics+and+Nutrigenomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li>
<li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li>
<li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+the+neurons+containing+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+3-kinase+and+its+messenger+RNA+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).</li>
<li>Carter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+and+Human+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxytocin and Human Evolution.</a> Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).</li>
<li>Sippel, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+and+Stress-related+Disorders%3A+Neurobiological+Mechanisms+and+Treatment+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chronic+Stress+%28Thousand+Oaks%29%22%5BJournal%5D)">Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities.</a> Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).</li>
<li>Agnati, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+on+the+integrative+actions+of+the+brain+from+neural+networks+to+%22brain-body+medicine%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Receptors+and+Signal+Transduction+Research%22%5BJournal%5D)">Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine".</a> Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).</li>
<li>Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+regulates+gastrointestinal+motility%2C+inflammation%2C+macromolecular+permeability%2C+and+mucosal+maintenance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology%3A+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice.</a> American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).</li>
<li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+developmental+regulation+of+oxytocin+%28OT%29+and+oxytocin+receptors+%28OTR%29+in+the+enteric+nervous+system+%28ENS%29+and+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium.</a> Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).</li>
<li>Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+oxytocin+in+milk+of+cows+administered+oxytocin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin.</a> Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).</li>
<li>Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+separation+of+oxytocin%2C+norfloxacin+and+diclofenac+sodium+in+milk+samples+using+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis.</a> Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).</li>
<li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+modulates+markers+of+the+unfolded+protein+response+in+Caco2BB+gut+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+and+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells.</a> Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).</li>
<li>Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X13002398">Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).</li>
<li>Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colostrum+oxytocin+modulates+cellular+stress+response%2C+inflammation%2C+and+autophagy+markers+in+newborn+rat+gut+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+an+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi.</a> Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).</li>
<li>Donnet-Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+the+intestinal+microbiota+of+the+mother+in+neonatal+immune+education%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nutritional+Society%22%5BJournal%5D)">Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education.</a> Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).</li>
<li>Perez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+imprinting+of+the+neonatal+immune+system%3A+lessons+from+maternal+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?</a> Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).</li>
<li>Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrations+and+origin+of+oxytocin+in+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinolcia+Japonica%22%5BJournal%5D)">Concentrations and origin of oxytocin in breast milk.</a> Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).</li>
<li>Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+oxytocin+administration+on+brain+activity%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol.</a> Systematic Reviews. 5 (1), 205(2016).</li>
<li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.463.8516&rep=rep1&type=pdf">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).</li>
<li>Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+Postnatal+Brain+Development+in+the+Longest-Lived+Rodent%3A+Prolonged+Maintenance+of+Neotenous+Traits+in+the+Naked+Mole-Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 504(2016).</li>
<li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+quantitative+proteome+analysis+of+in+vivo+intestinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).</li>
<li>Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+the+jejunum+of+rats+during+the+transient+suckling-weaning+period%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutritional+Science+and+Vitaminology+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period.</a> Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).</li>
<li>Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+life+experience+shapes+the+functional+organization+of+stress-responsive+visceral+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits.</a> Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).</li>
<li>Johannes, G., Sarnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+polysomal+association+of+natural+mRNAs+encoding+c-myc%2C+BiP%2C+and+eIF4G+conferred+by+internal+ribosome+entry+sites%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites.</a> RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).</li>
<li>Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindbrain+noradrenergic+A2+neurons%3A+diverse+roles+in+autonomic%2C+endocrine%2C+cognitive%2C+and+behavioral+functions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).</li>
<li>Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+and+limbic+expression+of+CRF+and+vasopressin+during+lactation%3A+implications+for+the+control+of+ACTH+secretion+and+stress+hyporesponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness.</a> Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).</li>
<li>Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota-gut-brain+axis%3A+neurobehavioral+correlates%2C+health+and+sociality%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Integrative+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70(2013).</li>
<li>Blevins, J. E., Ho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+oxytocin+signaling+in+the+regulation+of+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Endocrine+and+Metabolic+Disorders%22%5BJournal%5D)">Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight.</a> Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).</li>
<li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+administration+of+secretin+and+oxytocin+inhibits+chronic+colitis+and+associated+activation+of+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+Motility%22%5BJournal%5D)">Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons.</a> Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654(2010).</li>
<li>Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+chemical+anatomy+of+the+afferent+vagal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).</li>
<li>Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+stress+response+of+vertebrates+is+regulated+by+four+eIF2alpha+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases.</a> Scientific Reports. 6, 32886(2016).</li>
<li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscerotopic+representation+of+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat%3A+sensory+ganglia+and+nuclei+of+the+solitary+and+spinal+trigeminal+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts.</a> Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).</li>
<li>Shapiro, R. E., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+neural+connections+of+the+area+postrema+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The central neural connections of the area postrema of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (1997).</li>
<li>Nayak, R., Pintel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viruses+can+induce+phosphorylation+of+eIF2alpha+via+PKR+activation%2C+which+can+be+overcome+by+helper+adenovirus+type+5+virus-associated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA.</a> Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).</li>
<li>Zaborske, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+systemic+and+visceral+sensory+information+by+medullary+catecholaminergic+systems+during+peripheral+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).</li>
<li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+opposes+effects+of+bacterial+endotoxin+on+ER-stress+signaling+in+Caco2BB+gut+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).</li>
<li>Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB in the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271(2009).</li>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Uma técnica para microdissection Discrete, núcleos de cérebro OTR-ricos em cérebro de ratos neonatal é apresentado neste trabalho. É bem reconhecido que os neurônios são altamente especializados, mesmo dentro de núcleos bem caracterizados no cérebro. Esta abordagem altamente reprodutível para isolar núcleos específicos de OTR ricos permite que o teste de hipótese robusto. Usando a mancha ocidental automatizado, a consistência e a reprodutibilidade dos resultados foram melhoradas. Uma limitação dessa técnica permanecendo ...

