Name: Visualizar Drosophila perna neurônio Motor axônios através da cutícula adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda a visualizar axônios de neurônios motores em pernas de Drosophila através da cutícula adulta usando proteínas fluorescentes. Este método permite reconstrução tridimensional detalhada para estudos de neurociência.

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Agradecemos a Robert Renard para preparar meio comida de mosca. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de NIH NS070644 para R.S.M e financiamento da ALS Association (#256), FRM (#AJE20170537445) e programa de ATIP-Avenir de J.E.

1. perna dissecção e fixação
<ol><li>Pegue uma placa de vidro multi bem e preenchimento adequado número de poços com etanol a 70%. Adicionar 15 – 20 CO2-moscas anestesiados (de qualquer sexo e qualquer idade) para cada um bem e usando um pincel, delicadamente dab o voa para a solução de etanol até moscas são totalmente submerso. Nota: Este passo é remover a hidrofobicidade da cutícula. Não lave por mais de 1 min, porque isto aumenta a autofluorescência da cutícula.</li>
	<li>Enxague as moscas 3 vezes com solução de detergente tensoativo não iônico 0,3% em 1x salina tamponada fosfato (PBS). Manter as moscas nesta solução pelo menos 10 min. Nota: As pernas são fixas melhor quando incluindo detergente, que é susceptível de aumentar a penetração do fixador dentro da perna.</li>
	<li>Coloque uma placa multi bem no gelo juntamente com um tubo de paraformaldeído 4% (PFA). Nota: A preparação do fresco 4% PFA de uma 16% PFA etanol livre solução é essencial.</li>
	<li>Use a pinça para remover a cabeça e o abdômen das moscas sem danificar o segmento torácico ou as pernas. Nota: Remover o abdome torna mais fácil para prender a mosca e dissecar as pernas.</li>
	<li>Dissecar as pernas do segmento torácico com pinça e coloque as pernas nos poços contendo 4% PFA. Por isso, empurre suavemente mas com firmeza na junção de coxa-tórax, usando a ponta da pinça fina até a perna desconecta.</li>
	<li>Corrigi as pernas em 4% PFA overnight a 4 ° C (aproximadamente 20 h total).</li>
	<li>Lave as pernas com solução de detergente tensoativo não iônico 0,3% em PBS 1x, x 5 por 20 min cada.</li>
	<li>Substitua o tampão de lavagem por meio de montagem. Mantenha a perna no meio de montagem pelo menos um dia antes da montagem para permitir a sua penetração completa na perna. Nota: Se o meio de montagem é altamente viscoso, dilua o meio de montagem a 80% com PBS 1x porque a súbita mudança de viscosidade pode causar a cutícula recolher e danificar a estrutura geral da perna. Dependendo do driver Gal4 , moscas podem ser preservadas durante 1 a 3 semanas a 4 ° C, em mídia de montagem até a montagem.</li>
</ol>2. perna montagem
<ol><li>Coloque aproximadamente 20 µ l de glicerol de 70% no lado esquerdo de uma lâmina de microscópio e cobrir com uma lamela de2 quadrado 22 x 22 mm (Figura 2A, B). Pipete cerca de 10 µ l de meio de montagem, ao longo de uma linha paralela a e a uma pequena distância entre a borda direito desta lamela. Adicione outro µ l 30 de meio de montagem mais no lado direito do slide (Figura 2). Nota: Ao aplicar uma lamela sobre as pernas (veja abaixo) o meio de montagem suavemente se espalhará sob a lamela e em redor das pernas sem deslocando-os.</li>
	<li>Usando a pinça fina levante a perna da solução e gentilmente colocá-lo sobre o meio de montagem perto da lamela à esquerda. Faça o mesmo para cada perna e alinhá-los de cima para baixo (Figura 2D).<ol>
<li>Levante-se e transferir as pernas em uma gota de meio realizada entre ambas as pontas da pinça. Orientar as pernas de duas maneiras: lado externo cima ou para baixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que todos os pés (até 6-8 pernas podem ser montadas) estão devidamente alinhados, colocar uma segunda lamela sobre as pernas tal que esta lamela ligeiramente repousa sobre a lamela previamente colocada (figura 2E) para permitir o espaço entre a lamínula e o tecido e a Evite que as pernas de ficar danificado (Figura 2). Nota: Como alternativa, use adesivo poços ou cera ortodôntica para criar espaço entre a lamínula e o slide.</li>
	<li>Use um esmalte para assegurar a posição das lamelas em cada canto (Figura 2F). Nota: O tecido está pronto para a imagem.</li>
</ol>3. imagem latente
<ol><li>Configure uma única faixa usando o laser de 488 nm e dois detectores simultaneamente para obter tanto a fluorescência de GFP e cutícula autofluorescência. Usando o controle de intervalo ou a exibição de controle deslizante na janela espectral da janela do feixe luminoso do software, defina o intervalo de detecção de um detector (detector de 1) entre 498-535 nm e a do outro (detector 2) entre 566-652 nm. Nota: Normalmente, o detector 1 deve ser um GaAsP e o detector 2 um tubo fotomultiplicador. O canal de 498-535 otimamente detecta sinal GFP, mas também detecta a fluorescência do auto da cutícula. No entanto, o canal de 566 – 652 detecta apenas a fluorescência do auto da cutícula (Figura 3A).</li>
	<li>Use um 20 X ou 25 X óleo objectivo de imersão, 1024 x 1024 pixels de resolução, profundidade de 12 bits e definir o espaçamento de Z como 1 µm. pixel Set Habitai tempo como aproximadamente 1,58 µs e média 2 frames/imagem. Use os objectivos com abertura numérica elevada.</li>
	<li>Defina todas as outras configurações, dependendo do microscópio confocal e software da imagem latente a ser utilizado.<ol>
<li>Certifique-se de obter um sinal de cutícula mais brilhante do detector de 566 – 652, em vez do detector de 498-535. Para fazer isso, use a mesma potência do laser do laser-488 para ambos os detectores. Utilizando os marcadores de saturação, regule o ganho do detector 1 para obter um sinal brilhante o suficiente de GFP (Figura 3B, D). Em seguida, ajuste o ganho do detector 2 para garantir que algumas áreas com sinal de alta cutícula (bordas de pernas, articulações) produzem um sinal saturado neste detector (Figura 3, E).</li>
		<li>Se a perna é estendida e muito grande para ser fotografada em um único quadro, use a opção de telha ou posição a partir do software de imagem de microscópio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reconstrua as imagens finais ou usando o microscópio proprietário software de imagem ou usando o ImageJ/FIJI freeware (veja abaixo).</li>
</ol>4. pós processamento de imagem
<ol><li>Abra a pilha confocal no ImageJ/FIJI.<ol>
<li>Use o plugin Bioformats (Plugins | Bio-formatos | Importador de bio-formats) em FIJI para abrir imagens que não estão aqui. Formato TIF do proprietário da imagem latente de pacotes de software9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dividir os canais selecionando imagem | Cor | Separação de canais. Nota: Se imagens a partir de várias posições foram feitas e devem ser recombinadas, use o emparelhadas costura plugin em FIJI de (Plugins > costura > costura Pairwise)10,11.</li>
