Name: Cultivo e manipulação das células da crista Neural de O9-1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a cultivar e diferenciar células O9-1 da crista neural de camundongo usando técnicas de siRNA e CRISPR-Cas9. Este protocolo oferece um modelo robusto para estudos in vitro em neurociência e biologia celular.

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Nicole Stancel, pH.d., ELS, de publicações científicas do Instituto do coração do Texas, prestou apoio editorial. Agradecemos também as seguintes fontes de financiamento: nacional Center cientista desenvolvimento Grant a associação americana do coração (14SDG19840000 de J. Wang), o prêmio de pesquisa Lawrence 2014 do Rolanette e osso Lawrence Berdon doença programa do Texas (para J. Wang ) e os institutos nacionais de saúde (DE026561 e DE025873 para J. Wang, DE016320 e DE019650 de R. Maxson).

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<li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-activated+kinase+1+%28Tak1%29+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li>
<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
<li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway%3A+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li>
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<li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo%2FYap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38(2016).</li>
<li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li>
<li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+organ+development%2C+homeostasis%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li>
<li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li>
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<li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118(2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li>
<li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208(2016).</li>
<li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li>
<li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%2C+but+not+collagen+I%2C+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004(2012).</li>
<li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li>
<li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O NCC é um contribuinte versátil e chave para diferentes tecidos e órgãos durante a morfogênese embrionária. A linha de celular O9-1 mantém seu potencial para se diferenciar em muitos tipos de células diferentes e imita as características na vivo do CNCC, tornando-o uma ferramenta útil em vitro para estudar a função dos genes e Regulamento molecular em CNCC. O status diferente de células O9-1 pode corresponder a diferentes crista neural progênie na vivo, dependendo das condições de cultura de c...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Crista neural (CNCC) são células estaminais, como com uma notável capacidade migratória e transitória existência durante o desenvolvimento embrionário. CNCC originam entre o ectoderma superficial e o tubo neural e migra para outras partes do embrião durante o desenvolvimento embrionário1. Com base em seus domínios funcionais, CNCC pode ser classificados em vários tipos diferentes, incluindo crânio, tronco, vagal, sacral e cardíaca CNCC. Além disso, a CNCC pode se diferenciar em várias linhagens de células, como células musculares lisas, células ósseas e neurônios e dar origem a vários tecidos2,3. O desenvolvimento da CNCC caracteriza-se por uma série complexa de eventos morfogenéticas que são ajustados por vários sinais moleculares. Tendo em conta o Regulamento complexo do CNCC e suas importantes contribuições para numerosas estruturas, o dysregulation do desenvolvimento do NCC comumente pode originar defeitos congênitos do nascimento, que respondem por cerca de 30% de todos os defeitos congênitos humanos do nascimento. Anomalias durante o desenvolvimento da crista neural podem levar a fissura lábio/palato, defeito defeitos de formação do nariz, síndromes, tais como um tracto de saída cardíaca defeituosa do, ou até mesmo mortalidade1,4,5, 6 , 7. compreender os mecanismos moleculares do desenvolvimento do NCC é importante para o desenvolvimento de tratamentos para doenças causadas por defeitos no desenvolvimento do NCC. Com o uso de vários in vitro e in vivo se aproxima de8,9,10,11,12,13,14 ,15, consideráveis progressos na investigação do NCC. In vivo, modelos animais, incluindo galinhas, anfíbios, peixe-zebra e ratos, têm sido utilizados para investigar a CNCC1. Além disso, os embriões humanos têm sido utilizados para estudar o processo de migração do NCC em início de desenvolvimento de embrião humano16. In vitro, modelos de celular para CNCC, tais como CNCC humana que originou-se paciente da gordura subcutânea, têm sido utilizados para investigar a doença de Parkinson17. Linha O9-1 NCC, que foi originalmente derivada de culturas em massa da CNCC endógenas isoladas de 8.5 de embriões de rato18, é um modelo de célula poderoso para estudar CNCC. importante, em condições não-diferenciação de cultura, são células O9-1 multipotentes haste-como CNCC. No entanto, sob condições variáveis de cultura, células O9-1 podem ser diferenciadas em tipos celulares distintos, tais como células musculares lisas, osteoblastos, condrócitos e células gliais18. Devido a essas propriedades, O9-1 células têm sido amplamente utilizadas para estudos relacionados ao NCC, como investigar o mecanismo molecular de defeitos crânio-facial19,20.
Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para manter células O9-1, diferenciar células O9-1 em diferentes tipos de células e manipulando células O9-1 através da realização de estudos de perda--função do gene com edição de genoma CRISPR-Cas9 e RNA de interferência pequeno (siRNA)- mediada por tecnologias "knockdown". Como um exemplo representativo, é descrito o uso de células-O9-1 para estudar Yap e Taz perda de função. Yap e Taz são os efetores a jusante do hipopótamo sinalizando a via, que desempenha um papel crítico na proliferação celular, diferenciação e apoptose. O caminho de Hippo também foi mostrado para ser importante no desenvolvimento e na homeostase de diversos diferentes tecidos e órgãos, bem como na patogênese de doenças diferentes20,21,22,23 ,24,25,26,,27,28. Os principais componentes de hipopótamo sinalização incluem os tumor supressor estéril 20-como quinases Mst1/2, proteína que contém o domínio WW do andaime Salvador e as quinases de homólogo (Lats1/2) de supressor de tumor grande. Sinalização de hipopótamo inibe a atividade de Yap e Taz e promove sua degradação no citoplasma. Sem repressão do hipopótamo, Yap e Taz podem translocar em núcleos e funcionar como co-ativadores transcricionais. Recentemente mostramos que especificamente inactivar o hipopótamo sinalização efetores Yap e Taz no mouse CNCC usando o Wnt1cre e Wnt1Cre2SOR motoristas resultaram na letalidade embrionária em E10.5 com graves defeitos craniofaciais20. Também Efetuamos estudos utilizando células O9-1 para investigar o papel de Yap e Taz em CNCC. Para estudar a função Yap e Taz no NCC proliferação e diferenciação, Yap e o Taz knockdown células foram geradas nas células O9-1 usando siRNA, e células de nocaute de Yap foram geradas usando CRISPR-Cas9 edição do genoma. As mesmas estratégias de perda de função do gene podem ser aplicadas a genes-alvo diferente em outras vias. Além disso, ganho-de-função estudos e ensaios de transfeccao também podem ser aplicados às células de O9-1 para estudar a regulação e a função dos genes. Os protocolos descritos aqui destinam-se a ser utilizado por investigadores como guias para cultivo de células O9-1 para manter stemness multipotentes, para diferenciar O9-1 células em outros tipos de células sob condições de cultura diferente e para estudar a função dos genes e os mecanismos moleculares da CNCC.

