Name: Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: Aprenda a intubação oral em zebrafish adultos para avaliar a absorção intestinal de compostos bioativos. Este método simples permite estudar respostas imunes locais e dinâmica da mucosa intestinal.

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Este trabalho foi apoiado por concessões do Ministério da ciência, espanhol AGAUR fundos para NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER e 2014SGR-345 AGAUR) e Comissão Europeia. RT detém uma bolsa doutorandos de AGAUR (Espanha), JJ foi apoiada por uma bolsa de doutorado do Conselho da bolsa de China (China) e NR é suportado pelo programa de Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Agradecemos o Dr. Torrealba por consultoria especializada na produção de proteína, s. Botelho da "Servei de Microscopia" e Dr. M. Costa desde o "Servei de Citometria" da Universitat Autònoma de Barcelona, para assistência técnica útil.

Todos os procedimentos experimentais envolvendo peixe-zebra (Danio rerio) foram autorizados pelo Comitê de ética da Universitat Autònoma de Barcelona (número CEEH 1582) de acordo com os princípios orientadores do Internacional para pesquisa envolvendo animais ( EU 2010/63). Todos os experimentos com zebrafish ao vivo foram realizados em 26 e 28 ° C.
1. preparar o equipamento para intubação Oral
<ol><li>Coloque aproximadamente 1 cm de um tubo de silicone fino sobre uma agulha de bloqueio de Luer de 31 mil para cobrir a ponta da agulha.</li>
	<li>Corte uma pipeta de filtro estéril 10 µ l de ponta (cerca de 2 cm), pegue a ponta mais fina e coloque-o sobre o tubo de silicone como uma bainha. Certifique-se que a pipeta se estende para além da ponta da agulha para evitar ferir o animal.</li>
	<li>Conecte a agulha de uma seringa de fecho Luer µ l 100. Nota: Lave sempre com etanol, e em seguida tampão fosfato salino (PBS, ver materiais) completamente entre os tratamentos.</li>
</ol>2. soluções necessárias
<ol><li>Prepare a 150 mg/L (anestesia) ou 300 mg/L (eutanásia) da solução de Metanossulfonato (MS-222) etil 3-aminobenzoato com água do aquário onde o peixe-zebra são mantidas. Encher um tanque pequeno com 1 L de solução anestésica e mantê-lo arejado.</li>
	<li>Preencher outro tanque pequeno com 1 L de água do aquário sem MS-222 para recuperação do peixe e mantê-lo arejado.</li>
	<li>Fazer 50 mL de 1X PBS de uma solução estéril de 10x.</li>
	<li>Para o isolamento de célula intestinal/análise cytometry, prepare bastante fresco colagenase 0,15% solução tipo IV para 1ml por peixes de uma solução de reserva ou de pó num meio de águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 1% v/v penicilina e estreptomicina (ver materiais). Faça (1 por peixe) de alíquotas de 1 mL em tubos de centrífuga de 2 mL. Manter a 4 ° C até 30 min antes da etapa de dissecação.</li>
	<li>Para fixação de microscopia confocal/amostra, preparar 50 mL de solução de paraformaldeído (PFA) fresca de 4% em PBS ou descongelar uma solução stock de congelador-20 ° C em uma coifa. Atenção: O PFA é tóxico. Por favor, leia a folha de dados material de segurança antes de trabalhar com ele. Luvas e óculos de segurança devem ser usados e deixar sempre soluções dentro de uma coifa.</li>
</ol>3. preparar a suspensão de nanopartículas fluorescentes
<ol><li>Rotular as nanopartículas de proteína com éster Atto-488 NHS (ver Tabela de materiais) ou uma tintura fluorescente apropriada de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Resuspenda as nanopartículas em tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M na concentração de 2 mg/mL.</li>
	<li>Dissolva o éster Atto 488 NHS em amina livre dimetilsulfóxido (DMSO) 2 mg/ml. Manter uma alíquota de 10 µ l para verificar a eficiência de rotulagem (etapa 3.7 – 3.8).</li>
	<li>Misture as nanopartículas e o éster Atto 488 NHS em uma relação molar de 1:2 (proteína: tintura) por agitação no escuro.</li>
	<li>Spin para baixo as nanopartículas rotuladas por centrifugação a 8.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e mantê-lo para verificar a eficiência de rotulagem (etapa 3.7 – 3.8).</li>
	<li>Lave as nanopartículas rotuladas por resuspending em 1 mL de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M num Vortex e pipetagem para cima e para baixo. Em seguida, descarte o sobrenadante por centrifugação a 8.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Repita a etapa 3.6 por 5 vezes.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 5 mL de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M em um tubo de centrífuga de 15 mL e faça alíquotas das nanopartículas fluorescentes em tubos de centrífuga de 1,5 mL (30 alíquotas). Spin para baixo a 8.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente, desprezar o sobrenadante e armazenar a-80 ° C, protegido da luz.</li>