	<li>Para subtrair o sinal da cutícula do sinal de GFP, abra a calculadora de imagem (processo | Calculadora de imagem): selecione a pilha do detector 1 como 1 imagem (GFP + cutícula) (Figura 4A), na janela de operação Selecione subtraire selecione a pilha do detector 2 como imagem 2 (cutícula) (Figura 4B). Como resultado, apenas o endógeno sinal GFP (GFP) é obtido (Figura 4).<ol>
<li>Mesclar volta esta pilha (GFP), com a pilha 'somente cutícula' Obtida de detector 2 (Figura 4B imagem | Cor | Mesclagem de canais) para obter uma imagem RGB que compreende do sinal GFP de tecido-específica, bem como o sinal de cutícula, que ajuda a identificar os mandris de axônio dentro dos segmentos de perna (Figura 4).</li>
		<li>Ajustar o contraste e brilho de cada imagem (imagem de| Ajustar | Brightness/Contrast) e então gerar uma única imagem RGB (imagem | Tipo | Cor RGB). Nota: Para gerar uma projeção máxima da pilha-Z (imagem | Pilhas | Projeto Z...), usar a projeção de intensidade máxima para o sinal GFP e intensidade média para a cutícula, que então pode ser ajustada para brilho antes da fusão de dois canais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Como alternativa, use uma macro para processamento de imagens em ImageJ/FIJI e subtração automática. Copie o texto em suplementar 1 arquivo no editor de macro (Plugins | Novo | Macro), salve a macro na pasta de Plugins e reiniciar ImageJ/FIJI uma vez para ser capaz de usar a macro.<ol>
<li>Para usar a macro, abra a pilha confocal e abrir a janela de brilho/contraste (imagem | Ajustar | Brightness/Contrast). Em seguida, execute a macro (Plugin | Macro | Executar) e siga as instruções.</li>
		<li>Quando solicitado a especificar a operação (janela de calculadora de imagem), escolha 1 imagem como pilha 1 (GFP), imagem 2 como pilha 2 (cutícula) e subtrair. Nota: A macro gera uma imagem de projeção máxima do sinal processado GFP (MAX_Result de stack1), uma projeção média da cutícula (AVG_stack2), o resultado da subtração da pilha da pilha de GFP (resultado de stack1) e o não transformados cutícula pilha de cutícula (stack2).</li>
		<li>Quando perguntado para ajustar o contraste, use os controles na janela/controle de brilho para ajustar o brilho/contraste da imagem projeção máxima de GFP e da projeção da cutícula, para gerar uma imagem mesclada RGB de ambos os sinais mostrando a GFP em média verde e a cutícula em cinza. Mescle o resultado de stack1 e stack2, para da mesma forma, gerar uma pilha de GFP e cutícula combinada que pode ser usada na próxima fase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para visualizar as pernas em três dimensões, use software 3D especializado com as pilhas recém-gerado (Figura 4E).<ol>
<li>Abrir a pilha RGB com software 3D (ver Tabela de materiais). Na janela de diálogo pop-up, selecione todos os canais na seção modo de conversão e digite o tamanho de um voxel (volume de um pixel). Nota: Toda a informação necessária está contida nos arquivos de imagem de qualquer software proprietário microscópio sendo usado.</li>
		<li>No módulo de canal 2 (sinal GFP), botão direito do mouse e selecione Display | volren. Em seguida, clique no módulo volren. Na seção Propriedades (canto inferior esquerdo da tela) clique esquerdo em Editar e selecione volrengreen.col. No módulo de canal 1 (sinal de cutícula), botão direito do mouse e selecione Display | volren. Em seguida, clique no módulo volren. O seção Propriedades clique em avançado e selecione ddr (uma exposição de radiografia, como transparente), então ajuste o valor de gama para ver o fundo da cutícula (Figura 4E).</li>
		<li>Para gerar uma rotação 3D, botão direito do mouse sobre o módulo de pilha do projeto. Em seguida, selecione animar | rode. Esquerdo, clique em módulo de girar.</li>
		<li>Nas Propriedades de seção clique em usar o bbox center. O módulo de girar com o botão direito e selecione computar | cineasta. No módulo de cineasta clique no botão esquerdo do mouse. Na seção Propriedades clique esquerdo no avançado (superior direito da seção de propriedades).</li>
		<li>No campo nome do arquivo , preencha o nome de rotação do filme. No campo de qualidade escreva 1 (qualidade máxima). Deixar o quadro em 200 se for desejado um rotação s 8.3 (este número pode ser diminuído ou aumentado para modificar a velocidade de rotação). Em seguida, pressione aplicar (botão verde, canto inferior esquerdo da secção de Propriedades (ver vídeo 1)).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).</li>
<li>Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+muscles+and+tendons+of+the+Drosophila+leg%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg.</a> Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).</li>
<li>Baek, M., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+and+Birth+Date+Specify+Motor+Neuron+Targeting+and+Dendritic+Architecture+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).</li>
<li>Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origins+and+architecture+of+Drosophila+leg+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).</li>
<li>Enriquez, J., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+Individual+Adult+Motor+Neuron+Morphologies+by+Combinatorial+Transcription+Factor+Codes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes.</a> Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).</li>
<li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter%3A+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%22%5BJournal%5D)">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differing+Strategies+Despite+Shared+Lineages+of+Motor+Neurons+and+Glia+to+Achieve+Robust+Development+of+an+Adult+Neuropil+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila.</a> Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).</li>
<li>ImageJ. Bio-Formats. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Bio-Formats">http://imagej.net/Bio-Formats</a> (2018).</li>
<li>ImageJ. Image Stitching. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Image_Stitching">http://imagej.net/Image_Stitching</a> (2018).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li>
<li>Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+targeting+in+the+leg+neuropil+of+Drosophila%3A+the+role+of+midline+signalling+molecules+in+generating+a+myotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000199(2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A cutícula de Drosophila adulto e de outros artrópodes, que contém muitos pigmentos escuros, é um grande obstáculo para a visualização de estruturas dentro do seu corpo. Além disso, é fortemente fluorescente auto que é agravada pela fixação. Estas duas características são muito problemáticas para observações de corantes fluorescentes ou moléculas dentro do corpo dos animais com um exoesqueleto.
O procedimento que descrevemos e que usamos rotineiramente no laboratório produz imagens limpas e de...

