Name: Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a imagem de sinalização de cálcio em células específicas na junção neuromuscular de ratos usando camundongos transgênicos. Este método permite visualizar dinâmicas celulares em resposta à estimulação nervosa.

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Este trabalho foi financiado com fundos de institutos nacionais de saúde (NIH) GM103554 e GM110767 a (T.W.G.) e do centro nacional de pesquisa recursos 5P20RR018751 e o Instituto Nacional de ciências médicas de geral 8P 20 GM103513 (para G.W.H.).

Pecuária e experimentos foram realizados em conformidade com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e o IACUC na Universidade de Nevada.
1. preparação dos diafragmas e nervos frênico de ratos transgênicos
<ol><li>Compre ratos transgénicos e primeiras demão do oligonucleotide genótipo estes ratos. Nota: Os primers são listados na página "Informações" para cada um destes ratos.<ol>
<li>Criar um mouse de 3 a 6 meses de idade, expressando uma cópia do apropriado transgénicos/TOC-no alelo Cre-motorista e zero cópias do alelo GCaMP3/6 condicional com um segundo mouse da mesma idade expressando uma ou duas cópias da condicional GCaMP3 / 6 alelo e zero cópias do alelo Cre-driver.</li>
		<li>Genótipo a filhotes e mark aqueles que possuem Cre e condicional GCaMP3/6 alelos — estas daqui em diante serão chamadas ratos transgénicos-duplo (por exemplo, Myf5-Cre, GCaMP3 condicional)6. Nota: Deste modo, todos os dados irão derivar de ratinhos expressando uma cópia do Cre e condicional GCaMP3/6 alelos. Isto é particularmente importante quando adicionando em outros ratos mutantes (por exemplo, nocautes) em cruzes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando os ratos duplo-transgênicos são de idade apropriada (por exemplo, dia pós-natal 0 ou 5 [P0 ou P5] ou adulto), eutanásia os ratos por decapitá-los com uma tesoura (para ratos mais jovens que P10) ou colocando-os em uma câmara de inalação de isoflurano — quando eles estão Já não responsivo a beliscar o rabo com um par de pinças, estão prontos para o sacrifício.</li>
	<li>Sacrifica o animal por decapitação com um par de tesouras.</li>
	<li>Transversalmente a seção do outro lado o animal inteiro logo abaixo do fígado e imediatamente acima do coração e pulmões com uma tesoura de iridectomy.</li>
	<li>Disse, embora o fígado, o coração e os pulmões, tendo o cuidado de manter um comprimento do nervo frênico que é suficientemente longo para ser desenhado em um eletrodo de sucção (ou seja, 1-2 cm). Nota: O nervo frênico esquerdo pode ser identificado como um pedaço de tecido que insere a porção medial do diafragma esquerdo branco. Não deve ser cortada quando retirar os pulmões. O nervo frênico direito é executado dentro de um pedaço da fáscia que também contém a veia cava superior e é mais fino e mais branco que a veia cava. Juntos, ambos penetram o diafragma direito medial.</li>
	<li>Ainda mais, remova a caixa torácica e coluna vertebral, excepto o cume fina em torno do diafragma.</li>
	<li>Coloque o diafragma e o exemplo do nervo frênico em um tubo de microcentrífuga com solução de Krebs-Ringer com 1 µ g/mL 594-αBTX por 10 min no escuro. Nota: Esta concentração de 594-αBTX rótulos receptores ACh (AChRs) sem bloquear sua função (observação pessoal).</li>
</ol>2. estimulação e gravação dos potenciais de ação muscular
<ol><li>Usando os pinos minutien, imobilizar o diafragma fixando em um prato de 6 cm revestido com gel de silicone dielétrico e repleto de ~ 8 mL de solução de Krebs-Ringer oxigenada e coloque-a sobre a fase de microscópio. Perfundir o diafragma com mais solução de Krebs-Ringer (8 mL/min) por 30 min. Nota: Isto enxágua o desacoplado 594-αBTX, bem como se equilibra o tecido após a dissecação.</li>
	<li>Fazer um eletrodo de sucção de acordo com os métodos estabelecidos7.<ol>
<li>Na ampliação de 4x, usando um micromanipulador, mova o eletrodo de sucção sobre o nervo frênico esquerdo e aplique sucção puxando para fora do cano de uma seringa de 5 mL, conectado à tubulação que é anexada ao eléctrodo de sucção. Nota: Quando desenhada com êxito para o eletrodo de sucção, o nervo frênico é tenso. Ligue o estimulador e estimular o frênico nervo lançando o manual switch 1 x.</li>
