Name: Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a realizar imagem intravital de dois fótons na mucosa traqueal de camundongos CD11c-YFP durante infecção por influenza. Este protocolo permite visualizar interações entre neutrófilos e células dendríticas em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado pelos subsídios da Fundação Nacional Suíço (SNF) (176124, 145038 e 148183), o Europeu Comissão Marie Curie reintegração Grant (612742) e o SystemsX.ch de uma subvenção para D.U.P (2013/124).

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Os autores não têm nada para divulgar.

Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para a geração de imagens de 4D, mostrando a migração de neutrófilos enviaram transferidos e suas interações com DC durante uma infecção de gripe na traqueia do mouse. O modelo descrito 2P-IVM será relevante para estudar a dinâmica de células imunes durante uma infecção nas vias aéreas.
Recentemente, vários modelos com base na visualização da dinâmica celular das vias aéreas têm sido desenvolvidos9,<sup class="xr...

Dois fotões microscopia intravital (2P-IVM) é uma técnica eficiente para tempo real de imagens de célula para célula interações que ocorrem em seu ambiente natural1. Uma das principais vantagens deste método é que permite o estudo de processos celulares em uma maior profundidade de amostra (500 µm a 1 mm) comparado com outros tradicionais de técnicas de imagem2. Ao mesmo tempo, o uso de dois fótons de baixa energia gerada pelo laser dois fotões minimiza o foto-dano no tecido normalmente associado com o processo de aquisição de imagem2. Durante a última década, 2P-IVM foi aplicada para estudar diferentes tipos de interações célula-célula em várias disciplinas,3,4,5. Estes estudos foram especialmente relevantes para investigar as células imunes, que caracterizam-se pelo seu elevado dinamismo e a formação de contatos proeminentes seguindo os sinais gerados por outras células e o meio ambiente. 2P-IVM foi também aplicada para estudar as interações entre patógeno e hospedeiro6. Com efeito, anteriormente mostrou que alguns patógenos podem alterar o tipo e a duração dos contatos entre células do sistema imunológico, dificultando, assim, a resposta imune7.
A mucosa das vias aéreas é o primeiro site no qual a resposta imune contra patógenos no ar é gerado por8. Portanto, na vivo análise das interações patógeno-hospedeiro, este tecido é fundamental entender a iniciação dos mecanismos de defesa do hospedeiro durante a infecção. No entanto, 2P-IVM das vias aéreas é um desafio, principalmente devido os artefatos produzidos pelo ciclo de respiração do animal, que compromete o processo de aquisição de imagem. Recentemente, diferentes modelos cirúrgicos foram descritos para imagiologia murino traqueia9,10,11,12 e pulmões13,14,15, 16. 2P-IVM traqueal modelos representam um excelente set-up para visualizar a fase inicial da reação imune nas vias aéreas superiores, enquanto os alvéolos pulmonares 2P-IVM modelos são mais adequados para estudar a fase final das infecções. Os modelos de pulmão desenvolvidos apresentam uma limitação associada à presença de alvéolos cheios de ar, que restringir a penetração ótica do laser e fazer com que a camada da mucosa das vias aéreas intrapulmonares inacessíveis na vivo de imagem17 . Por outro lado, a estrutura da traqueia, formada por um epitélio contínuo, facilita a aquisição de imagens.
Aqui, apresentamos um protocolo que inclui uma descrição detalhada das etapas necessárias para realizar a infecção da gripe, preparação cirúrgica dos animais e 2P-IVM da traqueia. Além disso, descrevemos uma montagem experimental específica para a visualização de neutrófilos e células dendríticas (DC), dois tipos de células imunes que desempenham um papel importante como mediadores do mecanismo de defesa contra vírus de gripe18,19 . Finalmente, descrevemos um procedimento para analisar interações de neutrófilos-DC. Estes contactos foram mostrados para modular a ativação DC e, posteriormente, para afetar as respostas imunológicas contra patógenos20.