Em contraste com a nossa compreensão do desenvolvimento inicial do cérebro ocorrendo ao longo dos dias-de-semanas pós-parto, relativamente pouco é conhecido sobre a miríade de dinâmicas alterações que ocorrem nas primeiras horas de vida em ratos. Um desafio-chave tem sido o pequeno tamanho do cérebro de ratos neonatal e um requisito para ferramentas de alta tecnologia isolar regiões cerebrais discretas ou células únicas. Estudos frequentemente avaliam gene transcrição e tradução não1,2, que não dá uma firme compreensão dos níveis funcionais de moléculas sinalizadoras ativados. Outros examinam a expressão usando a imuno-histoquímica para regiões do cérebro de referência, que não permite a quantificação da expressão níveis3. Nenhum estudo até à data, analisou a ativação da sinalização de caminhos associados com colostro primeiro dos ratos, alimentação em regiões distintas do cérebro, que requer rápido isolamento e sacrifício e medição da expressão da proteína e da fosforilação de proteínas usando Western a mancha. Enquanto o cérebro microdissection é executada em cérebros maiores e mais velhos, não identificamos uma referência realizando um soco não-simples-célula cerebral em um cérebro de P0. Este trabalho apresenta um protocolo para isolar regiões restritas do cérebro neonatal usando uma técnica relativamente baixa tecnologia ponche e um Western blotting, com para medir a expressão da proteína em amostras relativamente pequenas. Este protocolo pode ser apropriado para perguntas de pesquisa que exigem a avaliação da expressão da proteína e modificações borne-translational (EG., fosforilação) nas regiões relativamente restritas de cérebros pequenos de qualquer espécie, desde que o usuário pode identificar visualmente a região do cérebro de interesse com um atlas e Marcos identificáveis.
Esta técnica foi desenvolvida para entender as mudanças que ocorrem no cérebro como resultado de colostro primeiro o neonatal dos ratos, alimentação, que é rica em ocitocina (OT). OT tem sido conhecido por sua capacidade de estimular a contração uterina e de descida de leite. No entanto, OT agora é conhecido por tocar uma ampla gama de funções na regulação de muitas funções corporais e comportamentos4. Por exemplo, OT se opõe a estresse e inflamação em conjunto com comportamentos de filiação adaptativa5, retarda o esvaziamento gástrico e diminui o trânsito intestinal. Receptores de OT (OTR) foram identificados em neurônios entéricos e epitélio intestinal6,7,8. Os efeitos gastrointestinais do OT são particularmente importantes para a criança durante o período pós-natal. Por exemplo, o aleitamento materno está associado com a entrega de quantidades significativas de OT para o intestino neonatal9,10, e os dados mostram que o OTR é fortemente overexpressed em vilosidades duodenais durante o leite Leitão período8.
Experimentos in vitro usando uma linhagem de células do intestino têm demonstrado a nível celular, a ocitocina modula moléculas importantes na tensão sinalização via11,12 e desempenha um papel regulador na tradução das proteínas 12. estes estudos sugerem que componentes do leite, incluindo ocitocina exógena da mãe, são importantes na resposta unfolded da proteína em recém-nascidos para reduzir o estresse celular13.
Estudos in vivo e ex vivo demonstraram que o colostro OT modula os marcadores de estresse celular autofagia, inflamação e resposta em vilosidades do intestino de rato recém-nascido. Enterócitos recém-nascido sofrem estresse celular substancial do seu lado luminal quando o intestino é exposto simultaneamente a microbiota da mãe no colostro14,15 e inúmeras proteínas, inclusive hormônios como OT9 , 10 , 16.
Os efeitos de OT no cérebro foram estudados17. No entanto, não foram estudados os mecanismos de sinalização OT demonstrados no intestino durante o período pós-natal do cérebro. Neste trabalho, um método para isolar núcleos cerebrais discretas no tronco cerebral neonatal rato e hipotálamo usando electroforese é usado para perfil de regiões isoladas do cérebro. O objectivo geral deste método é capturar o estado de sinalização em áreas do cérebro mais próximo possível ao nascimento, antes e após o primeiro leite Leitão, no tecido do cérebro com o índice mais baixo gliais/neuronal da pilha. A justificativa para o desenvolvimento desta técnica é que ela permite o isolamento rápido de regiões do cérebro microscópico, restrito em neonatais filhotes com uma coleção mais homogênea de neurônios para estudos ex vivo usando uma mancha ocidental automatizado metodologia, oferecendo resultados altamente consistentes em amostras relativamente pequenas dissecados. Uma lacuna de trabalhos anteriores inclui mais bruta dissecção (fatias de cérebro ou todo o cérebro) e mais velhos animais18,19. Os cérebros dos filhotes são incrivelmente dinâmicos, apresentando ondas de diferenciação glial após o nascimento. Para estudar alterações cerebrais influenciadas pela filhotes da primeira mamada, estudar núcleos neuronais restritos com dissecação reprodutível é necessário.