		<li>Certifique-se de que o diafragma contratos em resposta à estimulação de 1 Hz, examinando visualmente com iluminação brightfield. Caso contrário, ajuste a tensão, girando o botão de tensão incrementalmente para alcançar um pulso de supramaximal, que pode ser verificado através de um exame visual da contração muscular. Se ainda não é visível, explodir o nervo com a seringa e tente desenhá-lo novo aplicando sucção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desligue a perfusão e adicionar a miosina de músculo específico inibidor BHC6 ou o canal de sódio voltagem-dependentes antagonista µ-conotoxina8 para uma concentração final de 100 µM.<ol>
<li>Para fazer 100 µM BHC, pipete 4 µ l de estoque de 200 mM em DMSO e predilute-lo em 1 mL de solução de Krebs-Ringer.</li>
		<li>Retire o prato, 1 mL de solução de Krebs-Ringer.</li>
		<li>Adicione o BHC pré-diluído, ao prato. Nota: Este pré diluição ajuda a evitar a indução de DMSO não diluído de uma resposta de fluorescente não transitório em células GCaMP3-expressando.</li>
		<li>Espere 30 min e em seguida, ligue a perfusão de solução de Krebs-Ringer fresca por mais 20-30 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o eléctrodo de gravação.<ol>
<li>Usando luvas, colocar um vidro de borosilicato filamentado com um diâmetro externo (OD) de 1 mm e um diâmetro interno (ID) de 0,4 mm em um extrator de micropipeta e aperte os mostradores para apertá-lo em posição. Feche a porta do extrator.</li>
		<li>Usando um extrator de P-97, programar a seguinte configuração: calor em 900, puxe a 120, velocidade em 75, tempo em 250, pressão no 500 e sem loops adicionais. Nota: Resistance (R) é medido usando controles de software do amplificador: o software de aquisição de dados confirma resistência resolvendo-se a fórmula V = ir O controlador de software passa uma conhecido corrente (I) (tipicamente 1 nA) através do eletrodo e mede a mudança de tensão (V), permitindo assim que resolver para R.</li>
		<li>Para diafragmas embrionários, certifique-se de que a resistência está perto de 60 MΩ e para o mais velho dos diafragmas, 10-20 MΩ. Carrega o eléctrodo de gravação com 3 M de KCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na ampliação de 10x, baixe o eletrodo muscular, usando um segundo micromanipulador no lado oposto do palco como um eletrodo de estimulação.</li>
	<li>Usando o software de aquisição de dados eletrofisiológicos, esperar até que o potencial de membrana de repouso muda de 0 para -65 mV ou abaixo.</li>
	<li>Estimular a 1 Hz e verificar a presença de um potencial de ação muscular, verificando-se para um grande potencial que apresenta uma modesta taxa de superação (potencial que se eleva acima de 0 mV quando começa às -65 mV ou abaixo). Não confunda o artefato de estimulação com um potencial de ação. Nota: Potenciais são significativamente mais longos em duração (~ 5 ms) do que artefatos de estimulação.</li>
</ol>3. imagem latente da fluorescência da amostra
<ol><li>Ampliação de 20 X, localize a banda placa terminal no centro do músculo por procurando NMJs 594-αBTX – rotulado sob excitação luz verde/amarelo (550 nm). Alterne para a excitação de luz azul (470 nm) a imagem Ca2 + respostas no músculo, neurônio motor ou células de Schwann.</li>
	<li>Se desejar, configure o divisor de imagem com filtros bandpass e um filtro de borda única dicroicos para a imagem de dual-comprimento de onda.</li>
	<li>Para calcular a fluorescência máxima (Fmax) exibida por tecido GCaMP3/6-expressando, adicione 12 µ l de 3 M de cloreto de potássio (KCl) para as preparações de diafragma6.<ol>
<li>Realizar experiências com a barra de brilho na barra de tabela de pesquisa definida a 110% do nível no qual o tecido GCaMP3/6-expressando exibe saturação na ampliação de X 20, sem binning em resposta ao KCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Grave a 20 frames por segundo para não perder quaisquer eventos rápidos.</li>
	<li>Estimular com 1-45 s de 20-40 Hz de estimulação do nervo, entregando um trem de impulsos usando o eletrodo de sucção ou adicionar agonistas farmacológicas, aplicação de banho ou por perfusão e coletar dinâmico fluorescente Ca2 + respostas no subtipo de uma célula juntamente com o sinal de JNM estático 594-αBTX. Nota: Se o tecido-específica vermelhos ou far-red Lino ou GEVI ratos se tornam disponíveis para uso com o MNJ, pode ser usados para coletar dois sinais dinâmicos, refletindo dois elementos celulares distintos no MNJ.</li>