<table><tbody><tr><td>Gigasept instru AF</td><td>Sch&uuml; lke & Camundongos Mayr GmbH</td><td></td><td>solução a 4%</td></tr><tr><td>CD11c-YFP</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008829</td><td>camundongos foram criados internamente</td></tr><tr><td>camundongos CK6-ECFP</td> Jackson <td>Laboratories</td><td>camundongos 004218</td><td>foram criados internamente</td></tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco modificada sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modificado sem Cloreto de Cálcio e Cloreto de Magnésio</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>E0414-1L</td><td>Armazene em 4&deg; C</td></tr><tr><td>Ketamin Labatec</td><td>Labatec Pharma</td><td>7680632310024</td><td>Loja na RT, loja em 4 & C quando em solução de mistura ket/xila</td></tr><tr><td>Rompun 2% (Xilazin)</td><td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td><td>Armazenar em RT, armazenar em 4 &graus; C quando em solução de mistura ket/xyl</td></tr><tr><td>26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak</td><td>BD Plastipak</td><td>305501</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 0,3 mL BD Seringas de Insulina Micro-Fina</td><td>BD 324826</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 2 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 3x agulhas de 18 G</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety 20 G (cateter)</td><td>Braun</td><td>4251652.01</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Cultura de Células de 6 Poços</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 + HEPES (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>42401-018</td><td>Loja em 4&deg; C</td></tr><tr><td>Liberase TL Grau de Pesquisa</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>Store a -20 &deg; Mistura de C / colagenase (I e II)</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0649-50KU</td><td>Armazenar a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>CellTrace Mancha violeta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34557</td><td>Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Armazene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>PE-10 Micro Tubo Médico</td><td>2Biological Instruments SNC</td><td>#BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>Fita Plástica Cirúrgica</td><td>M Plast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Bausch & Loja Lomb</td><td></td><td>na RT</td></tr><tr><td>Plasticina</td><td>Ohropax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Cobertura de Vidro de Alta Tolerância 15 mm Redonda</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0733</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Anestesia Animal Portátil SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuvo Lite mark 5</td><td>GCE medline</td><td>14111211</td><td></td></tr><tr><td>MiniTag (bancada de anestesia gasosa e aquecimento)</td> <td>Tem Sega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SURGICAL BOARD</td><td>Universidade de Berna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrimScope II Microscópio de dois fótons</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision Ti:Sa lasers</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25X NA 1.05 objetiva de imersão em água</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>The Cube& A câmara de incubação e o controlador de temperatura da</td><td>caixa Serviços</td><td></td><td></td>de imagem de vida</tr><tr><td>Imaris 9.1.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Software de imagem</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Software estatístico</td></tr></tbody></table>

interação de célula de imagem latente na mucosa traqueal durante a infecção de vírus de influenza usando microscopia intravital dois fotões

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

A análise da célula-célula ou célula-patógeno interação na vivo é uma ferramenta importante para compreender a dinâmica da resposta imune à infecção. Dois fotões microscopia intravital (2P-IVM) permite a observação das interações célula no tecido profundo em animais vivos, minimizando o fotobranqueamento gerado durante a aquisição de imagens. Até à data, têm sido descritos diferentes modelos para 2P-IVM dos órgãos linfoides e não linfoides. No entanto, a imagem de órgãos respiratórios permanece um desafio devido ao movimento associado com o ciclo de respiração do animal.
Aqui, descrevemos um protocolo para visualizar na vivo celular imune interações na traqueia de camundongos infectados com o vírus da gripe usando 2P-IVM. Para este fim, nós desenvolvemos uma plataforma de imagem personalizada, que incluía a exposição cirúrgica e intubação da traqueia, seguida pela aquisição de imagens dinâmicas de neutrófilos e células dendríticas (DC) no epitélio da mucosa. Além disso, nós detalhados os passos necessários para realizar a gripe intranasal infecção e fluxo cytometric análise de células do sistema imunológico na traqueia. Finalmente, analisamos neutrófilos e motilidade DC, bem como suas interações no decurso de um filme. Este protocolo permite a geração de imagens de 4D estável e brilhante necessário para a avaliação de interações célula-célula na traqueia.

Neste trabalho, descrevemos um protocolo detalhado para estudar na vivo a motilidade e as interações entre os neutrófilos e DC durante a infecção da gripe na traqueia murino (Figura 3A). Para esta finalidade, isolamos neutrófilos PCP+ (92% de pureza; Figura 3B) de CK6-ECFP ratos e nos enviaram transferindo-os para um rato de CD11c-YFP infectado com gripe. Depois disso, foram realizadas 2P-IVM da traqueia no di...

Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo das respostas imunes a patógenos transportados pelo ar sobre a dinâmica das interações das células imunes durante infecções respiratórias. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de obter imagens 4D brilhantes e estáveis do epitélio traqueal durante a cirurgia simples. Embora esse método possa fornecer informações sobre as interações entre neutrófilos e células líticas durante a infecção por influenza, ele também pode ser aplicado ao estudo de diferentes células imunes ou patógenos transportados pelo ar.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em manter uma cirurgia inflamada estável e mínima. Além disso, a análise de imagens pode ser complicada devido à presença de defeitos cardíacos. Para infecção intranasal por influenza, coloque um camundongo CD11c-YFP anestesiado de seis a oito semanas de idade na posição supina e confirme a sedação profunda por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.Colocando a pipeta perto da narina esquerda, dispense pequenas gotículas na cavidade nasal com aproximadamente 20 segundos de intervalo, até que o camundongo tenha inalado todo o volume de 15 microlitros de inoculante PR8. Após dois a cinco minutos, entregue 15 microlitros de vírus na narina direita da mesma maneira. Quando todo o inóculo tiver sido entregue, confirme se o camundongo está respirando normalmente e coloque o animal em sua gaiola em decúbito lateral com monitoramento até a recuperação total.Três dias após a infecção, remova os fêmures e as tíbias de um camundongo transgênico que expressa CFP e limpe suavemente os ossos com uma pinça. Corte a epífise óssea e use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26 para lavar a medula óssea de cada osso com PBS frio estéril em um tubo de 50 mililitros no gelo. Quando toda a medula óssea tiver sido colhida, aspire a medula através da ponta da agulha várias vezes e filtre a suspensão celular dissociada através de um filtro de 40 micrômetros.Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em dois mililitros de PBS frio. Em seguida, coloque cuidadosamente dois mililitros de cada um dos três gradientes de Percoll em um tubo de 15 mililitros, do mais para o menos concentrado. Em seguida, adicione cuidadosamente dois mililitros de suspensão de células da medula óssea na camada superior do gradiente para separação centrífuga do gradiente de densidade.No final da centrifugação, remova cuidadosamente a banda da interface de gradiente de 64 e 72% e lave os neutrófilos em PBS frio. Em seguida, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de PBS fresco no gelo para contagem e ressuspenda as células em cinco vezes 10 elevado à sexta células por 100 microlitros de concentração de PBS para injeção intravenosa nos animais receptores de CD11c-YFP inoculados. 12 horas após a transferência adotiva, coloque o animal receptor anestesiado em uma prancha cirúrgica personalizada sobre uma superfície aquecida a 37 graus Celsius e remova os pelos do pescoço do camundongo raspando e tomando um creme depilatório.Coloque o mouse acima do posicional do mouse de plástico com a cabeça fora do posicional em um ângulo que facilite a intubação da traqueia e prenda os membros anteriores, as patas e a cauda com fita cirúrgica. Aplique pomada nos olhos e desinfete a pele exposta. Em seguida, faça uma incisão de um centímetro ao longo do eixo medial do pescoço entre a parte superior do tórax e a linha que passa pelo ponto inferior da mandíbula e mova lateralmente as manchas de pele e as glândulas salivares para visualizar a traqueia.Use uma pinça para dissecar cuidadosamente a traqueia, intubar o camundongo com um cateter e iniciar imediatamente a ventilação artificial. Use um gancho cirúrgico conectado a uma haste na placa cirúrgica para fixar a altura e a orientação do cateter e exponha a traqueia até o queixo. Circunde a traqueia com vaselina e hidrate a traqueia com algumas gotas de PBS quente.Em seguida, cole uma lamínula em um suporte de metal e aparafuse o suporte ao tradutor XYZ para permitir que a lamínula seja colocada em cima da preparação cirúrgica. É muito importante expor e estender adequadamente a traqueia e pressioná-la levemente com a lamínula, para manter o tecido estável por tempo suficiente para a imagem. Para imagens de lapso de tempo in vivo, coloque a placa cirúrgica dentro da câmara de incubação de 37 graus Celsius do microscópio de dois fótons e adicione uma gota de água à lamínula.Depois de centralizar a configuração e focar no tecido traqueal, defina a frequência de varredura para 800 hertz com 520 por 520 pixels, um campo de visão de 440 por 440 micrômetros e uma média de linha de um. Defina os lasers de safira de titânio para o comprimento de onda apropriado e porcentagem de potência de acordo com os fluoróforos de excitação e configure o modo de aquisição 3D e de lapso de tempo com excitação simultânea. Em seguida, defina um intervalo de 50 micrômetros ao longo do eixo z com um tamanho de passo de três micrômetros e grave as imagens a cada 30 segundos por 30 minutos.Seguindo essa configuração experimental, imagens 4D estáveis podem ser capturadas in situ dentro da traqueia infectada durante um período de rastreamento de 30 minutos. A análise das imagens 4D revela diferenças significativas entre o movimento das células dendríticas e dos neutrófilos recrutados, com uma velocidade significativamente mais rápida demonstrada por este último. A morfologia complexa das células dendríticas causa erros frequentes no rastreamento celular, o que, por sua vez, produz rastros com duração diminuída e variação aumentada no comportamento direcional medido.Portanto, uma métrica robusta foi criada para medir a direcionalidade considerando a duração do trajeto, revelando uma diferença significativa na direcionalidade dos neutrófilos em comparação com as células dendríticas. Além disso, o cálculo da distância entre os neutrófilos e as células dendríticas permite a detecção e análise de seus contatos ao longo do tempo, com alguns neutrófilos neste experimento representativo formando múltiplos contatos breves com células dendríticas e alguns não formando nenhum contato com células dendríticas durante o período de imagem. Além disso, o estudo da tendência média da distância entre neutrófilos e células dendríticas ao longo do tempo facilita o estudo do posicionamento global das células, enquanto a investigação da tendência em células específicas permite a caracterização do comportamento de cada célula individual.Conhecendo este procedimento, outros métodos como a citometria de fluxo da traqueia podem ser realizados para avaliar a quantificação e caracterização de diferentes recrutamentos de células imunes na traqueia infectada. Não se esqueça de que trabalhar com qualquer cepa do vírus influenza, mesmo que adaptada ao camundongo, pode ser perigoso e que, portanto, todos os procedimentos devem ser realizados sob condições de nível dois de biossegurança.

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