Alimentação de leite geralmente é analisada pelo seu impacto imunológico e nutricional na saúde ou gene expressão (por exemplo, em enterócitos20,21), Considerando que seu efeito sobre as áreas do cérebro durante o desenvolvimento do cérebro raramente é estudado. O efeito de trânsito leite no intestino na função cerebral foi analisado em referência ao intestino colecistocinina receptores vagais relé de núcleos do tronco cerebral, mas não a vias de sinalização intracelular22. Há uma vasta literatura sobre a vulnerabilidade do cérebro em desenvolvimento em recém-nascidos, a desnutrição das mães durante a gravidez23, mas os sinais de estresse e inflamação não são abordados. Importante, o método atual aproveita-se de um fenômeno em recém-nascidos de dia-zero rato que isola os estímulos de sangue-nascido colostro de relé vagal de estímulos viscerais. Este é o período de estresse chamados hipo-responsividade caracterizado por núcleo imaturo tractus solitarius (NTS)-circuito hipotálamo imediatamente após o nascimento24,,25 que restringe NTS, núcleo paraventricular (PVN), e núcleo supra-óptico (filho) sinaliza a estímulos de sangue-nascido.
Este método é útil para a análise de múltiplas vias de sinalização e relativamente restrito de células neuronais, desde que o tecido cerebral é colhido em dia-0 pós-natal em ratos, além de se as mães têm sido desafiadas ou não por qualquer tipo de tratamento durante a gravidez. Ninhadas podem ser analisadas para os efeitos do colostro versus pré-alimentação sinalização de alimentação. Ao comparar os sinais entre áreas do cérebro com pobres versus rendimento de proteína rica, esse método permite que no capilar determinação de proteína total das bandas polipeptídeo em capilares funcionam a paralelas imune-quantificação de antígenos da proteína. Esse método permite a comparação quantitativa, utilizando unidades arbitrárias, dos resultados obtidos pelo mesmo anticorpo sem curvas padrão quantitativos e por referência a proteína total por capilar. Comparar os resultados obtidos por diferentes anticorpos é possível apenas usando curvas padrão quantitativas.
Este método permitiu a avaliação de bidirecional sinalização ocorrendo entre o intestino e o cérebro e que pode afetar a função em ambos os órgãos,26. A associação entre a ingestão de oxitocina e comida, que tem sido extensivamente estudada em anos recentes27, suporta uma ligação entre a disponibilidade de nutrientes e aumento de ocitocina sinalização. Estes estudos também suportam o conceito de inverso essa energia os défices são acoplados com reduções na sinalização hipotalâmica ocitocina.
Uns estudos mais adiantados do efeito da OT na atividade cerebral demonstraram que inflamação induzida intestino suscitou cFos transcrição no hipotálamo córtex PVN, amígdala e piriform que era refratário a vagotomia28. No entanto, a infusão sistêmica de OT com secretina diminuiu a resposta de cFos do cérebro para a reação inflamatória provocada no intestino28. Isto sugere que o efeito de OT exógena foi realizado por rotas excepto relés vagais, possivelmente através de moléculas sinalizadoras transmitidas pelo sangue, realizadas através da área postrema6,29.
Neste estudo, as vias de sinalização celular stress que tenham observado anteriormente no intestino foram avaliadas no cérebro. A hipótese era de que componentes do leite podem proteger ou adiar o efeito da inflamação na permeabilidade do intestino para metabólitos microbianos e outros, e por sua vez, os efeitos sobre o funcionamento do cérebro. As diferenças claras antagônicas de IkB contra BiP sinalização encontrada nas vilosidades, antes e depois da escorva pelo colostro13, sugeriram que os cérebros de recém-nascidos, ainda no processo de desenvolvimento, podem sentir esses sinais do intestino induzida pelo colostro.
Marcadores de proteína sinalização utilizados em experiências anteriores do intestino que estão associadas com o estresse de retículo endoplasmático foram medidos. Eles incluem o acompanhante ER BiP, eIF2a de fator de iniciação de tradução (que serve como uma resposta de estresse do integrador30), eIF2a quinase p-PKR e duas proteínas de sinalização de inflamação (NF-kB e seu inibidor, IkB).
Foram escolhidas seis regiões do cérebro com base na sua capacidade em adultos secretam ou responder a OT. O NTS, localizado a medula superior, é o primeiro relé da entrada visceral e recebe sinalização direta de neurônios sensoriais vagais no intestino31 e possivelmente sangue-nascido citocinas, toxinas e hormônios através da área adjacente-postrema32. O PVN, núcleo supra-óptico (filho), núcleos striatum (STR), córtex cerebral (CX) e núcleo preóptica medial (MPO) recebem sinalização do intestino através da NTS.
Os resultados mostraram que a resposta ao estresse celular durante o período pós-natal imediato antes da escorva de colostro e imediatamente após a primeira mamada é diferente no NTS comparado ao PVN e filho. Sinalização em CX, STR e MPO diferiam do PVN e filho, também. As distintas funções protectoras das OT mostrado anteriormente para modular o estresse celular e inflamação no intestino são provavelmente sentiu por algumas áreas do cérebro. Coletivamente, os dados indicam que a nível celular, durante as primeiras horas após o nascimento, o cérebro responde ao estresse metabólico associado com insuficiência de nutrientes. Os dados também mostram que a extensão e a direção dos efeitos modulando o colostro alimentar dependem da região e que em algumas regiões, espelho efeitos OT mostrados anteriormente no intestino.

