Name: Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a analisar a invasão de células de câncer usando a matriz de hidrogel Microcâmara para triagem de drogas antimetastáticas. Este método permite monitorar continuamente esferoides tumorais em 3D com alta resolução.

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Este trabalho é apoiado pelo legado de Moshe Shimon e Judith Weisbrodt.

1. HMCA placa de gravação
Nota: O processo completo para a concepção e fabricação de polidimetilsiloxano (PDMS) carimbo e placa de imagem HMCA, utilizados neste protocolo é descrito em detalhes em nossos artigos anteriores de15,16. O carimbo PDMS (forma negativa) é usado para imprimir o HMCA (forma positiva), que consiste de cerca de 450 MCs por alvéolo (figura 1A). Conforme demonstrado na figura 1B, cada um dos MCs tem uma forma de uma pirâmide truncada de quadrada de cabeça para baixo (altura: 190 µm, pequena área de base: 90 µm x 90 µm e grande área de base: 370 µm x 370 µm). A placa do HMCA é usada para a preparação e cultivo de esferoides tumor 3D e, posteriormente, para o ensaio da invasão. Alternativamente, um selo comercial poderia ser usado para a produção de HMCA.
<ol><li>Prepare uma solução de 6% de agarose de derretimento baixo (LMA). Inserir a LMA pó e soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS) (0,6 g de LMA por 10 mL de PBS) em um frasco de vidro com um agitador magnético. Coloque a garrafa em um prato de aquecimento e agitar a solução durante o aquecimento a 80º C por algumas horas até que seja alcançada uma solução uniforme. Manter a solução a 70 ° C até o uso.</li>
	<li>Pré-aquece o carimbo PDMS para 70 ° C no forno. Mantê-lo aquecido até o uso. Como alternativa, usar um carimbo comercial e siga as instruções.</li>
	<li>Colocar as placas de comercial baixo vidro 6-poços em um banho seco, pre-aquecido a 75 ° C. Aguarde alguns minutos até que a placa esteja totalmente quente.</li>
	<li>Despeje uma gota (400 µ l) de LMA pré-aquecido no fundo de cada um dos poços da placa de vidro. Coloque delicadamente o carimbo PDMS pré-aquecido durante a queda de agarose. Incube a temperatura ambiente (RT) por 5-10 min para pre-coagulação e pré-resfriamento. Incube a 4 ° C por 20 min alcançar a gelificação de agarose completo. Em seguida, delicadamente Retire o PDMS, deixando o gel de agarose estampado com MCs. Nota: Este passo é feito simultaneamente em todos os poços.</li>
	<li>Colocar a placa em alto-relevo em um sistema equipado com lâmpada de ultravioleta (UV) de fotopolimerização e incube por 3 min. Nota: Agora a placa HMCA é UV esterilizado.</li>
	<li>Preencha os macropoços com PBS estéril para garantir que eles são mantidos úmidos, em seguida, cobrem a placa, envolvê-la com parafilm e armazená-lo em 4 ° C até o uso.</li>
	<li>Antes da utilização, vazios residuais de PBS da placa HMCA. Coloque a capota biológica.</li>
</ol>2. carregar células e formação de esferoide
<ol><li>Coletar as células da seguinte forma: remover todas as médias de uma monocamada de células 10 cm placa de cultura, duas lavagens com 10 mL de PBS para descarte de resíduos de soro, adicionar 5 mL de tripsina (pré aquecida a 37 ° C) e incube por 3 min em incubação a 37 ° C. Em seguida, agite a placa suavemente para garantir destacamento monocamada, adicionar 10 mL de meio completo (pré aquecido a 37 ° C) e pipeta acima e para baixo até alcançar a suspensão homogênea de células. Centrifugar e lavar a suspensão de células com 15 mL de meio fresco, então, suspender em concentrações adequadas no meio fresco completa.</li>
	<li>Delicadamente, carregar a suspensão de eritrócitos (50 µ l, 150 – 360 x 103 células/mL, em média, 40 – ~ 16 células por MC) em cima do HMCA e permitir que as células a se contentar com 15 min pela gravidade.</li>
	<li>Delicadamente adicione 6 – 8 alíquotas de meio fresco 500 µ l (total 3 – 4 mL) até a borda do plástico macropoço fundo fora do anel e hidrogel array.</li>
	<li>Incube as células HeLa por 72 h e as células MCF7 por 48 h a 37 ° C e 5% CO2, em um ambiente umidificado para a formação de esferoides.</li>
</ol>3. viabilidade deteção pelo iodeto de Propidium (PI) de coloração