	<li>
Medir a eficiência de rotulagem usando um spectrophotometer microvolume.
	<ol>
<li>Tomar 1 µ l da solução de Atto 488 original mantida da etapa 3.3 e diluí-lo ainda mais em DMSO (por exemplo, 01:20 de acordo com a relação de volume). Este é o volume usado para obter a relação molar de nanopartículas de proteína e Atto 488 misture no passo 3.4.</li>
		<li>Tome 1 µ l do sobrenadante da reação da rotulagem salvo na etapa 3.5. Medir a absorção (abs) no = 501 nm. É a porcentagem de rotulagem: (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58366/58366eq1.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antes do experimento, prepare a suspensão de nanopartículas na concentração desejada usando 1 x solução de PBS.</li>
</ol>4. Zebrafish Anesthetization e intubação Oral
<ol><li>Rápido o peixe (&gt; 0,5 g) pelo menos 48 h antes do experimento para esvaziar o intestino.</li>
	<li>Mova o peixe (12 peixe) para os tanques experimentais (6L) uma noite antes do experimento para permitir que a aclimatação12.</li>
	<li>Vórtice a solução de nanopartículas bem (por exemplo, 2.500 rpm e 30 s) e elaborar o volume desejado de nanopartículas suspensão (por exemplo, 20 – 50 µ l) para a seringa anexada para a agulha protegida.</li>
	<li>Coloque o peixe no aerado 150mg/L MS-222 solução (ver secção 2) até que eles descem para o fundo do tanque e não respondem a uma pitada de barbatana de cauda; Este processo leva menos de 5 min.</li>
	<li>Rapidamente o peixe anestesiado com uma rede de transferência para uma bandeja de plástico molhada, orientar o animal horizontalmente para enfrentar a agulha e começar imediatamente a intubação oral.</li>
	<li>Cuidadosamente, apoiar o peixe com uma mão e abrir a boca com a outra mão usando a agulha protegida. Insira cuidadosamente a agulha até ao esófago para cerca de 1 cm da boca abrindo. Nota: O operador pode sentir uma ligeira resistência ao final da ponta da pipeta passou o gill. Tome cuidado para não o ângulo da entrada de agulha demais que possam perfurar o gill.</li>
	<li>Injete lentamente a suspensão de nanopartículas para os peixes. Certifique-se que a suspensão não flui para fora através de brânquias ou da boca.</li>
	<li>Delicadamente, retire a agulha e coloque o peixe no tanque de recuperação (ver secção 2). Recuperação leva geralmente dentro de 1 min.</li>
	<li>Verifique o peixe cuidadosamente para qualquer anormalidade (por exemplo, sangramento em brânquias é um sinal de perfuração).</li>
	<li>Uma vez que os peixes se recuperaram, devolvê-los para os tanques experimentais.</li>
</ol>5. Zebrafish intestino dissecação
<ol><li>Após um período especificado de tempo pós intubação (por exemplo, 5 h e/ou 24 h), coloque o peixe usando uma rede em 300 mg/L de MS-222 solução para eutanásia (ver secção 2). Certifique-se o opérculo para de se mover e não há nenhum reflexo de pitada de cauda. Cinco minutos é normalmente suficiente.</li>
	<li>Pegar o animal euthanized com uma rede e colocá-lo em um papel de filtro. Nota: O papel de filtro é muito útil para remover o tecido adesivo ao longo do intestino.</li>
	<li>Usando uma tesoura afiada dissecação, fazer uma incisão semicircular do ânus para o opérculo e incisão aberta, usando uma pinça fina. Corte as duas extremidades do intestino, tirar todos os órgãos internos e coloque-os sobre o papel de filtro. Cuidado: Trabalho rapidamente para reduzir a morte e o metabolismo celular. Nota: Como alternativa, remova o tecido adesivo em PBS e no gelo.</li>
	<li>Separe o intestino dos órgãos internos, certificando-se de manter sua orientação (anterior posterior segmento intestinal) e esticá-la. Geralmente, o segmento anterior do intestino é mais largo do que o segmento posterior. Tome cuidado para obter todos do intestino quando dissecando. Nota: A extremidade posterior é muito fina e frágil em peixes pequenos e podem romper, particularmente em animais &lt; 0,7 g.</li>
	<li>Role o intestino no filtro de papel com uma pinça para desanexar o tecido adesivo no intestino.</li>
	<li>Proceda para preparar o intestino para várias análises a jusante (seções 6, 7 e 8).</li>
</ol>6. preparar células intestinais por citometria
<ol><li>Prepare com antecedência alíquotas da solução de colagenase de 0,15% (ver secção 2.4). Nota: Alíquotas devem estar à temperatura ambiente antes de prosseguir.</li>
	<li>Opcional: Continuação da etapa 5.5, cortar aberto o intestino longitudinalmente e lave com PBS 1x.</li>
	<li>Usando uma pinça, coloca o intestino no tubo de centrífuga de 2ml, preenchido com solução de colagenase de 0,15%.</li>