<table><tbody><tr><td>Solução Bradford Kit</td> de lise de proteína <td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Proteína simples</td><td>CBS403</td><td>Bicina / CHAPS</td></tr><tr><td>Kits WES</td><td>Proteína simples</td><td>WES-Mouse 12-230 kit mestre (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 kit mestre (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Kit mestre de proteína (PS-TP07)</td><td></td></tr> <tr><td>anti-mouse IgG HRP conjugado</td><td>Proteína simples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coelho tecnologia de sinalização celular anti-fosfo-eIF2a</td><td></td><td>SER51, 9721</td><td></td></tr><tr><td>tecnologia de sinalização celular</td><td>anti-PKR mAb de camundongo</td><td>2103</td><td></td></tr><tr><td>coelho anti-fosfo-PKR</td><td>Millipore</td><td>Thr451, 07-886</td><td></td></tr><tr><td>tecnologia de sinalização celular</td><td>anti-PKR mAb de coelho</td><td>12297</td><td></td></tr><tr><td>mAb de coelho tecnologia</td><td>de sinalização celular</td> anti-GAPDH <td>2118</td><td></td></tr><tr><td>tecnologia de sinalização celular</td> <td>anti-fosfo-IKB mAb de camundongo</td><td>9246</td><td></td></tr><tr><td>tecnologia de sinalização celular</td><td>anti-IKB mAb de camundongo</td><td>4814</td><td></td></tr><tr><td>tecnologia de sinalização celular</td><td>anti-BiP de coelho</td><td>3183</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>anti-GCN2 de coelho</td><td>3302</td><td></td></tr><tr><td>mAb de coelho anti-fosfo-GCN2</td><td>BIORBYT</td><td>T899</td><td></td></tr><tr><td>grávida Ratos Sprague-Dawley</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de perfuração</td><td>WellTech Rapid Core ou Harris Uni-Core</td><td>0,35, 0,50, 0,75, 1,0, 1,20, 1,50</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