<ol><li>Prepare uma solução stock de PI (500 µ g de PI por 1 mL de PBS). Mantê-lo em 4 ° C por cerca de 6 meses. Recentemente, prepare uma diluição de 1:2,000 (0,25 µ g/mL), pela adição de 6 µ l de estoque para 12 mL de meio completo sem vermelho de fenol, para placa HMCA o 6 (2 mL por bem).</li>
	<li>Transfira a placa HMCA com esferoides de 48-72 h, da incubadora biológica capota. Remova o HMCA médio todos apoiando a ponta na borda do fundo plástico macrobem ao lado da matriz de hidrogel, deixar o tanque de matriz repleta de médio.</li>
	<li>Delicadamente adicione 2 mL de diluição de PI de passo 3.1 para cada poço, apoiando a ponta na borda do plástico macrobem fundo. Incube a placa HMCA para 1 h a 37 ° C e 5% CO2, em um ambiente umidificado. Vá para a etapa 7. Nota: Outros corantes poderiam ser usados aqui, bem como, por exemplo, Hoechst para coloração do núcleo, diversos éster metílico (TMRM) para o potencial de membrana mitocondrial, coloração, diacetato de fluoresceína (FDA) para a deteção de células vivas, anexina V para apoptose detecção e outros.</li>
</ol>4. preparação de mistura de colágeno
<ol><li>Prepare água bidestilada estéril (DDW), autoclave e um estoque de 100 mL de solução de filtro-esterilizados de NaOH 1 M. Manter os materiais em RT e as pontas, usadas para a preparação de mistura de colágeno congelada a-20 ° C, até o uso.</li>
	<li>10 – 20 min antes do uso, coloque qual todos incluindo: DDW estéril, 1 M NaOH solução estéril, estéril 10 x PBS, colágeno tipo I de rabo de rato (armazenadas a 4 ° C, por 3-meses) e um tubo estéril para o balde de gelo até totalmente refrigerado. Coloque o balde de gelo dentro do capô biológico.</li>
	<li>Prepare-se 1.800 µ l da mistura de colágeno em uma concentração final de 3 mg/mL, para 6 HMCA invasão ensaio placa (300 µ l por alvéolo) como se segue. Adicionar o qual o tubo de refrigeração na seguinte ordem: 515 µ l de DDW, 24,8 µ l de 1 M de NaOH e 180 µ l de PBS 10x. Mistura bem pelo vórtice e lugar para o gelo. Finalmente, adicione 1080 µ l de colágeno à mistura, vórtice novamente e volte a colocar no gelo.</li>
</ol>5. HA e preparação de mistura de colágeno
<ol><li>Dissolva 10 mg de HA em 2 mL de DDW estéril. Incube a mistura a RT por alguns minutos e vórtice suavemente até que o pó é totalmente dissolvido. Armazene a solução a 4 ° C por até dois anos.</li>
	<li>Bem antes de usar, coloca a solução estoque HA no balde de gelo dentro do capô biológico.</li>
	<li>Prepare um 3 mg/mL de mistura de colágeno conforme descrito na etapa 4. Adicione 36 µ g (7.2 µ l) de HA em 1.800 μL de pronto a usar mistura de colágeno, para uma concentração final de 20 µ g/mL. Então, vórtice novamente brevemente e colocar de volta no gelo.</li>
</ol>6. ECM mistura adição
<ol><li>Transferir a placa do HMCA, com esferoides de 48-72 h, da incubadora ao subúrbio biológica e colocá-lo no gelo. Incube durante 10 minutos até que a placa é resfriada. Pré-aquecer uma solução de 1% LMA a 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Remova todos os meio ao redor do HMCA, apoiando a ponta na borda do fundo plástico macrobem ao lado da matriz de hidrogel. Então, cuidadosamente, remova todos os meio do tanque de matriz com um ponta bem/gel carregando ponta, apoiando a ponta na borda da matriz, suavemente e lentamente sugando tudo meio fora. Nota: Depois de remover todos os meio ao redor da matriz de hidrogel, o tanque de matriz ainda está cheio de médio. Este meio tem que ser removido muito suavemente para evitar a destruição do hidrogel MC e luxação de esferoides.</li>
	<li>Leve 150 µ l da mistura de colágeno ou mistura HA e de colágeno (mistura de ECM) com a ponta fina pre-congelada e adicionar no tanque de matriz, anexando a ponta para a borda da matriz. Libere a mistura lentamente para evitar luxação esferoide. Repita este passo com outra alíquota de 150 µ l, para um total de 300 µ-l por bem. Siga o mesmo procedimento para cada poço, até que todos os poços estão cheios. Em seguida coloque a placa na incubadora para 1 h para a gelificação completa de ECM.</li>
	<li>Depois de alcançada a gelificação completa de ECM, pipete 400 µ l de pré-aquecido 1% LMA em cima do gel de ECM. Cubra o prato com a sua tampa, incube a placa na RT por 5 – 7 min e depois por 2 min a 4 ° C, para gelificação de agarose. Finalmente, suavemente adicione 2 mL de meio completo apoiando a ponta na borda do plástico macrobem fundo. Nota: A camada de agarose impede o desprendimento da matriz do colágeno-gel do HMCA.</li>