Como o membro de vertebrados, a perna de Drosophila adulta é organizada em segmentos. Cada perna de mosca contém 14 músculos, cada um dos quais compreende várias fibras musculares1,2. Os corpos celulares de MNs a perna adultos estão localizados no T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) e T3 (metathoracic) gânglios em cada lado do cabo ventral do nervo (VNC), uma estrutura análoga à medula espinhal vertebrada (Figura 1). Existem aproximadamente 50 MNs em cada gânglio, cujo objectivo músculos em quatro segmentos da perna ipsilateral (coxa, trocanter, fêmur e tíbia) (Figura 1)3. Importante, cada perna adulta individual MN tem uma identidade única e morfológica que é altamente estereotipada entre animais3,4. Todas essas MNs exclusivos são derivados de 11 células-tronco, chamadas neuroblastos (NBs) produzindo perna MNs durante os estágios larvais de3,4. No final da fase larval todos os imaturos MNs postmitotic diferenciam durante a metamorfose para adquirir seus mandris dendríticas específicos e alvos terminais axonal que definem sua morfologia original3,4. Anteriormente, nós testamos a hipótese de que um código combinatório de factores de transcrição (TFs) especifica a morfologia original de cada perna adulta Drosophila MN5. Como modelo, utilizamos a linhagem B, uma das 11 NB linhagens que produz sete fora os MNs e demonstrou que um código combinatório do TFs expressa na perna adulta postmitotic MNs dita suas morfologias individuais. Por reprograming o código TF de MNs, fomos capazes de alternar as morfologias MN de forma previsível. Chamamos-lhes TFs: MTF (TFs morfológico)5.
Uma das partes mais desafiantes das análises morfológicas dos adultos MNs é Visualizar os axônios através de uma cutícula espessa e autofluorescente com alta resolução. Nós geralmente rotulamos axônios com uma membrana-tag GFP que se expressa no MNs com um sistema de expressão binário, como DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP ou DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, onde DVglut é um forte expressado em motoneurônios6. Combinando estas ferramentas com outras técnicas clonais, como análise de mosaico com um marcador repressible (MARCM)7, cis-MARCM8ou MARCMbow5, nós pode restringir a expressão de GFP de subpopulações de MNs, fazendo a análise fenotípica de axônios mais fácil. Geramos um protocolo a fim de manter a perna morfologia axonal MN intacta para reconstrução 3D de imagens e subsequente, abordando questões específicas intrínsecos na perna de Drosophila adulto tais como (1) fixação das estruturas internas da perna adulta sem afetar a morfologia do axônio, expressão fluorescente endógena e musculatura da perna, (2) montagem da perna para preservar a estrutura geral sob uma lamela e na orientação adequada para processamento para obter a cutícula de imagem da imagem latente e (3) fundo, bem como sinal fluorescente axonal. Embora este protocolo tem sido detalhado para a detecção de expressão fluorescente em axônios MN, pode ser aplicado para visualizar outros componentes da perna neuromusculature em artrópodes.