O objetivo do presente protocolo é isolar núcleos de cérebro ricas de receptores de ocitocina no cérebro neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro. A expressão de proteínas conhecidas para responder ao estresse metabólico foi medida em cérebro-núcleos isolados usando a mancha ocidental. Isso foi feito para avaliar se induzida por estresse metabólica insuficiência nutriente no corpo provocado estresse neuronal. Demonstramos anteriormente que a insuficiência de nutrientes em recém-nascidos provoca estresse metabólico no intestino. Além disso, a ocitocina colostro modula marcadores de estresse celular autofagia, inflamação e resposta em vilosidades do intestino de rato recém-nascido antes e depois da primeira alimentação. Sinalização de marcadores de proteínas associadas com o estresse de retículo endoplasmático [ER acompanhante imunoglobulina proteína (BiP), 2A de fator de iniciação eucariótico tradução (eIF2a) e quinase da proteína quinase eIF2a R (p-PKR)], bem como dois sinalização de inflamação proteínas [fator nuclear-κB (NF-kB) e inibidor κB (IkB)], foram medidos em núcleos do cérebro recém-nascido [núcleo do trato solitário (NTS), núcleo paraventricular (PVN), núcleo supraóptico (filho), córtex (CX), núcleos striatum (STR), e núcleo preóptica medial (MPO)] antes do primeiro feed (unprimed pelo colostro) e após o início da enfermagem (preparado pelo colostro). Expressão de BiP/GRP78 e p-eIF2a foram upregulated em unprimed e ativador em tecido NTS condicionado. NF-kB foi mantida (alta) no citoplasma CX, STR e MPO, Considerando que o NF-kB foi inferior e inalterado no NTS, PVN e filho em ambas as condições. O BiP coletiva e p-eIF2 achados são consistentes com uma resposta ao estresse. eIf2a foi fosforilada pela quinase dependente do dsRNA (p-PKR) no filho, CX, STR e MPO. No entanto, no NTS (e em menor medida no PVN), eIf2a foi fosforilada pela outra quinase, quinase de controle geral nonderepressible-2 (GCN2). Os mecanismos de estresse-modulando anteriormente observados em enterócitos do intestino recém-nascido parecem ser espelhado em algumas regiões do cérebro ricas OTR. A NTS e PVN podem utilizar um mecanismo de fosforilação diferente (sob deficiência nutricional) de outras regiões e ser refratário ao impacto da insuficiência de nutrientes. Coletivamente, estes dados sugerem que respostas do cérebro ao estresse de insuficiência de nutrientes são compensadas por sinalização de colostro-aprontadas enterócitos.