</ol>7. invasão ensaio aquisição e análise
<ol><li>Carga a placa HMCA sobre uma motorizada invertido palco microscópio equipado com uma incubadora, pré-ajustada para 37 ° C, 5% de CO2 e atmosfera umidificada.</li>
	<li>Pré-determinar as posições para aquisição de imagem em cada bem a fim de cobrir a área de matriz inteira e usam 10. X ou 4 X de objectivos (esta etapa é necessária para o software de aquisição de imagem usado aqui, consulte a Tabela de materiais abaixo para detalhes). Como alternativa, usar qualquer software de aquisição de imagem para facilitar a varredura automática de toda a área necessária, escolhendo o "Stich" opção.</li>
	<li>Adquirir imagens de campo brilhante (BF) cada 2-4 h por um período total de 24-72 h para seguir a invasão das células do corpo esferoide em ECM circundante.</li>
	<li>Adquira imagens fluorescentes para a deteção de PI, usando um cubo fluorescente dedicado (excitação filtro 530 – 550 nm, espelho dicroico 565 nm longa passagem e emissão de filtro 600-660 nm).</li>
	<li>Exportar imagens BF/fluorescente lapso de tempo a partir do software de aquisição de imagem e salvá-los no formato de arquivo tagged-image (TIFF) para uma pasta usando a guia de "Banco de dados" na barra de ferramentas e, em seguida, no botão "Exportar arquivos de registro" . Nota: Nós desenvolvemos um código especial análise interna no software MATLAB que inclui uma interface de usuário gráfica projetada (GUI), no qual invasão análise poderia ser executado mais rápido e mais fácil. Neste código de análise, a segmentação da área de invasão e esferoides é feita semi-automaticamente usando filtro Sobel, seguido pelos operadores morfológicos erosão e dilatação. Após a segmentação automática das áreas, manuais correções foram feitas quando necessário para melhor precisão. Após a conclusão de segmentação, um conjunto de parâmetros foram automaticamente calculada pelo software e exportados para um arquivo do excel para manipulação adicional. A lista de parâmetros são: área seccional esferoide básica no tempo = 0, área de invasão de células conectadas ao corpo de esferoide = invasão principal, área de células separado da área de invasão principal, número de células separado da área de invasão principal, distância média de invasão do centro de massa do esferoide básica para a circunferência da área de invasão principal e células separadas e parâmetro de distância de invasão coletiva = d (d = √ ((X2 -X1)2 + (Y2 Y1)2) do Coordenadas X e Y esferoide centro de massa, antes (X1, Y1) e depois (X2, Y2) processo de invasão coletiva). Alternativamente, a análise de imagem poderia ser feito com qualquer outro software especializado.</li>
	<li>Abra o GUI e aperte o botão "Load BF" . Depois que a imagem é aberta, ajustar os parâmetros de segmentação (tamanho mínimo: > 1 e raio perto: > 1) para alcançar uma segmentação precisa do esferoide e sua área de invasão, em seguida, pressione o botão "Região de segmentação de interesse (ROI)" para execução e uma borda aparecerá ao redor de cada esferoide. Se a segmentação automática estiver incorreta, pressione o botão "Excluir" ou "Adicionar" e faça as correções solicitadas manualmente. Repita os mesmos passos para as imagens subsequentes.</li>
	<li>Pressione o botão "Rastreamento" para o número de esferoides e o software irá atribuir o mesmo número para cada spheroid em cada uma das imagens de lapso de tempo. Em seguida, pressione o botão "Medição" , que irá gerar uma planilha com todos os parâmetros. Salve esta planilha como um arquivo do excel para uso no processamento de resultados e estatísticas no software excel.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Está bem documentado que os organismos vivos, caracterizados por sua complexa organização multicelular 3D são bastante distintos das células comumente usados monocamada 2D cultivada, enfatizando a necessidade crucial de usar modelos de celulares que melhor imitam as funções e triagem de processos do organismo vivo para drogas. Recentemente, multicelulares esferoides, culturas de organotypic, organoids e órgãos-em-um-microplaqueta foram introduzidos8 para o uso na descoberta de medicamentos padroni...