	<li>Coloque os tubos em rotacao laboratório vertical por 1h à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Coloque o intestino em um coador de célula de 100 µm apoiado sobre um tubo de centrífuga de 50 mL. Romper o intestino com um êmbolo da seringa de 5 mL, lavar 3 vezes com PBS 1x, coletando o fluxo através da amostra no tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de centrífuga de 50 mL a 400 x g durante 10 minutos, a 4 ° C.</li>
	<li>Pipete cuidadosamente durante a maior parte do líquido sobrenadante enquanto não perder as células, alguns dos quais podem ser associados com o muco.</li>
	<li>Ressuspender as células intestinais na parte inferior do tubo de centrífuga com 500 µ l de PBS 1x e manter no gelo até análise cytometry</li>
	<li>Amostras de filtro através de um filtro de célula 30 µm em 5 mL redonda tubos para citometria.</li>
	<li>Definir os parâmetros (por exemplo, o número de células para análise, a região de interesse, a tensão e a compensação, seleção de detectores) em um equipamento de citômetro (ver materiais).</li>
	<li>Imediatamente analise as células em um citômetro, seguindo as instruções de uso13.</li>
</ol>7. preparação de Cryosections intestino para microscopia Confocal
<ol><li>Encher o molde de plástico (ver Tabela de materiais) para metade do volume com a temperatura de corte ideal (O.C.T.) composta.</li>
	<li>Continuando da etapa 5.5 e imediatamente após a dissecação, coloque cuidadosamente o intestino no molde plástico. Certifique-se que o intestino é totalmente incorporado no composto O.C.T.. Se necessário, adicione mais O.C.T. composto para o molde plástico. Nota: É recomendável colocar o intestino com uma forma de "Z" no O.C.T. compostos facilmente seguir sua orientação natural.</li>
	<li>Coloque o molde de plástico em gelo seco até ficar opaco (menos de um minuto).</li>
	<li>Armazene o molde plástico a-80 ° C para uso a longo prazo ou processo imediatamente usando o procedimento a seguir. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Fatie o intestino congelado em 10 seções µm ou espessura apropriada usando um criostato a-20 ° C.</li>
	<li>Recolha a seção de intestino com um pincel fino para um slide.</li>
	<li>Mergulhe o slide em 4% PFA durante 15 minutos à temperatura ambiente para fixar a amostra. Atenção: O PFA é tóxico. Por favor, leia a folha de dados material de segurança antes de trabalhar com ele. Luvas e óculos de segurança devem ser usados e deixar sempre soluções dentro de uma coifa.</li>
	<li>Lave o slide 3 vezes com 1X PBS, 10 min cada.</li>
	<li>Adicionar uma gota de meio de montagem e coloque uma lamela sobre o espécime. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Observe a amostra sob um microscópio confocal na ampliação adequada.</li>
</ol>8. preparar o intestino para qPCR em tempo Real (RT-qPCR)
<ol><li>Continuando da etapa 5.5, colocar o intestino em um frasco criogênico e congelar rapidamente o intestino em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C até o uso. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Para homogeneização, adicionar solução de 1-Thioglycerol/homogeneização 200 µ l de 2% (v/v) refrigerados (ver Tabela de materiais) ou solução alternativa de homogeneização para a amostra de intestino.</li>
	<li>Trabalhar rapidamente, homogeneizar a amostra de intestino no gelo com um homogeneizador de laboratório em alta velocidade (fixado em 25-30.000 rpm) até nenhum tecido visível fragmentos permanecem. 3 vezes por 5 s é geralmente suficiente.</li>
	<li>Isolar o RNA usando um comercial kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com instruções14 as indicações do fabricante ou um método alternativo adequado. Conforme necessário, armazene o RNA a-80 ° C para uso a longo prazo. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Quantificar a concentração de RNA usando um espectrofotômetro15 e avaliar a qualidade usando um analisador de RNA16.</li>
	<li>Prepare-se 1 µ g ou uma quantidade adequada de cDNA usando um kit de síntese do cDNA de acordo com as instruções do fabricante. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Para análise de qPCR, por favor, siga as orientações MIQE17.</li>
	<li>Desenha pares de primer adequado para o gene/s de interesse.</li>
	<li>Selecione um gene de referência adequada e analisar a expressão de cada gene por uma detecção de RT-qPCR kit de sistema usando um comercial (ver materiais). Nota: por exemplo, adicione 5 µ l de supermix SYBR green, as primeiras demão de 0,5 µM, 2,5 µ l de cDNA diluído e 1,5 µ l de água em um volume final de 10 µ l de cada poço da placa de qPCR.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem.