As bandas representativas da imunorreatividade em relação à proteína total mostram que existem núcleos de cérebro com muito baixa proteína colhido. Isso requer o uso da técnica automatizada de Western blot, que é altamente sensível em comparação com o borrão ocidental canônico. Esta abordagem pode ser executada com fortyfold menos proteína por capilar em comparação com o por-lane em borrões ocidentais.
Efeitos diferenciais de escor...

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de cérebro em cérebro de ratos neonatal, em conjunto com a primeira mamada do colostro. Esta técnica permite o estudo do stress de insuficiência de nutrientes no cérebro como modulada por sinalização do enterócito.

Avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos Neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de desenvolvimento pós-natal sobre a forma como a amamentação do leite influencia a sinalização de estresse no cérebro. Esta técnica pode ser usada para capturar áreas cerebrais específicas durante o primeiro período natural de fome e compará-las com respectivas áreas logo após a primeira alimentação natural do colostro. Entender como mamar influencia a fisiologia do comportamento e da emoção permite o uso de um antagonista a vários receptores durante a análise do tecido cerebral ex-vivo.Para obter os socos dos núcleos, remova os filhotes de rato pela cauda com uma mão enluvada. Depois de colher o cérebro, coloque rapidamente todo o órgão em um molde cerebral de metacrilato de polimetil à temperatura ambiente e use imediatamente uma nova lâmina de barbear para fazer fatias de 500 micrômetros de espessura do tecido. Coloque as fatias rostral para caudal em uma placa de Petri como elas são obtidas para manter a orientação correta das seções.Quando todo o cérebro for seccionado, adicione rapidamente fluido espinhal cerebral artificial sem glicose ao prato e incuba as fatias por 60 minutos a 28 a 30 graus Celsius com agitação constante em um agitador orbital. Use um atlas cerebral e marcos anatômicos em cada tecido para identificar os núcleos cerebrais a serem perfurados e colocar a fatia com os núcleos de interesse em uma nova placa de Petri sob um microscópio dissecando. Uma vez visualizado, use uma ferramenta de coring para perfurar rapidamente quatro a seis núcleos diferentes e imergir rapidamente cada núcleo perfurado em 0,06 mL de tampão de extração de proteína gelada no tubo de microcrífugo apropriadamente rotulado contendo inibidores de protes e inibidores de fosfatase por 60 minutos.No final da incubação, centrifugar os núcleos extraídos em uma mini centrífuga resfriada, e usar uma micro-pipeta para transferir cuidadosamente 0,055 mL de supernacer de cada tubo para o tubo de microcrédito de 1,5 mL pré-resfriado apropriado no gelo. Antes do armazenamento negativo de 20 graus Celsius, transfira 0,012 mL de supernadante de cada tubo de estoque de proteínas para o tubo pré-resfriado apropriado de 0,5 mL no gelo para a primeira preparação da amostra. Para preparar as amostras para a medição da proteína in-capilar, adicione 0,003 mL de reagente de mistura mestre de um kit de lise proteica a cada uma das amostras nos tubos rotulados de 0,5 mL.Em seguida, adicione 0,004 mL de reagente de mistura mestre a uma solução de escada de peso molecular biotinína em 0,016 mL de água desionizada, e desnaturar as amostras de extrato de escada e proteína em um bloco de calor de 95 graus Celsius, armazenando todos os tubos a quatro graus Celsius após cinco minutos. Para análise de proteína de sinal, adicionar 0,01 mL de solução de peróxido de luminol recém-preparada aos poços E-1 a E-25 de uma nova placa ocidental automatizada, 0,01 mL de anticorpo anti-rato secundário aos poços D-2 a D-25, e adicionar 0,01 mL de peroxidase de rabanete streptavidin do kit para bem D-1. Adicione 0,01 mL de anticorpo primário recém-preparado nos poços C-2 a C-25, e 0,01 mL de anticorpo diluiente duas soluções para os poços C-1 e B-1 a B-25.Deixe os poços F de linha vazios e encha os cinco compartimentos das três linhas abaixo da linha F com 0,45 mL de tampão de lavagem. Em seguida, gire brevemente as amostras refrigeradas por 30 segundos e adicione 0,03 mL de cada amostra a cada poço da linha A, começando com A-2. Em seguida, adicione 0,005 mL da escada de peso molecular biotinilada até bem A-1 e cubra a placa para centrifugação.Enquanto a placa é centrifugada, abra um novo arquivo de execução no software