Morte por cancro é atribuído principalmente à divulgação de células metastáticas para locais distantes. Muitos esforços no tratamento do câncer enfocam segmentação ou impedindo a formação de colônias metastáticas e progressão da doença metastática sistêmica1. Migração de células de câncer é um passo crucial no processo de metástase de tumor, assim, a pesquisa de cascata de invasão de câncer é muito importante e um pré-requisito para encontrar terapêutica antimetastática.
O uso de modelos animais como ferramentas para estudar doença metastática foi encontrado para ser muito caro e não sempre representativa do tumor em seres humanos. Além disso, a topologia do microambiente extracelular, a mecânica e a composição afetam fortemente câncer célula comportamento2. Desde que na vivo modelos inerentemente faltam de capacidade para separar e controlar tais parâmetros específicos que contribuem para a invasão do câncer e metástase, há uma necessidade de biomimetic controlável em vitro modelos.
Fim de metástase para órgãos distantes, as células cancerosas devem apresentar traços fenotípicos migratórios e invasivos que podem ser direcionados para a terapia. No entanto, desde que a maioria em vitro câncer de modelos não imitar as características reais de tumores sólidos3, é muito difícil de detectar fenótipos fisiologicamente relevantes. Além disso, a heterogeneidade fenotípica que existe dentro do tumor, dita a necessidade de analisar a migração do tumor em resolução de elemento único para descobrir terapias fenótipo-dirigido, por exemplo, pela segmentação da célula de metástase-iniciando população no tumores heterogêneos4.
O estudo da motilidade celular e migração coletiva é realizado principalmente em culturas de monocamadas de células epiteliais em superfícies planas homogêneas. Estes modelos de celulares convencionais para a migração de células de câncer são baseados sobre a análise da população de células individuais, invadindo através das membranas e ECM componentes5, mas em tais sistemas, as diferenças intrínsecas entre células individuais não podem ser estudou. Geração 3D esferoides através de andaimes ou em microestruturas de andaime-livre é considerado como um superior significa estudar o tumor de células crescimento e câncer invasão6,7,8. No entanto, mais sistemas 3D não são adequados para formatos de alta produtividade e interação inter esferoide geralmente não pode ser alcançada desde esferoides individuais isolados são gerados em cada micropoço de9. Estudos recentes, envolvendo a migração de câncer são baseados em microfluidic dispositivos3,10,11,12, no entanto, estas sofisticadas microfluidic ferramentas são difíceis de produzir e não pode ser usado para alto throughput screening (HTS) de drogas anti-invasivas.
Dois principais fenótipos, migração de células individuais e coletivas, que desempenham um papel nas células tumorais, superar a barreira de ECM e invadir tecidos vizinhos, tem sido demonstrada13,14, cada exibindo distintas morfológica características, mecanismos bioquímicos, moleculares e genéticos. Além disso, duas formas de migração células tumorais, como fibroblasto e ameboides, são observadas em cada fenótipo. Desde ambos, invasão fenótipos e modos de migração, principalmente são definidos pelas propriedades morfológicas, há uma necessidade para celular modelos essa detecção baseada em imagem de habilitar e exame de todas as formas de invasão do tumor e a migração de células.
O objectivo geral do método atual é fornecer um sistema simples e reprodutível biomimetic 3D em vitro baseados em células para a análise da capacidade de invasão em grandes populações de esferoides de tumor. Aqui, apresentamos a baseado no HMCA 6 imagem placa para a investigação de invasão do tumor e terapia antimetastática. A tecnologia permite a formação de um grande número de esferoides uniforme tumor 3D (450 por alvéolo) em uma estrutura de microcâmaras (MC) de hidrogel. Vários componentes de ECM são adicionados para a matriz de esferoide para permitir a invasão das células para o meio ambiente. Processo de invasão é continuamente monitorado pela observação de curto e longo prazo das células individuais de esferoides/invadir mesmo e facilita a caracterização morfológica, coloração fluorescente e recuperação de esferoides específicos em qualquer ponto. Desde numerosos esferoides compartilham o espaço e meio, interação através de moléculas solúveis esferoides individuais e seu impacto na outra é possível. Análise de imagem semiautomática é executada usando in-house código MATLAB que possibilita mais rápida e eficiente coleta de grande quantidade de dados. A plataforma facilita a medição exata, simultânea de numerosas células esferoides/invadindo de forma tempo-eficiente, permitindo o rastreio com throughput médio de drogas anti-invasão.