	<li>Quando terminaram os experimentos de imagem ou eletrofisiológicos porque os resultados desejados foram alcançados, perfundir água através das linhas de perfusão e sugar a água 2 x - 3 x através do eletrodo sucção para garantir que sais não acumular.</li>
</ol>4. exportação e análise dos dados por um desvio padrão mapa de intensidade de fluorescência (SDiu16)
<ol><li>Gravar sequências de imagem gravadas como pilhas TIFF de 16 bits e carregá-los para o sistema de análise de dados de imagem desejado para análise.</li>
	<li>No menu de arquivo do software 8D, selecione a pilha de imagem de interesse e clique para carregar.<ol>
<li>Uma vez que o vídeo carrega, digitalizar através do tempo para identificar uma seção que não tem celular fluorescente atividade. Nota: Esta região será usada para criar uma amostra de plano de fundo.</li>
		<li>Segure a tecla Shift e clique para desenhar uma caixa de interesse (ROI) da região na área identificada como a área de amostra de plano de fundo.</li>
		<li>Depois de criar a caixa, pressione a barra de espaço para gerar uma trama de mudança de atividade do plano de fundo.</li>
		<li>O rastreamento com o botão direito e selecione a opção sortidas para apresentar a opção de Despejo ROI como texto para fazer o rastreamento como um arquivo de texto de coordenadas xy.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voltando para o vídeo de interesse, digitalizar novamente para identificar a região de tempo onde a atividade de interesse está ocorrendo.<ol>
<li>Usando o botão do meio do mouse, selecione nesta região de tempo na caixa tempo de amarelo.</li>
		<li>Botão direito do mouse sobre o vídeo e selecione OPS de pilha e, em seguida, mapear Stat opção 5. Nota: Isto irá gerar um mapa de desvio padrão (SD mapa) na janela da esquerda.</li>
		<li>Clique no mapa SD e em seguida pressione o ] chave 19 x para aplicar o mapa de calor de cor apropriada.</li>
		<li>O mapa de SD com o botão direito e selecione salvar e carregar de STM, que apresentará a opção salvar stm como tiff para salvar o mapa SD.</li>
		<li>Então, pressione o [ chave 19 x para retornar a um mapa de cores em tons de cinza.</li>
		<li>Pressione C e D para trazer as ferramentas de mapeamento de densidade. Usando o botão esquerdo do mouse e o botão do mouse do centro, ajuste o limite para incluir todas as atividades fluorescente mostrada no mapa de SD.</li>
		<li>Pressione C para fechar as ferramentas de densidade, mantendo as configurações de limite.</li>
		<li>O mapa de SD com o botão direito e selecione partículas STM e, em seguida, PTCLS de encontrar. Nota: Isto irá identificar células individuais, expressando a atividade fluorescente.</li>
		<li>Botão direito do mouse o mapa SD mais uma vez e selecione Criar partículas ROIs. Nota: Isto irá sobrepor as células selecionadas no vídeo original do interesse.</li>
		<li>Segurando Shift, clique com botão direito em qualquer uma da partícula ROIs agora identificada no vídeo original.</li>
		<li>Selecione o marcador ROI e medida Int no ROI. Nota: Isto irá gerar parcelas de atividade fluorescente individuais para cada ROI identificado no vídeo de interesse. Estes podem ser salvos clicando em qualquer uma dessas e selecionando Assorted, seguidos por Despejar ROI como texto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para detalhadas lógica subjacente a essas operações, por favor consulte o código de fonte arquivo9.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li>
<li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+%28GECIs%29+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).</li>
<li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).</li>
<li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li>
<li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+geographutoxin+II+%28mu-conotoxin%29+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li>
<li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Ca2%2B+signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839(2018).</li>
<li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui nós fornecemos alguns exemplos de Ca2 + respostas em células específicas no tecido neuromuscular intacto, usando ratos Lino-expressando de medição. Para executar com êxito estes experimentos, é imperativo para não machucar o nervo frênico durante a dissecção. ParaCa 2 + respostas nas células de Schwann em baixa ou alta potência (ou seja, 20 X ou 60 X) de imagem, é necessário usar BHC ou µ-conotoxina ao movimento do bloco. Para imagens de baixo consumo de energia de Ca2 + res...