associado ocidental automatizado e inicie um ensaio de tamanho molecular. Na página de ensaio, insira os nomes da amostra em cada capilar, bem como os nomes dos anticorpos primários e secundários. No final da centrifugação, coloque a placa no instrumento ocidental automatizado e retire a tampa da caixa do cartucho capilar.Após a centrifugação, não se esqueça de inspecionar bolhas de ar, pois bolhas de ar no capilar podem bloquear a corrente eletroforética e falhar toda a rodada. Insira o cartucho na posição designada dentro do instrumento e feche a porta. Clique em iniciar.Quando solicitado com o tipo de ensaio, digite o nome do experimento na caixa de texto apropriada e clique em ok. Quando solicitado pela data de execução ativada e pelo número de identificação no arquivo de execução, anote o momento em que a execução termina. No final da corrida, descarte o cartucho capilar no descarte de nitidez e a placa no descarte de materiais de risco biológico.Após a separação da eletroforese, verifique os arquivos de execução para picos de reatividade imunológica de antígenos em 40 a 43 kilodaltons que representam o fator de iniciação da tradução eucariótica fosforilado 2A. Onde faltam picos de peso molecular deste tamanho, clique com o botão direito do mouse abaixo da curva e selecione adicionar peso molecular ao pico para garantir que os tamanhos e quantidades arbitrárias abaixo da curva sejam registrados. Dentro das amostras de tecido unprimeds, os níveis de proteína de amino globulina nos núcleos da pista solitária são significativamente maiores em comparação com todas as outras regiões.A escorraça do tecido intestinal com colostro diminui os níveis de proteína de amino globulina nos núcleos da pista solitária e não tem efeito sobre núcleos paraventriculares e núcleos super-ópticos. Por outro lado, o escoramento aumenta os níveis de proteína de amino globulina de ligação dentro do córtex, núcleos de estriação e núcleos preópticos medial em relação ao tecido não primogêntico, implicando que os níveis de proteína de amino globulina nos vários núcleos cerebrais testados respondem de forma diferente ao estripamento intestinal e ainda não há qualquer conversa cruzada demonstrada entre os vários núcleos testados. Fator de iniciação da tradução eucariótica 2A e fator de iniciação de tradução eucariótica fosforilado fator 2A são elevados na condição não primogêntica em relação a outros núcleos.Após o priming, os níveis de iniciação de tradução eucariótica 2A e fator de iniciação de tradução eucariótica fosforilado 2A são reduzidos em relação aos núcleos da faixa solitária em comparação com o tecido não primogênito. Em todos os outros núcleos testados, o priming aumenta os níveis de iniciação de tradução eucariótica 2A e fator de iniciação de tradução eucariótica 2A em relação ao tecido não primogênito. No entanto, os níveis de receptor de proteína fosfoilada quinase são baixos em amostras não primed em relação a amostras preparadas em núcleos da faixa solitária, sugerindo fortemente que outra quinase está envolvida na fosforilação do fator de iniciação de tradução eucariótica 2A.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo do desenvolvimento pós-natal explorarem as vias de sinalização envolvidas no crescimento e diferenciação tecidual e se são influenciadas ou independentes da amamentação. Não se esqueça que trabalhar com agentes de redução voláteis como, por exemplo, dithiothreitol, pode ser perigoso, e precauções como a preparação na capa química devem ser sempre tomadas na preparação deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um modelo de rato do transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), que revela as alterações persistentes na função neuroendócrina eo atraso de longo prazo, resposta de medo exagerado, característico de pacientes com TEPT. O modelo animal e os métodos descritos aqui são úteis para correlacionar biomarcadores em núcleos do cérebro, que são mecanicista, mas não pode ser medido em pacientes com biomarcadores em células brancas do sangue periférico, os quais podem.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Este vídeo demonstra o isolamento de núcleos ricos em receptores de ocitocina do cérebro de ratos neonatais. O corte coronal, seguido pela identificação e punção precisa dos núcleos cerebrais ricos em receptores de ocitocina, permite a extração eficaz de núcleos ricos em receptores de ocitocina para análise posterior.