<table><tbody><tr><td>Células alimentadoras ativas de STO</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1503</td><td>Também disponível na forma inativada por mitomicina C, catálogo # ATCC 56-X</td></tr><tr><td>O9-1 linha celular de crista neural craniana de camundongo</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, sem glutamina</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS (soro bovino fetal)</td><td>Millipore Sigma</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina - estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25% em HBSS</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco) sem cálcio ou magnésio</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos não essenciais (MEM NEAA) 100Xx</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO fator inibidor de leucemia (LIF) 106 unidade/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos humanos recombinantes-básico (rhFGF-básico)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Matriz Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x)</td> <td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo, alfa 1x com sais de Earle, ribonucleosídeos, desoxirribonucleosídeos e L-glutamina</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-041057</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-046247</td><td></td></tr><tr><td>FCS (soro fetal de bezerro)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ITS (insulina-transferrina-selênio)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF-b3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td><td></td><td></td><td></td>ascórbico</tr><tr><td>BMP2 (proteína morfogenética óssea 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Suplemento <td></td><td></td><td></td> de dexametasona<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> B-27</tbody></table>

cultivo e manipulação das células da crista neural de o9-1

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Células da crista neural (CNCC) estão migrando de células tronco que podem se diferenciar em diferentes tipos de células e dar origem a vários tecidos e órgãos. A linha de celular O9-1 é derivada o endógeno CNCC embrionárias de rato e mantém a sua multipotency. No entanto, em condições de cultura específica, O9-1 células podem se diferenciar em diferentes tipos de células e ser utilizadas em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. Recentemente, com a combinação de estudos de rato e de células O9-1, mostramos que o hipopótamo efetores da via de sinalização Yap e Taz desempenham importantes funções no desenvolvimento craniofacial crista neural-derivado. Embora o processo de cultivo de células O9-1 é mais complicado do que o utilizado para outras linhas de célula, a linha de celular O9-1 é um poderoso modelo para investigar a CNCC em vitro. Aqui, apresentamos um protocolo para a linha de celular O9-1 para manter a sua stemness, bem como protocolos para diferenciar células O9-1 em diferentes tipos de células, como células de músculo liso e osteoblastos de cultivo. Além disso, os protocolos são descritos para a realização de estudos de perda-de-função do gene em células O9-1 usando CRISPR-Cas9 exclusão e pequena interferência mediada por RNA "knockdown".

O objetivo das nossas experiências knockdown e nocaute foi estudar os efeitos de Yap e Taz perda-de-função nas células O9-1. Antes os experimentos knockdown e nocaute, temos que certificar-se que preparam para mídia basal e células de cultura O9-1 como descrito acima (por exemplo, necessidades de matriz membrana basal para cobrir a placa inteira como mostrado na Figura 1e O9-1 células recuperadas de nitrogênio líquido como mostrado na <stron...

O9-1 é uma linhagem de células multipotentes rato crista neural. Aqui descrevemos protocolos passo a passo detalhados para cultivo de células O9-1, diferenciar células O9-1 em tipos de células específicas e manipulando geneticamente células O9-1 usando mediada por siRNA nocaute ou CRISPR-Cas9 edição do genoma.