<table><tbody><tr><td>6 Placas de Fundo de Vidro de Micro-poço com vidro de cobertura de micro-poço #1.5 de 14 mm</td><td>Cellvis</td><td>P06-14-1.5-N</td><td>Placas de fundo de vidro comercial que são usadas para gravação HMCA</td></tr><tr><td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td>Uma solução de agarose a 6% é aquecida até 80 &deg; C antes do uso, uma solução de agarose a 1% é aquecida a 37 &graus; C</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA solução B</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1A</td><td>Aquecido a 37 &deg; C antes do uso</td></tr><tr><td>Meio DMEM, glicose alta</td><td>Indústrias Biológicas</td><td>01-055-1A</td><td>Aquecido a 37 &graus; C antes do uso</td></tr><tr><td>Soro Especial para Bezerros para Recém-nascidos (NBCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-122-1A</td><td>DPBS Inativado</td></tr><tr><td>por Calor (10x), sem cálcio, sem magnésio</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td>Mantido no gelo antes do uso</td></tr><tr><td>NaOH, anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Usado para a preparação de solução de NaOH 1</td></tr><tr><td>M Colágeno Cultrex Tipo I de cauda de rato, 5 mg/mL</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Mantido no gelo antes do uso</td></tr><tr><td>Sal de sódio do ácido hialurônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5542-10MG</td><td>Mantido no gelo antes do uso</td></tr><tr><td>Fisetina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F505-100MG</td><td>Adicionado ao meio de cultura, inibidor de invasão</td></tr><tr><td>DETA/NO</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>alx-430-014-m005</td><td>Adicionado ao meio de cultura, doador de óxido nítrico</td></tr><tr><td>PI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Usado em concentração muito baixa sem a necessidade de lavar</td></tr><tr><td>Sistema completo de lâmpada de inundação UV Dymax 5000-EC com proteção contra luz e Fonte de alimentação Dymax 400 Watt EC</td><td>Dymax Corporation</td><td>PN 39823</td><td>Usado para esterilização de placas HMCA por</td></tr><tr><td>microscópio UV Inverted IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td>Usado para aquisição automática</td></tr><tr><td>de imagens Incubadora para microscópio</td><td>Serviços de Imagem</td><td></td> de Vida <td>Essencial para experimentos de lapso de tempo com aquisição de imagens, pré-ajustado para 37 &deg; C, 5% CO2 e manter uma atmosfera umidificada</td></tr><tr><td>Platina motorizada submicrométrica tipo SCAN-IM</td><td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td><td></td><td>Usado para predeterminar áreas de aquisição de imagem, para aquisição automática</td></tr><tr><td>de imagem 14 bits, ORCA II C4742-98 câmera refrigerada</td><td>Fotônica</td><td></td> Hamamatsu <td>Altamente sensível, usado para imagens</td></tr><tr><td>Cubo de filtro fluorescente para detecção de PI</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Especificações do cubo de filtro: filtro de excitação 530-550 nm, espelho dicróico 565 nm de passagem longa e filtro de emissão 600-660 nm</td></tr><tr><td>O software operacional Olympus Cell^P</td><td>Software Olympus</td><td></td><td>usado para controlar microscópio, platina motorizada, câmera e aquisição de imagem</td></tr><tr><td>Software de análise Matlab R2014B</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Usado para desenvolver uma interface gráfica de usuário interna para análise de imagem</td></tr><tr><td>Software</td> <td>ExcelMicrosoft</td><td></td><td>Usado para gerenciamento de dados, cálculo, criação de gráficos e estatísticas</td></tr></tbody></table>

análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel microcâmara (hmca) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Metástase do cancro é conhecido por causar a 90% de letalidade do câncer. Metástase é um processo de várias fases que se inicia com a penetração/invasão de células tumorais no tecido vizinho. Assim, a invasão é um passo crucial na metástase, tornando a invasão processo de pesquisa e desenvolvimento de drogas antimetastáticos, altamente significativo. Para atender a essa demanda, há uma necessidade de desenvolver modelos 3D em vitro que imitam a arquitetura de tumores sólidos e seu microambiente mais estreitamente para o vivo estado por um lado, mas ao mesmo tempo ser reprodutível, robusto e apropriado para alto rendimento e altas conteúdas medições. Atualmente, a maioria dos ensaios de invasão inclinar-se em tecnologias sofisticadas microfluidic adequados para pesquisa, mas não para triagem de drogas de alto volume. Outros ensaios usando dispositivos baseados em placa com esferoides individuais isolados em cada poço estão consumindo material e tem o tamanho de amostra baixa por condição. O objetivo do protocolo atual é fornecer um sistema simples e reprodutível biomimetic 3D baseados em células para a análise da capacidade de invasão em grandes populações de esferoides de tumor. Desenvolvemos um modelo 3D para ensaio de invasão com base na placa da imagem latente de HMCA para a pesquisa de invasão do tumor e descoberta de drogas antimetastático. Este dispositivo permite a produção de numerosos esferoides uniformes por alvéolo (tamanho da amostra alta por condição) rodeado por componentes de ECM, enquanto continuamente e simultaneamente observar e medir os esferoides em resolução de elemento único para o meio seleção da produção de drogas antimetastáticas. Esta plataforma é aqui apresentada pela produção de esferoides HeLa e MCF7 para exemplificando unicelulares e invasão coletiva. Comparamos a influência do ácido hialurônico componente ECM (HA) sobre a capacidade invasiva de colágeno ao redor HeLa esferoides. Finalmente, não apresentamos Fisetin (inibidor de invasão) para HeLa esferoides e óxido nítrico () (ativador de invasão) para MCF7 esferoides. Os resultados são analisados pelo software interno que permite a análise semiautomático, simples e rápido, que facilita a análise multiparâmetro.