Este protocolo é um aperfeiçoamento da técnica descrita anteriormente para intubação oral por Collymore et al 4 nosso protocolo descreve em detalhes o método de intubação oral e inclui a preparação do intestino para análises a jusante. Nosso método melhora a velocidade de manipulação de peixes permitindo que uma pessoa para executar o protocolo rapidamente, sem muita variação entre os operadores. A principal diferença do nosso protocolo com a anterior é que avaliamos o sucesso de um exper...

O objetivo deste artigo é descrever em profundidade um método simples para intubação oral de zebrafish, juntamente com procedimentos de jusante associados útil. Intubação oral usando zebrafish tornou-se um modelo prático no estudo da dinâmica de doenças infecciosas, vacina oral/imuno-estimulantes, drogas/nanopartículas absorção e eficácia e imunidade da mucosa intestinal. Por exemplo, zebrafish intubação oral tem sido usada no estudo de Mycobacterium marinum e Mycobacterium peregrinum infecção1. Lovmo et al . também utilizado com sucesso este modelo para entregar o trato gastro-intestinal de adultos do zebrafish2-nanopartículas e M. marinum . Além disso, Chen et al costumava intubação oral zebrafish para mostrar que drogas encapsuladas por nanopartículas, quando administrada através do trato gastro-intestinal, foram transportados através do sangue cérebro barreira3. Estes autores realizaram intubação baseada no método descrito por Collymore et al gauvage 4 , com algumas modificações. No entanto, eles não forneceu um protocolo altamente detalhado, descrevendo o procedimento de intubação oral. Aqui, apresentamos um método para intubação oral de adultos do zebrafish baseando Collymore et al 4 outras incluem a preparação do intestino para análise pertinente a jusante por citometria, microscopia confocal e qPCR.
O intestino e particularmente sua mucosa é a primeira linha de defesa contra a infecção e o local principal de absorção de nutrientes5. Quando as células epiteliais e células apresentadoras de antígeno dentro da mucosa barreiras percebem sinais de perigo, uma imediata resposta imune inata é acionada. Em seguida, a resposta imune adaptativa altamente específica é estabelecida por de6,de linfócitos T e B7. Desenvolvimento de vacinas orais é uma área de foco atual em Vacinologia. Essas vacinas seria uma ferramenta eficaz para proteger o organismo em locais expostos devido à resposta específica de células do sistema imunológico em tecidos linfoides associados a mucosa (MALT)8,9. Na aquicultura, vacinas da mucosa tem vantagens óbvias em comparação com as vacinas injetáveis. Eles são práticos para vacinação em massa, menos trabalhosa, são menos estressantes para os peixes e podem ser administrados para peixes jovens. No entanto, candidatos vacinais da mucosa devem chegar o segundo segmento de intestino sem ser desnaturada no meio oral. Eles também devem transpor as barreiras da mucosa para obter acesso a apresentadoras de antígenos (APCs) para induzir respostas locais e/ou sistêmica10de células. Portanto, testes de captação da mucosa alcançada pelo candidato oral antígenos e seus sistemas de entrega, bem como a resposta imune evocada, é essencial no desenvolvimento de vacinas orais.
Em um contexto biomédico, desenvolvendo um modelo para testar os efeitos biológicos de compostos após intubação oral é de interesse crescente. Muitas das características anatômicas e fisiológicas do intestino são conservadas entre linhagens é formado por, com mamíferos e peixes ósseos11. Este modelo de entubação oral ligado à análise a jusante pode ser uma ferramenta para fornecer insights sobre a biologia humana, bem como um campo de testes para produtos biológicos ou outros compostos na vivo.
O protocolo de intubação oral pode ser realizado por um operador, por exemplo, administrar com sucesso até 50 µ l de suspensão de nanopartículas de proteína para peixes pesando 1 g, com uma taxa de sobrevivência de alta. O procedimento é simples de configurar e rápido; 30 peixes podem ser intubados em 1h. O protocolo para a preparação do intestino é a chave para fornecer amostras de células e tecidos de qualidade para posterior análise. Exemplos de resultados a jusante são dados que mostram a utilidade do protocolo na obtenção de dados relacionados à absorção intestinal e no isolamento do RNA de qualidade para qPCR. O protocolo seria de grande utilidade para aqueles que necessitam de um modelo adequado para testar a dinâmica da profilaxia oral ou outros compostos no intestino.