Cultivo e manipulação das células da crista Neural de O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

A linha celular O9-1 é uma ferramenta muito útil para estudar células de crista neural in vitro. Tem um grande potencial para uso em uma ampla gama de aplicações em vários usos de pesquisa. As células O9-1 têm vantagens óbvias, como fácil acesso, e rapidamente obtenção de números celulares suficientes para experimentos, tornando-se um método poderoso de cortesia a estudos in vitro de células de crista neural.Para começar, prepare a mídia basal para a cultura celular O9-1, de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, filtre a mídia basal e enrole-a em papel alumínio para protegê-la da luz. Depois disso, colete mídia basal condicionada de células STO ativadas de acordo com o protocolo de texto.Primeiro, descongele uma alíquota da matriz de membrana do porão no gelo por duas horas. Em seguida, diluir a matriz de membrana do porão com DMEM esterilizado filtrado com 10% de FBS a uma concentração final de 0,5mg/ml. Cubra a placa com a matriz de membrana do porão em temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, aspire a matriz de membrana do porão enquanto inclina a placa. Seque as placas a 30 graus Celsius por 30 minutos. Ao adicionar a matriz de membrana do porão à placa, certifique-

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Para cultivar células-tronco da crista neural (NCSC) in vitro, um meio especial (NCSCM) é necessária. Parte essencial da NCSCM é extrair pinto embrião (CEE). Nós aqui descrever as técnicas precisas para produzir uma quantidade maximizada de puro e de alta qualidade CEE, incluindo detalhes como o isolamento, maceração, centrifugação, filtração e processos.

Produção de Extrato de embrião de galinha para o cultivo de células-tronco neurais murino Crest

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso...

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Este vídeo demonstra o uso de pequenos RNAs interferentes (siRNA) para silenciar genes específicos de interesse em células-tronco neurais e diferenciá-los em tipos de células desejados usando o meio de diferenciação apropriado. Este procedimento permite o estudo do papel crítico de genes específicos no processo de diferenciação de células-tronco neurais.

Silenciamento de genes mediado por siRNA em células-tronco neurais

Este vídeo ilustra uma técnica para isolar as dobras neurais cranianas da região do mesencéfalo de embriões de pintinhos. Apresenta um processo detalhado de dissecção das dobras neurais, sua colocação e fixação em lamínulas revestidas com fibronectina, seguido pela observação da migração das células da crista neural das dobras neurais.

Isolando dobras neurais cranianas de um embrião de pintinho para uma cultura de células da crista neural

Este protocolo descreve a dissecção e a cultura de pilhas neurais cranianas da crista dos modelos do rato, primeiramente para o estudo da migração da pilha. Nós descrevemos as técnicas ao vivo da imagem latente usadas e a análise da velocidade e da forma da pilha muda.

Dissecção, cultura e análise de células da crista neural craniana primária do mouse para o estudo de delaminação e migração de células de crista neural

Neste protocolo, descrevemos uma estratégia de diferenciação estável e altamente eficiente para a geração de neurônios simpáticos pós-ganglionários a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este modelo disponibilizará neurônios para o uso de estudos de múltiplos distúrbios autônomos.

Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neurorregenerativa de glia ensheathing glia (OEG), após lesão neural. Baseia-se em uma cocultura de neurônios gânglios de retina adulto axotomizados (RGN) em monocamadas OEG e estudo subsequente de regeneração axonal, analisando marcadores axonal e somatodendritic RGN.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

Protocolos passo a passo detalhados são descritos aqui para o estudo de sinais mecânicos in vitro usando células de crista neural O9-1 multipotentes e hidrânis de poliacrilamida de rigidez variada.

Um sistema otimizado de O9-1/Hidrogel para estudar sinais mecânicos em células de crista neural

Este protocolo versátil descreve o isolamento das células de crista neural pré-cardíaca (NCCs) através da excisão de dobras neurais cranianas de embriões de filhotes. Após o revestimento e a incubação, as DCNT migratórias emergem das explicações da dobra neural, permitindo a avaliação da morfologia celular e da migração em um ambiente 2D simplificado.

Preparação e Análise Morfológica das Culturas celulares da crista neural do pintinho

Este protocolo descreve um experimento de migração in vitro adequado para a análise funcional das moléculas envolvidas na migração in vivo de células da crista neural para a matriz extracelular rica em hialuronano.

In vitro Investigação dos Efeitos da Matriz Extracelular Rica em Hialuronano na Migração de Células da Crista Neural

Apresentamos um protocolo de diferenciação in vitro tridimensional (3D) gerando neuroesferas de tamanho reprodutível para produzir células da crista neural craniana a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. Mostramos que essa metodologia reduz a variabilidade em comparação com os protocolos anteriores e como ela pode ser usada para ensaios multiplexados para estudar o desenvolvimento das células da crista neural craniana.

Células de crista neural craniana tridimensionais in vitro protocolo de diferenciação para ensaio multiplexado

Aprenda a cultivar e diferenciar células O9-1 da crista neural de camundongo usando técnicas de siRNA e CRISPR-Cas9. Este protocolo oferece um modelo robusto para estudos in vitro em neurociência e biologia celular.

Cultivo e manipulação das células da crista Neural de O9-1

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