<table><tbody><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Fisher</td><td>E/6550DF/17</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>surfactante não iônico</td> de grau reagente analítico absoluto <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100, para biologia molecular</td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td>Pinça de joalheiro, Dumont No. 5</td></tr><tr><td>Placa de vidro multipoços</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>71563-01</td><td>Pirex de 9 cavidades, 100 mm x 85 mm</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Thermofisher</td><td>28908</td><td>Pierc 16% Formaldeído (w/v),</td></tr><tr><td>Glicerol</td> sem metanol <td>Fisher BioReagents</td><td>BP 229-1</td><td>Glicerol (Biologia Molecular)</td></tr><tr><td>Espaçadores</td><td>Sun Jin Lab Co</td><td>IS006</td><td>iSpacer, quatro poços, cerca de 12 &mu; L volume de trabalho por poço, 7 mm de diâmetro, 0,18 mm de profundidade</td></tr><tr><td>Quadrado 22 mm x 22 mm de lamínulas</td><td>Fisher Scientific</td><td>FIS#12-541-B</td><td>No.1.5-0,16 a 0,19 mm de espessura</td></tr><tr><td>Meio de Montagem</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Vectashield Antifade Meio de Montagem Microscópio</td></tr><tr><td>confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>LSM780; objetiva utilizada LD LCI Plan-Apochromat 25X/0,8 Imm Korr DIC M27 (óleo/ silício/glicerol/água<br/imersão >) (420852-9871-000)</td></tr><tr><td>software de imagem</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2011</td></tr><tr><td>Software de imagem 3D</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Amira 6.4</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>ImageJ/FIJI</td></tr></tbody></table>