<table><tbody><tr><td>Tubo de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>508-001</td><td>0,30 mm de diâmetro interno e 0,64 mm de diâmetro externo</td></tr><tr><td>Agulha Luer lock</td><td>Hamilton</td><td>7750-22</td><td>31 G, Kel-F Hub</td></tr><tr><td>Luer lock seringa</td><td>Hamilton</td><td>81020/01</td><td>100 &mu; L, Ponta</td></tr><tr><td>de pipeta filtrada</td> Kel-F Hub <td>Nerbe Plus</td><td>07-613-8300</td><td>10 &mu; L</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>pó</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro&nbsp;</td><td>Filter-Lab</td><td>RM14034252</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Dulbecco's modified eagle medium</td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics filters&nbsp;</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326 (Wolflabs)</td><td>30 &micro; m filtros de malha com reservatório de 2 mL</td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek O.C.T. SAKURA</td><td></td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de plástico para criossecções</td><td>SAKURA</td><td>4557</td><td>Moldes de vinil descartáveis. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>10149870</td><td>SuperFrost Plus</td></tr><tr><td>slide Cover óculos</td><td>Labbox&nbsp;</td><td>COVN-024-200</td><td>24&agudo; 24 mm</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Atto-488 NHS éster</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41698</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td></td></tr><tr><td>1-Tioglicerol / Homogeneização solução</td><td>Promega</td><td>Dentro do Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td><td>adicionando 20 &mu; l 1-Tioglicerol para 1 mL de solução de homogeneização (2%)</td></tr><tr><td>rotador vertical de laboratório&nbsp;</td><td>Suministros Grupo Esper</td><td>10000-01062</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td>CM3050S</tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>KINEMATICA</td><td>Polytron PT1600E</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACS Canto</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubo de fundo redondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de Fumaça</td><td>Kottermann</td><td>2-447 BST</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Espectrofotômetro</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Sistema Bioanalisador Agilent</td><td></td><td>G2939A</td><td>bioanalisador de RNA</td></tr><tr><td>Maxwell Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA iScript&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>CFX384 PCR em Tempo Real&nbsp; Sistema</td><td>de Detecção Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr><tr><td>iTaq universal SYBR Green Supermix kit</td><td>Bio-rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>Água&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Frasco criogênico&nbsp;</td><td>Frasco Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td>CryoTube</td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td>Fluoroshield com DAPI</td></tr></tbody></table>