O único HMCA placa de imagem é usado para o ensaio de invasão de esferoides tumor 3D. O ensaio inteiro, começando com a formação de esferoide e terminando com o processo de invasão e manipulações adicionais, é realizado dentro do mesmo prato. Para a formação de esferoide, as células HeLa são carregadas para a bacia de matriz e ambientar o hidrogel MCs pela gravidade. O hidrogel de MCs, que têm características de fixação não-aderente/low, facilitar a interação célula-célula e a formação de...

Uma placa de imagem baseada em HMCA é apresentada para o desempenho do ensaio de invasão. Este prato facilita a formação de esferoides tridimensional (3D) tumor e a medição da invasão de células de câncer na matriz extracelular (ECM). A quantificação de ensaio de invasão é conseguida análise semiautomático.

Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

O objetivo deste simples sistema biomimético baseado em células 3D é facilitar a análise da capacidade de invasão em grande população de esferoide tumoral para rastreamento de drogas anti-metastáticas. A principal vantagem do nosso conjunto de micro-câmaras de hidrogel é que permite a produção de um grande número de esferoides uniformes que povoam o mesmo plano focal por poço. A posição esferoide é mantida devido à estrutura da matriz de microcervejas de hidrogel mesmo após a adição da matriz extracelular, facilitando o monitoramento contínuo preciso dos esferoides e o processo de invasão.Além disso, a caracterização morfológica e a coloração fluorescente de numerosos esferoides e células invasoras podem ser realizadas in situ e analisadas em uma resolução de elemento único de forma eficiente. Demonstrando o procedimento de produção de placas de seis poços de microarmes de hidrogel será Maria Sobolev do nosso laboratório. Para preparar as placas de matriz de microcrédola de hidrogel, primeiro pré-aqueça seis polidimimetilsiloxano, ou PDMS, carimba até 70 graus Celsius, e coloque uma placa de seis poços, de fundo de vidro em um banho seco pré-aquecido a 75 graus Celsius por vários minutos.Quando a placa estiver quente, despeje uma gota de 400 microliter de agarose pré-aquecido de baixo derretimento no fundo de cada poço da placa de seis poços, e coloque suavemente um carimbo sobre cada gota. Deixe a configuração esfriar por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente, seguido de 20 minutos a quatro graus Celsius para gelação de agarose completa. Quando a agarose se solidificar, retire suavemente o PDMS de cada poço, deixando os géis de agarose padronizados com micro-câmaras.Depois de permitir que a lâmpada UV atinja sua maior intensidade, coloque a placa em relevo no sistema de cura de luz por três minutos e encha os macro-poços esterilizados por UV com PBS estéril. Em seguida, cubra a placa e enrole-a com Parafilm para armazenamento Celsius de quatro graus até usar. Para carregar as células, remova o PBS de cada poço e carregue suavemente 50 microliters das células de interesse em cima de cada matriz de hidrogel.Depois de permitir que as células se instalem por gravidade por 15 minutos, adicione cuidadosamente seis a oito alíquotas de 500 microlitros de meio fresco à borda do fundo plástico macro-bem fora do anel e da matriz de hidrogel. Incubar as células para o período de tempo adequado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com umidade para a formação de esferoides. Então, transfira os esferoides para um capuz de biossegurança no gelo por 10 minutos.Quando a placa tiver esfriado, incline uma ponta de pipeta na borda do fundo plástico macro-bem ao lado da matriz de hidrogel, e remova todo o meio ao redor da matriz. Em seguida, remova o meio do tanque de matriz, incline uma ponta de pipeta de carregamento de gel na borda do tanque de matriz com muito cuidado, tomando cuidado para não perturbar as micro-câmaras e esferoides. Em seguida, use uma ponta de pipeta pré-congelada e fina para adicionar duas alíquotas de 150 microliters da mistura de colágeno de interesse na borda da matriz uma de cada vez, liberando a mistura lentamente para evitar a luxação esferoide.Após a segunda rodada de colágeno ter sido adicionada a cada poço, devolva os esferoides à incubadora por uma hora para a gelação completa da matriz extracelular. Quando a matriz se solidificar, adicione 400 microliters de agarose pré-aquecida de 1%de derretimento baixo em cima do gel, e incubar a placa, coberta à temperatura ambiente, por cinco a sete minutos, antes de esfriar por dois minutos a quatro graus Celsius para gelação agarose. Em seguida, inclinando a pipeta na borda do fundo plástico macro-bem, adicione suavemente dois mililitros de meio completo para cada poço.Para realizar um ensaio de invasão, carregue a placa de matriz de microdúla de hidrogel em um estágio de microscópio invertido motorizado equipado com uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius e 5% com uma atmosfera umidificada, e use um objetivo de quatro ou 10x para pré-determinar as posições para a aquisição de imagem em cada poço para que toda a área do array seja avaliada. Em seguida, adquira imagens de campo brilhante a cada duas ou quatro horas por um total de 24 a 72 horas para rastrear a invasão celular do corpo esferoide até a matriz extracelular circundante. No final da aquisição da imagem, exporte as imagens de lapso de tempo do software de aquisição de imagens para economizar em um formato de arquivo de imagem marcado para uma pasta dedicada.Em seguida, abra a interface do usuário gráfico e clique em Load Bright Field. Ajuste os parâmetros de segmentação da imagem para obter uma segmentação precisa dos esferoides e suas áreas de invasão, e clique na Segmentação região de interesse para criar uma borda em torno de cada esferoide. Se a segmentação automática estiver incorreta, pressione Excluir ou Adicionar e faça as correções apropriadas manualmente.Clique em Rastrear para numerar os esferoides em cada uma das imagens de lapso de tempo. Em seguida, clique em Medição para gerar uma planilha com todos os parâmetros e salvar a planilha em um formato apropriado para processamento de dados e análise estatística. Para examinar a influência do ácido hialurônico no processo de invasão espontâneo hela spheroid, neste experimento, os esferoides de dois dias foram cobertos com solução de mistura de colágeno e ácido hialurônico e comparados com esferoides de dois dias cobertos apenas com solução de colágeno.Após 50 horas de incubação, os esferoides embutidos no colágeno e ácido hialurônico demonstraram uma dispersão celular inferior na matriz extracelular circundante em comparação com os esferoides embutidos apenas no colágeno. De fato, a análise da cinética da área de invasão ao longo do tempo para 99 esferoides em resolução de esferoides únicos indica claramente que a adição de ácido hialurônico ao colágeno inibe a dispersão celular fora do esferoide, resultando em áreas de invasão menores. O tratamento da cultura esferoide HeLa com um flavonoide bioativo com propriedades cito-e migratórias por 24 horas resulta em uma dispersão celular inibida em torno dos esferoides em comparação com spheróides hela não tratados.De fato, a análise das áreas de invasão de 488 esferoides no final do experimento revelou uma inibição significativa após o tratamento com apenas 10 micromolar da droga. Devido à baixa característica de apego do hidrogel, essa tecnologia baseada em microcrédito facilita a formação de esferoides mesmo em casos de pouquíssimas células. Isso é especialmente vantagem em valiosas amostras de células primárias limitadas do câncer ou derivadas do paciente.A placa de imagem de microcrédito de hidrogel permite a análise da localização espacial exata dos esferoides durante experimentos de longo prazo para a avaliação do processo de invasão no nível de elemento único e fornece um alto grau de robustez estatística e precisão. As aplicações futuras desta metodologia incluem a cultura multicelular lateral de tumores e células estromicanas em diferentes regiões dentro do macro-poço e a recuperação de esferoides individuais para análise molecular a jusante.