visualizar drosophila perna neurônio motor axônios através da cutícula adulto

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

A maioria dos trabalhos na especificação neuronal procedeu-se em genética e fisiologicamente tractable modelos como o C. elegans, Drosophila larvas e peixes, que todos se envolver em movimentos ondulatória (como rastreamento ou natação) como seu principal modo de locomoção. No entanto, uma forma mais sofisticada compreensão da especificação individual do neurônio motor (MN) — pelo menos em termos de informar terapias doença — exige um sistema igualmente tractable que modela melhor os esquemas complexos baseados em apêndice locomoção de vertebrados. O sistema locomotor Drosophila adulto responsável por andar reúne-se todos esses critérios com facilidade, já que neste modelo é possível estudar a especificação de um número pequeno de perna facilmente distinto MNs (aproximadamente 50 MNs por perna) ambos usando um vasto matriz de poderosas ferramentas de genéticas e no contexto de um sistema de locomoção baseada em apêndice fisiológico. Aqui descrevemos um protocolo para visualizar a inervação do músculo de perna em uma mosca adulta.

Como mostrado na Figura 4, este procedimento permite excelente imagem de axônios GFP-etiquetado em adultas pernas de Drosophila , juntamente com seus terminais mandris. Importante um sinal limpo do GFP é obtido sem qualquer contaminação por fluorescência emitida pela cutícula da perna. O sinal da cutícula então pode ser combinado com o sinal GFP para identificar o posicionamento de axônios nas pernas (Video 1, Figura 1e<...

Aqui descrevemos um protocolo para visualizar o direcionamento axonal com uma proteína fluorescente em adultas pernas de drosófila por fixação, montagem, imagem e pós-imagem passos.