O MNJ, como todas as sinapses, é composto por três elementos: um terminal pré-sináptica derivado de um neurônio, uma célula neurônio pós-sináptico/efetoras, e um perisynaptic glia celular1,2. Enquanto os aspectos básicos de transmissão sináptica primeiro foram demonstrados neste de sinapse3, muitos aspectos deste processo permanecem desconhecidos, em parte devido a expressão das mesmas moléculas por elementos celulares distintas desta sinapse. Por exemplo, os receptores de ambos os nucleotídeos de adenina Purina ATP e acetilcolina (ACh), que são co liberados por neurônios motores no MNJ vertebrado, são expressos por músculo, células de Schwann e neurônios motores, complicando, assim, a interpretação de qualquer efeito funcional exercido por estas substâncias (por exemplo, liberação de transmissor ou resposta, geração de força muscular)4. Além disso, embora os componentes tripartites o MNJ são simples em comparação com, por exemplo, os neurônios no sistema nervoso central que muitas vezes apresentam múltiplas entradas sinápticas, se os neurônios motores, células musculares ou células de Schwann variam em resposta a estímulos com base na sua intrínseca heterogeneidade (por exemplo, derivação embrionária, subtipo de fibra, morfologia) não é clara. A fim de abordar cada uma destas questões, seria vantajoso para controlar simultaneamente a resposta de muitas células dentro de um elemento sináptico, bem como faixa, ao mesmo tempo, essa resposta em qualquer um dos outros elementos separados. Estratégias convencionais usando corantes químicos para medir a sinalização de cálcio não podem atingir esses dois objetivos, porque banho-aplicado tintura é retomada por vários tipos de células após a aplicação de tecido e intracelular carregado da tintura só pode ser usada para Visualizar individuais ou pequenas divisões de células. Aqui, utilizar ratos transgênicos expressando GECIs projetado para medir a célula específica cálcio sinalização, juntamente com imagens específicas e ferramentas de software5, demonstramos o primeiro destes dois objectivos globais e discutir como a adição de novos ferramentas de transgénicas ajudaria a alcançar o segundo. Esta técnica será útil para qualquer pessoa interessada em acompanhar a dinâmica de cálcio ou outro celular sinalização observáveis de eventos através de sensores ópticos gene codificado em várias populações de células ao mesmo tempo.