intubação oral de zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção intestinal de compostos bioativos

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

A maioria dos patógenos invadem organismos por meio de sua mucosa. Isto é particularmente verdadeiro em peixe como eles estão continuamente expostos a um ambiente de água rica em microbiana. Desenvolver métodos eficazes para entrega oral de Imunoestimuladores ou vacinas, que ativam o sistema imunológico contra doenças infecciosas, é altamente desejável. Na concepção de ferramentas profiláticas, bons modelos experimentais são necessários para testar seu desempenho. Aqui, nós mostramos um método para intubação oral de zebrafish adulto e um conjunto de procedimentos para dissecar e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e análise (qPCR) reação em cadeia de polimerase quantitativa. Com este protocolo, estamos precisamente pode administrar volumes até 50 µ l de pescar pesando cerca de 1 g simplesmente e rapidamente, sem prejudicar os animais. Este método nos permite explorar a absorção direta na vivo de compostos fluorescente rotulados pela mucosa intestinal e a capacidade de imunomoduladores de tais produtos biológicos no local após a intubação. Combinando métodos a jusante como citometria de fluxo, histologia, qPCR e microscopia confocal do tecido intestinal, podemos entender como Imunoestimuladores ou vacinas são capazes de atravessar as barreiras da mucosa intestinais, passar a lâmina própria, e atingir o músculo, exercendo um efeito sobre o sistema imunológico da mucosa intestinal. O modelo pode ser usado para testar a profilaxia oral candidato e sistemas de entrega ou o efeito local de qualquer composto Bioativo administrado por via oral.

Zebrafish (peso médio: 1.03 ± 0,16 g) de sexo misturado com êxito foram intubados com nanopartículas de diferentes proteínas recombinantes (corpos de inclusão bacterianas) usando nosso dispositivo de intubação oral caseiro (Figura 1). Nós temos com sucesso realizada a intubação oral e alcançado uma percentagem média baixa mortalidade (6,8%) (Tabela 1). Zebrafish foram também intubado com 30 µ l ou 50 µ l de suspensões de nanopartículas e a mo...