analysis-cancer-cell-invasion-anti-metastatic-drug-screening-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

A técnica de impedância elétrica em tempo real baseado medir Invasão de monocamada de células endoteliais por células cancerosas

Este vídeo descreve um ensaio de invasão usando uma matriz de três câmaras baseada em impedância elétrica. Esta técnica mede o potencial invasivo das células cancerígenas sob a influência de fatores solúveis secretados pelas células estromais residentes em microambientes tumorais.

Ensaio de impedância baseado em matriz de três câmaras: uma técnica de análise em tempo real para avaliar o potencial invasivo de células cancerígenas medindo a impedância elétrica

Este método avalia a invasão de células cancerígenas de esferóides em uma matriz 3D circundante.  Os esferoides são gerados através do método de cultura de gota suspensa e, em seguida, incorporados em uma matriz composta de materiais de membrana basal e colágeno tipo I.  A invasão dos esferóides é posteriormente monitorada.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

Este estudo relata dois métodos diferentes para a análise de migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e em vitro vídeo baseado em microscópio cicatrização ensaio. São descritos os protocolos para estes dois experimentos, e suas vantagens e desvantagens são comparadas.

Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

O ensaio de invasão celular in vitro é utilizado para medir o potencial de metástase oncológica, quantificando o potencial celular para invasão e migração usando inserções de cultura celular contendo matriz proteica. As células são desafiadas a migrar através da matriz proteica e uma membrana porosa, em direção a um quimioatractivo, e depois quantificada por microscopia de luz.

O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

Este é um método eficaz para testar supressores ou condutores de metástase de câncer. As células, transduzidas com uma biblioteca de expressão, são injetadas na vasculatura da membrana corioallantóica do frango para formar colônias metastáticas. Colônias que têm diminuído ou aumentado a invasividade são extirpadas, expandidas, reinjetadas para confirmar seu fenótipo e, finalmente, analisadas usando alto sequenciamento de rendimento.

Descoberta de reguladores metastáticos usando um modelo de membrana corioallantóica intravital rápida e quantitativa

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.

Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

O ensaio cam-delam para avaliar a capacidade metastática das células cancerosas é relativamente rápido, fácil e barato. O método pode ser usado para desvendar os mecanismos moleculares que regulam a formação de metástase e para a triagem de drogas. Um ensaio otimizado para análise de amostras de tumores humanos pode ser um método clínico para tratamento personalizado do câncer.

Ensaio cam-delam para pontuação de propriedades metastáticas quantificando a capacidade de delaminação e invasão de células cancerosas

A invasão é um fenômeno biológico importante no desenvolvimento e progressão do câncer. Esse processo é influenciado por células não neoplásicas e componentes do microambiente tumoral. O objetivo deste estudo é descrever um método alternativo para análise da invasão de células tumorais in vitro usando culturas tridimensionais (3D).

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Aprenda a analisar a invasão de células de câncer usando a matriz de hidrogel Microcâmara para triagem de drogas antimetastáticas. Este método permite monitorar continuamente esferoides tumorais em 3D com alta resolução.

Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas (Vídeo) | JoVE Journal

Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

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