Visualizar Drosophila perna neurônio Motor axônios através da cutícula adulto

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Este método pode ser facilmente adaptado para observar sinais de outras proteínas fluorescentes ou pode ser usado para imagem de axônios em outros adultos A principal vantagem desta técnica facilita uma excelente reconstrução tridimensional e visualização dos axônios e suas arboris terminais. Comece preenchendo o número adequado de poços em uma placa de vidro multi-poço com 70% de etanol. Use um pincel para adicionar de 15 a 20 moscas anestesizadas de dióxido de carbono de qualquer idade ou sexo a cada poço e gentilmente dab as moscas no etanol até que elas estejam totalmente submersas.Depois de não mais do que um minuto, enxágue as moscas três vezes com solução de detergente surfactante não-iônico de 0,3% em soro fisiológico tamponado por pelo menos 10 minutos por lavagem. Após a última lavagem, use fórceps para remover a cabeça e o abdômen de cada mosca sem danificar o segmento torácico ou as pernas e use a ponta de um par de fórceps finos para aplicar suavemente, mas firmemente, pressão na junção coxa-tórax para separar uma perna do segmento torácico. Coloque as pernas em um poço de uma nova placa multi-poço contendo 4% de paraformaldeído no gelo para uma incubação durante a noi

visualize-drosophila-leg-motor-neuron-axons-through-the-adult-cuticle

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Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Drosophila melanogaster larvas fornecer um modelo de sistema ideal para investigar os mecanismos de transporte axonal dentro larval nervos segmentares. Usando este procedimento, 3 de larvas portadores de mutações diferentes podem ser comparadas às larvas do tipo selvagem.

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

Este protocolo discute a dissecção ao vivo...

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

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Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos

No patch situ gravações de fixação são usados ​​para a caracterização eletrofisiológica dos neurônios no circuito intacto. No modelo genético Drosophila patch clamping é difícil, porque o SNC é pequeno e está rodeado por uma bainha robusto. Este artigo descreve o procedimento para remover os neurônios bainha e limpa para gravações posteriores braçadeira de patches.

Preparação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Os neurônios centrais para<em&gt; In situ</em&gt; Patch aperto

Este vídeo descreve um método para dissecar, fixar e montar a perna adulta da Drosophila, preservando sua neuromusculatura intacta para análise de imagem.

Processamento de pernas de insetos para microscopia de fluorescência: um método para preservar estruturas neuromusculares para imagens

Fonte: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/58365/ visualize-drosophila-perna-motor-neurônio-axônios-através-da-cutícula-adulta'&gt;Guan, W., et. al. Visualize Drosophila axônios do neurônio motor da perna através da cutícula adulta. J. Vis. Exp. (2018) &lt;p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Este vídeo demonstra imagens deDrosophila pernas com neurônios motores que expressam proteínas fluorescentes verdes usando microscopia...

Imagem de neurônios motores marcados com fluorescência em uma perna adulta de Drosophila

Fonte: Jeong, S. Visualização do padrão de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a visualização de projeções axonais em embriões Drosophila. A imunomarcação de neurônios motores, a dissecção precisa para expor estruturas neuronais e a microscopia de contraste de interferência diferencial revelam coletivamente a arquitetura neuronal detalhada, enfatizando os padrões de projeção axonal.

Visualização de padrões de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

Descrevemos uma técnica de dissecção que preserva a arquitetura da junção neuromuscular e permite um estudo imunocitoquímico detalhado dos neurônios motores na perna de Drosophila adulta.

Dissecção e Imunohistoquímica da Perna Adulta Drosophila para detectar alterações na junção neuromuscular para um neurônio motor identificado

Aprenda a visualizar axônios de neurônios motores em pernas de Drosophila através da cutícula adulta usando proteínas fluorescentes. Este método permite reconstrução tridimensional detalhada para estudos de neurociência.

Visualizar Drosophila perna neurônio Motor axônios através da cutícula adulto

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