O protocolo descreve intubação zebrafish adulto com um biológico; em seguida, dissecando e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e qPCR. Este método permite a administração de compostos bioativos para monitorar a absorção intestinal e o estímulo imune local evocado. É relevante para a dinâmica intestinal da profilaxia oral de teste.

Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da vacinação da mucosa, como como a mucosa intestinal capta compostos biológicos e como tais biológicos modulam o sistema imunológico no local após a intubação. A principal vantagem dessa técnica é que é simples de configurar, rápido e mostra baixas taxas de mortalidade. Este método pode fornecer informações sobre a vacinação mucosa.Também pode ser aplicado a outros compostos, como produtos químicos, tóxicos ou patógenos. A demonstração visual deste método é fundamental, pois nas etapas de intubação oral e dissecção intestinal, é preciso ter cuidado porque na intubação você pode ferir o zebrafish e causar a morte. Na dissecção, a extremidade do intestino é muito fina e frágil.Coloque aproximadamente um centímetro de tubo de silicone fino em uma agulha de bloqueio Luer calibre 31. Corte uma ponta de pipeta de filtro de 10 microliter estéril, pegue a extremidade mais fina e coloque-a sobre o tubo de silicone como uma baia. Para começar, conecte o aparelho da agulha a uma seringa luer-lock de 100 microliter.Primeiro, mova o peixe para os tanques experimentais uma noite antes do experimento. Vórtice a solução de nanopartículas preparada bem, e elaborar o volume desejado da suspensão. Depois de anestesiar com segurança o peixe, use uma rede para transferir rapidamente o peixe para uma bandeja de plástico molhada.Oriente o animal horizontalmente para enfrentar a agulha. Apoie cuidadosamente o peixe com uma mão e abra a boca com a agulha protegida. Em seguida, insira suavemente a agulha pelo esôfago a cerca de um centímetro da abertura da boca.É difícil ver até onde a agulha deve ir, e isso é uma questão de prática. Você sentirá a agulha quando ela encontrar uma parada, e então, manipulando a agulha, você encontrará o ângulo correto para inserir o dispositivo um pouco mais. Injete lentamente a suspensão da nanopartícula no peixe, garantindo que a suspensão não flua para fora através das brânquias ou da boca.Depois disso, retire suavemente a agulha e coloque o peixe em um tanque de recuperação. Enquanto o peixe se recupera, monitore o peixe para qualquer anormalidade. Uma vez recuperado o peixe, devolva-o a um dos tanques experimentais.Depois de eutanásia do peixe de acordo com o protocolo de texto, coloque o peixe em um pedaço de papel filtro. Usando uma tesoura de dissecção afiada, faça uma incisão semi-circular do ânus até o operículo, e abra a incisão com pinças finas. Em seguida, corte as duas extremidades do intestino, tire todos os órgãos internos e coloque-os no papel do filtro.Em seguida, separe o intestino dos órgãos internos, e estique-o, tomando o cuidado de obter todo o intestino. Por fim, use pinças para enrolar o intestino no papel filtro para desprender o tecido adesivo. Usando este protocolo, os zebrafish de sexo misto foram entubados com sucesso com diferentes nanopartículas de proteína recombinante.Utilizando-se o dispositivo de intubação oral caseiro, foi alcançada uma baixa porcentagem média de mortalidade. Para avaliar a entrega dos corpos de inclusão de nanopartículas fluorescentes feitas com tnf alfa recombinante, foi realizada uma análise de citometria. A quantidade total de células fluorescentes foi significativamente maior no grupo intubado por nanopartículas do que no grupo controle, cinco e 24 horas após a intubação.O equipamento de entubação é barato, preciso e reutilizável. Todo o procedimento de intubação pode ser feito muito rapidamente por um operador e, importante, o método é consistente entre diferentes operadores. A combinação do nosso método de intubação com análise a jusante pode ser ideal para o desenvolvimento de vacinas orais.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Demonstramos injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto. Usamos a 10 mL NanoFil micro controlado por um controlador MICRO4 e III UltraMicroPump. Esta demonstração inclui o uso de água fria como um anestésico.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