<table><tbody><tr><td>Camundongos Myf5-Cre</td><td>Jax</td><td>#007893</td><td>Impulsiona a expressão das células musculares já em E136</td></tr><tr><td>Wnt1-Cre camundongos</td><td>Jax</td><td>#003829</td><td>Impulsiona a expressão em todos&nbsp; Células de Schwann em E13, mas não P209</td></tr><tr><td>Sox10-Cre camundongos</td><td>Jax</td><td>#025807</td><td>Impulsiona a expressão de células de Schwann em idades mais avançadas</td></tr><tr><td>Camundongos GCaMP3 condicionais</td><td>Jax</td><td>#029043</td><td>Expressa GCaMP3 de maneira específica da célula</td></tr><tr><td>Camundongos GCaMP6f condicionais</td><td>Jax</td><td>#024105</td><td>Expressa GCaMP6f de maneira</td></tr> <tr><td>específica da célulaBHC (3-(N-butiletanimidoil)-4-hidroxi-2H-cromena-2-ona)</td><td>Hit2Lead</td><td>#5102862</td><td>Bloqueia a miosina do músculo esquelético, mas não a neurotransmissão6</td></tr><tr><td>CF594-&alpha;-BTX</td><td>Biotium</td><td>#00007</td><td>Rotula aglomerados de receptores de acetilcolina em NMJ</td></tr><tr><td>&micro;-conotoxina GIIIb</td><td>Peptídeos Int'l</td><td>#CONO20-01000</td><td>Bloqueia o canal de sódio dependente de voltagem Nav1.48</td></tr><tr><td>Gel Dielétrico de Silicone; também conhecido como Adesivos Sylgard</td><td>Ellswoth</td><td># Gel Sil Dielec .9KG&nbsp;</td><td>Permite a imobilização do diafragma por pinos minuciens</td></tr><tr><td>Pinos minutien (diâmetro de 0,1mm)</td> <td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>26002-10</td><td>Imobiliza diafragma em gel dielétrico de silicone</td></tr><tr><td>Microscópio vertical Eclipse FN1</td><td>Nikon</td><td>MBA74100</td><td>Permite a preparação e observação de espécimes</td></tr><tr><td>Plataforma de Microscópio Fixo Básico com Tradutor de Microscópio Manual XY&nbsp;</td><td>Autom8</td><td>MXMScr</td><td>Permite o movimento da amostra</td></tr><tr><td>Micromanipulador manual&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>Segura eletrodos de gravação e estimulação&nbsp;</td></tr><tr><td>Amplificador de microeletrodo&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A</td><td>Permite gravação eletrofisiológica intracelular de eletrodo afiado</td></tr><tr><td>Sistema de aquisição de dados de baixo ruído Microeletrodo</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1550&nbsp;</td><td>Permite a aquisição de dados eletrofisiológicos</td></tr><tr><td>Sistema de análise de dados de microeletrodos</td><td>Molecular Devices</td><td>PCLAMP 10 Standard</td><td>Realiza análise de dados eletrofisiológicos</td></tr><tr><td>Estimulador de onda quadrada</td><td>Grass</td><td>S48</td><td>Estimula o nervo para excitar o músculo</td></tr><tr><td>Unidade de Isolamento de Estímulo</td><td>Grass</td><td>PSIU6</td><td>Reduz&nbsp; artefatos de estimulação Filamentos</td></tr><tr><td>de borosilicato, diâmetro externo de 1,0 mm, diâmetro interno de 0,5 mm&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>FG-GBF100-50-15</td><td>Empala e registra potenciais musculares evocados por nervos Filamentos</td></tr><tr><td>de borosilicato, diâmetro externo de 1,5 mm, diâmetro interno de 1,17 mm.</td><td>Sutter</td><td>BF150-117-15</td><td>Alongado e usado para eletrodo de sucção</td></tr><tr><td>Extrator de Micropipeta</td><td></td><td>Sutter P-97&nbsp;</td><td>Puxa e prepara eletrodos de gravação</td></tr><tr><td>Câmera cMOS retroiluminada de 1200x1200 pixels&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95b</td><td>Câmera sensível que permite imagens de alta resolução e alta velocidade</td></tr><tr><td>Fonte de luz</td><td>Lumencor</td><td>Spectra X</td><td>Fornece iluminação de LEDs para observação de fluorescência</td></tr><tr><td>&nbsp; Objetivas de imersão em água fluorescente corrigidas para o infinito, W.D. 2mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>CFI60</td><td>Fornece longas distâncias de trabalho para visualização de espécimes</td></tr><tr><td>Iluminador de Fibra Óptica com lâmpada Halógena</td><td>Sumita</td><td>LS-DWL-N</td><td>Fornece iluminação para observação de campo claro</td></tr><tr><td>W-View Gemini Image Splitter&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Projetos 1 par de imagens de comprimento de onda duplo separadas por uma câmera dicróica para uma única câmera</td></tr><tr><td>Filtros de Banda Única&nbsp; (512/25-25 e 630/92-25)&nbsp;</td><td>SemRock</td><td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td><td>Permite imagens de banda dupla</td></tr><tr><td>560 nm Dicroic Beamsplitter de borda única</td><td>Sem Rock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Espelho dicróico que separa feixes de luz para permitir imagens de comprimento de onda duplo</td></tr><tr><td>Sistema de aquisição de dados de imagem</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements - MQS31000</td><td>Permite a aquisição de dados de imagem</td></tr><tr><td>Módulo de controle de comprimento de onda</td><td>Nikon</td><td>MQS41220</td><td>Módulo para dados de imagem aquisição</td></tr><tr><td>Módulo de hardware divisor de emissões&nbsp;</td><td>Módulo</td><td>Nikon MQS41410</td><td>para aquisição de dados de imagem</td></tr><tr><td>Sistema de análise de dados de imagem</td><td>NA</td><td>Volumetry 8D5, Fiji</td><td>Permite a análise da intensidade de fluorescência e outros dados de imagem</td></tr></tbody></table>