Isolamento de núcleos ricos em receptores de ocitocina de um cérebro de rato neonatal

Este artigo descreve o uso de residente intruso estresse social crônico como um paradigma ethologically relevantes para a depressão pós-parto modelo e ansiedade em roedores lactantes.

Usando Social Stress Crônico ao Modelo depressão pós-parto em lactação Roedores

Este documento descreve os procedimentos para a estimulação tátil de filhotes de ratos e posterior coloração de Golgi-Cox da morfologia neuronal. A estimulação tátil é uma experiência positiva que é administrada no período perinatal por acariciar filhotes com um espanador doméstico. Coloração de Golgi-cox é um processo fiável que permite a visualização dos neurónios inteiras.

Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração

Estamos medindo a sensibilidade ea ativação de células mastro mecânico perigenital na próstata masculina de camundongos C57BL / 6 que foram submetidos a um paradigma de estresse precoce - separação materna neonatal, de modo a induzir um modelo pré-clínico de síndrome de dor pélvica / crônica prostatite crônica.

Avaliação da Perigenital Sensibilidade e Prostatic Mast Ativação celular em um rato modelo de Separação Materna Neonatal

Eventos de vida estressantes prejudicam a função cognitiva, aumentando o risco de transtornos psiquiátricos. Este protocolo ilustra como o estresse afeta a flexibilidade cognitiva usando uma estratégia de operante automatizada que muda paradigma em ratos de Sprague Dawley masculino e feminino. Áreas cerebrais específicas subjacentes a comportamentos particulares são discutidas, e a relevância translacional dos resultados é explorada.

Avaliação dos efeitos do estresse na flexibilidade cognitiva usando um paradigma de mudança de estratégia operante

O paradigma do estresse psicossocial crônico (CGS) emprega estressores clinicamente relevantes durante a gravidez em camundongos para modelar transtornos psiquiátricos de mães e bebês. Aqui, fornecemos um procedimento passo-a-passo de aplicação do paradigma CGS e avaliações a jusante para validar esse modelo.

Usando um modelo murino de estresse psicossocial na gravidez como um paradigma transcanalmente relevante para transtornos psiquiátricos em mães e bebês

Aqui, apresentamos um protocolo conciso para a criação de um modelo de rato prematuro, facilitando a pesquisa sobre o manejo precoce da dor pós-parto. O método envolve a realização de uma cesariana três dias antes do nascimento esperado, a extração de filhotes de ratos prematuros por meio de histerectomia e a integração deles com a prole biológica de uma mãe de aluguel.

Um modelo de rato prematuro para estudos da dor

O parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) é um problema de saúde global urgente com opções de prevenção e tratamento abaixo do ideal. Apresentamos um modelo de camundongo de parto prematuro induzido por infecção bacteriana vaginal ascendente e descrevemos como analisar a morbidade e mortalidade neonatal resultante.

Modelagem de infecção vaginal ascendente, parto prematuro e morbidade neonatal em camundongos

Este protocolo descreve um modelo animal para estudar como a adversidade no início da vida, provocada por um ambiente empobrecido e cuidados maternos imprevisíveis durante o período pós-natal precoce, afeta o desenvolvimento do cérebro e o risco futuro de transtornos mentais.

Cama e nidificação limitadas como modelo para adversidades no início da vida em camundongos

O artigo fornece um protocolo abrangente para gerar um modelo de camundongos de ativação imunológica materna (MIA) para estudar os efeitos da inflamação gestacional precoce no neurodesenvolvimento, incluindo métricas-chave para garantir confiabilidade e reprodutibilidade.

Geração do modelo de camundongo de ativação imunológica materna gestacional precoce para avaliar a inflamação pré-natal no neurodesenvolvimento

Aprenda a isolar núcleos cerebrais de ratos neonatais para estudar sinalização de estresse antes e depois da primeira mamada de colostro. Este método permite analisar vias de desenvolvimento pós-natal.

Avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos Neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos Neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro

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