Apresentamos um novo método de microgavagem de larvas de peixe-zebra utilizando equipamentos padrão de microinjeção de embriões e estereomicroscopia. Demonstramos que a microgavagem é uma técnica segura e eficiente, útil para administrar quantidades controladas de diversos materiais diretamente na luz intestinal de larvas de peixe-zebra.

Microgavage de larvas do peixe

Este vídeo descreve a técnica de isolamento do intestino para avaliar a absorção intestinal de compostos bioativos. Nesta amostra, isolaremos o intestino de um peixe-zebra adulto para analisar a captação de imunoestimulantes.

Dissecção do intestino do peixe-zebra adulto: uma técnica para analisar a absorção de compostos

Este vídeo demonstra uma técnica para intubar oralmente peixes-zebra adultos para administrar compostos experimentais no esôfago e monitorar sua captação intestinal. Este método oferece um modelo valioso para estudar a dinâmica da profilaxia oral ou outros compostos dentro do intestino.

Intubação Oral de Peixe-Zebra Adulto para Administrar Compostos Experimentais

O uso crescente de peixe-zebra como um modelo animal requer o desenvolvimento de métodos eficazes para a entrega de quantidades conhecidas de compostos e soluções. O procedimento de gavagem descrito abaixo permite a distribuição oral de volumes precisos de solução fiável, segura e eficiente de peixe-zebra adultos.

Gavaging Zebrafish Adulto

Um método para gerar um modelo de cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina em adulto peixe-zebra (Danio rerio) é descrito aqui. Apresentam-se duas formas alternativas de injeção intraperitoneal e condições para reduzir as variações entre diferentes grupos experimentais são discutidas.

Um modelo de cardiomiopatia induzida por doxorrubicina no Zebrafish adulto

O objetivo do presente protocolo é medir o tempo de trânsito de fluorescente etiquetado alimento através do intestino de zebrafish larval de forma alto throughput.

Elevado-throughput medição de tempo de trânsito do intestino usando Zebrafish Larval

Um novo método de injeção intraperitoneal (IP) em peixe-zebra adulto é descrito. Ao manusear compostos tóxicos como a doxorrubicina, esse procedimento é mais eficaz do que os dois métodos de IP relatados anteriormente. A técnica foi projetada para ser facilmente adotada por pesquisadores com experiência limitada no modelo de peixe-zebra.

Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado e eficaz para a injeção intravenosa de células ou agentes farmacológicos em peixes-zebra adultos, resultando em enxerto celular aprimorado e aumento das taxas de sobrevivência do peixe-zebra tratado.

Injeção intravenosa otimizada em peixe-zebra adulto

Este protocolo apresenta um método acessível para criar um ambiente à prova de gás para administrar anestésicos voláteis a larvas de peixe-zebra para experimentos comportamentais.

Administração de anestésicos voláteis a larvas de peixe-zebra para observação comportamental

Este estudo apresenta um método de alimentação à base de gelatina que permite a administração oral precisa, não invasiva e baseada em massa corporal em peixes-zebra adultos. O protocolo demonstra aceitação confiável do feed e, como prova de princípio, entrega bem-sucedida do MK-801, o que resultou nos efeitos comportamentais esperados.

Uma abordagem simples e precisa baseada em ração para a administração oral de medicamentos em peixes

Aprenda a intubação oral em zebrafish adultos para avaliar a absorção intestinal de compostos bioativos. Este método simples permite estudar respostas imunes locais e dinâmica da mucosa intestinal.

Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos

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