ex vivo imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

A atividade elétrica das células em tecidos pode ser monitorizada por técnicas eletrofisiológicas, mas estas geralmente limitam-se a análise de células individuais. Desde que um aumento de cálcio intracelular (Ca2 +) no citosol ocorre muitas vezes devido à atividade elétrica, ou em resposta a uma miríade de outros estímulos, esse processo pode ser monitorado pela imagem de células carregado com sensíveis ao cálcio fluorescente corantes.  No entanto, é difícil esta resposta em um tipo de célula individual dentro de todo tecido da imagem porque estas tinturas são aceites por todos os tipos de células dentro do tecido. Em contraste, os indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIs) podem ser expressa por um tipo de célula individual e fluorescem em resposta a um aumento de intracelular Ca2 +, permitindo assim a imagem de Ca2 + sinalização em populações inteiras de tipos de células individuais. Aqui, nós aplicamos o uso do GECIs GCaMP3/6 até a junção neuromuscular do mouse, uma sinapse tripartida entre os neurônios motores, músculo esquelético e terminal/perisynaptic células de Schwann. Vamos demonstrar a utilidade desta técnica em preparações do tecido clássico ex vivo . Usando um divisor ótico, realizamos imagem dual-comprimento de onda de Ca2 + sinais dinâmicos e um rótulo estático da junção neuromuscular (JNM) em uma abordagem que poderia ser facilmente adaptada para monitorar duas células específicas Lino ou tensão geneticamente codificado indicadores (GEVI) simultaneamente. Finalmente, discutimos as rotinas usadas para capturar espacial de mapas de intensidade de fluorescência. Juntas, estas técnicas ópticas, transgênicas e analíticas podem ser empregadas para estudar a atividade biológica das subpopulações de células distintas para o MNJ em uma ampla variedade de contextos.

Vários exemplos de mudanças de intensidade de fluorescência, mediadas por aumentos de intracelular Ca2 + dentro de tipos de células definidas do MNJ, mostram a utilidade desta abordagem. Estes resultados são apresentados como mapas de intensidade de fluorescência espacial, que fornecem a localização das células de resposta, bem como a intensidade de suas respostas, permitindo, assim, para a avaliação de quantas células respondem e quanto cada célula responde a uma determinada e...

Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo neuromuscular, como o papel da sinalização de cálcio em células musculares ou schwann em resposta à estimulação nervosa. A principal vantagem dessa técnica é que se pode imaginar a ativação de tipos celulares específicos em resposta à estimulação nervosa. Para começar, obtenha camundongos transgênicos e genótipo-los conforme detalhado no protocolo de texto.Seguindo a eutanásia, seção transversal em todo o animal logo abaixo do fígado e logo acima do coração e pulmões com tesoura de iridectomia. Dissecar o fígado, o coração e os pulmões. Ter cuidado para manter um comprimento do nervo frênico que é suficientemente longo o suficiente para ser arrastado para um eletrodo de sucção.Remova ainda mais a caixa torácica e a coluna vertebral, exceto pelo cume fino ao redor do diafragma. Coloque o diafragma e a amostra do nervo frênico em um tubo de microfuge com solução Krebs-Ringer contendo um micrograma por mililitro de bungarotoxina alfa fluorescentemente rotulada. Deixe o espécime incubar na solução por 10 minutos no escuro.O uso de pinos minutien imobiliza o diafragma prendendo-o em um prato de seis centímetros revestido com gel dielétrico de silicone e preenchido com aproximadamente oito mililitros de solução Krebs-Ringer oxigenada. Coloque o prato no palco do microscópio. Em seguida, perfuça o diafragma com mais solução Krebs-Ringer a oito mililitros por minuto durante 30 minutos.Quatro vezes a ampliação, usando um micromanipulador, mova o eletrodo de sucção sobre o nervo frênico esquerdo. Aplique a sucção puxando o barril de uma seringa de cinco mililitros conectada ao tubo que está preso ao eletrodo de sucção. Certifique-se de que o diafragma contrai em resposta à estimulação hertz examinando-a visualmente com iluminação Brightfield.Caso não, ajuste a tensão girando o botão de tensão incrementalmente para alcançar um pulso supramaximal que pode ser verificado por exame visual da contração muscular. Se ainda não estiver visível, exploda o nervo com a seringa e tente atraí-la novamente aplicando sucção. Agora, desligue a perfusão para adicionar o inibidor de minosina específica do músculo BHC ou o antagonista do canal de sódio de tensão, mu-conotoxina.Prepare a pré-diluição bhc, pipetando quatro microlitadores de 200 mililitros de estoque BHC em DMSO em um mililitro de solução Krebs-Ringer. Remova um mililitro da solução Krebs-Ringer do prato. Em seguida, adicione o BHC pré-diluído ao prato.Após 30 minutos, ligue a perfusão da solução Krebs-Ringer fresca por mais 20 a 30 minutos. Usando luvas, prepare o eletrodo de gravação colocando um vidro filamentado borossilicato com um diâmetro externo de um milímetro e um diâmetro interno de 0,4 milímetros em um puxador de micropipette. Aperte os mostradores para fixá-lo na posição e feche a porta do puxador.Em seguida, programe o puxador como descrito no protocolo de texto. Para diafragmas embrionários, meça a resistência usando controles de software do amplificador. Certifique-se de que a resistência está perto de 60 megaohms e para diafragmas mais antigos, de 10 a 20 megaohms.Agora, carregue o eletrodo de gravação com três cloreto de potássio molar. Em 10 vezes a ampliação, abaixe o eletrodo em músculo usando um segundo micromanipulador no lado oposto do palco como um eletrodo estimulante. O uso do software de aquisição de dados eletrofisiológicos espera até que o potencial de membrana de repouso mude de zero para menos 65 milvolts ou abaixo.Estimule em um hertz e verifique a presença de um potencial de ação muscular verificando um grande potencial que exibe uma superação modesta. Não confunda artefato de estimulação com potencial de ação. Em 20 vezes a ampliação localize a faixa da placa final no centro do músculo procurando por junções neuromusculares alfa fluorescentemente rotuladas sob excitação de luz amarela verde.Mude para excitação de luz azul para respostas de cálcio de imagem em células musculares, neurônios motores ou schwann. Neste exemplo, gCaMP três é expresso em células musculares. Se desejar, configure o divisor de imagens com filtros de passe de banda e um filtro de borda únicadicróica para a imagem de comprimento de onda dupla.Realize experimentos com a barra de brilho na barra de mesa de pesquisa definida para 110% do nível em que o indicador de cálcio geneticamente codificado expressando tecido exibe saturação em 20 vezes a ampliação sem binning em resposta ao cloreto de potássio. Grave a 20 quadros por segundo para não perder nenhum evento rápido. Estimule com um a 45 segundos de 20 a 40 hertz de estimulação nervosa, fornecendo um trem de impulsos usando um eletrodo de sucção e colete respostas dinâmicas de cálcio fluorescente em um subtipo de célula, juntamente com o sinal de junção neuromuscular alfa fluorescentemente rotulado estático.Agonistas farmacológicos também podem ser adicionados por aplicação de banho ou por perfusão e as respostas dinâmicas de cálcio fluorescente podem ser coletadas da mesma forma. Quando os experimentos de imagem ou eletrofisiológico são concluídos porque os resultados desejados foram alcançados, perfuuse a água através das linhas de perfusão e suge água duas a três vezes através do eletrodo de sucção para garantir que os sais não se acumulem. Um mapa espacial das respostas de cálcio celular schwann à estimulação do nervo frênico de um Wnt one GCaMP três diafragma de rato no sétimo dia de natal mostram uma restrição às células schwann parassintálicas terminais na junção neuromuscular.O mesmo diafragma foi imageado após rotulagem com bungarotoxina alfa fluorescentemente rotulada, que se liga para permitir receptores de acetilcolina da junção neuromuscular. O mesmo diafragma também foi imageado sob a iluminação brightfield para guiar um eletrodo de gravação para a região pós-sináptica do músculo pela junção neuromuscular. Aqui mostrada é a demarcação espacial de células codificadas por cores ou regiões de interesse tomadas para análise de transitórios individuais de cálcio.O mapa espacial das respostas de cálcio celular muscular de um mth 5 GCaMP três diafragma de camundongos em P quatro a estimulação nervosa frênica na presença do inibidor de miosina BHC mostra uma resposta em toda a região de todas as células musculares diafragma. Em contraste, a estimulação do mesmo diafragma na presença de mu-conotoxina causa uma resposta espacialmente restrita de cálcio na região medial de todas as células musculares diafragma que corresponde ao aglomerado receptor de acetilcolina enriquecido banda de placa final. Seguindo este procedimento outros métodos como imuno-histoquímica ou imunoblotting podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como, qual é o perfil molecular das células identificadas por eletrofisiologia ou imagem de cálcio?Este método pode fornecer uma visão das respostas populacionais das células schwann e células musculares à estimulação nervosa em camundongos neonatais normais. Também pode ser aplicado ao estudo de camundongos mais velhos ou ao estudo de camundongos que expressam proteínas associadas à doença neuromuscular.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Heredia, D. J., et. al. Imagem ex vivo da sinalização de cálcio específica da célula na sinapse tripartida do diafragma do camundongo. J. Vis. exp.}} (2018) Este vídeo demonstra imagens de fluorescência Caracterização da dinâmica do cálcio nas junções neuromusculares (NMJs) em um camundongo transgênico que expressa indicadores de cálcio geneticamente codificados. Um NJM é identificado por receptores de acetilcolina marcados com fluorescência no diafragma com o nervo frênico. Um divisor...

Imagem de fluorescência da dinâmica do cálcio nas junções neuromusculares no diafragma de um camundongo transgênico

Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios da raiz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). O vídeo demonstra uma técnica de imagem de cálcio in vivo para monitorar a atividade neuronal nos gânglios da raiz dorsal (DRG) de um camundongo transgênico. Os neurônios DRG expressam um indicador de cálcio que aumenta a intensidade da fluorescência ao se ligar ao cálcio. Estímulos mecânicos ou térmicos aplicados a...

Imagem de cálcio in vivo de conjuntos neuronais nos gânglios intactos da raiz dorsal de um camundongo

Fonte: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Imagem do sistema nervoso entérico. J. Vis. Exp..  (2015)Este vídeo demonstra cálcio imagens para visualizar e analisar a atividade de neurônios entéricos e glia em preparações do plexo mioentérico do cólon de camundongos.

Imagem de cálcio das atividades do neurônio entérico e da glia em um plexo mioentérico colônico de camundongo

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Este vídeo demonstra imagens de cálcio para estudo Drosophila respostas cerebrais a neuropeptídeos. Os neurônios que expressam um indicador fluorescente de cálcio revelam a dinâmica do cálcio intracelular e as respostas funcionais às moléculas de sinalização.

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