Síntese e determinação da estrutura de µ-conotoxina PIIIA isômeros com bissulfeto diferentes conetividades

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de síntese de peptídeos, como sintetizar peptídeos ricos em dissulfetos e determinar seu padrão correspondente de ponte de dissulfeto. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a síntese seletiva de diferentes isômeros de peptídeos de desufiide e sua subsequente caracterização química e estrutural. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão porque cada peptídeo rico em dissulfeto se comporta de forma diferente.

A síntese e a análise podem ter que ser parcialmente otimizadas para peptídeos individuais ou proteínas. Transfira os reagentes listados no protocolo de texto para os vasos correspondentes e coloque-os nas raquetes apropriadas do sintetizador de peptídeo de fase sólida. Em seguida, adicione 100 miligramas de resina seca às colunas de reação e coloque-as na raquete do sintetizador.

Inicie a síntese de peptídeos em fase sólida conforme detalhado no protocolo de texto. Depois que a síntese estiver completa, liofilizou a resina durante a noite. Agora aperte o peptídeo da resina e realize proteção profunda das correntes laterais.

Para isso, combine a resina seca em um tubo de 12 mililitros e esfrie-a a zero graus Celsius no gelo. Primeiro, adicione 150 microliters de uma mistura de catadores, em seguida, adicione um mililitro de ácido trifluoroacético de 95% por 100 miligramas de resina. Deixe a mistura tremendo suavemente por três horas em temperatura ambiente.

Agora, filtre a mistura através de um frito de vidro. Colete o filtrado em tubos, preenchido individualmente com éter dietil gelado em um mililitro de mistura de decote por oito a 10 mililitros de éter dietil. O peptídeo precipita-se como um sólido branco.

Depois de enxaguar e centrifugar os tubos como descrito no protocolo de texto, congele os peptídeos. Para purificar o precursor linear com cromatografia semi-preparatória adicione aproximadamente 70 miligramas do peptídeo bruto a um tubo de 15 mililitros. Em seguida, dissolva o peptídeo bruto em 0,1% TFA e acetonitrilo de um para um na água.

Separe a mistura de peptídeos usando um gradiente de zero a 50% Eluent B ao longo de 120 minutos a uma vazão de 10 mililitros por minuto. Colete as frações em tubos individuais à medida que aparecem e prepare frações selecionadas para espectrometria de massa e análise HPLC conforme descrito no protocolo de texto. Congele as frações e combine as frações dos pares.

Inicie a formação seletiva de ligações de dissulfeto realizando a primeira oxidação. Para isso, dissolva 15 miligramas do peptídeo linear liofilizado em 105 mililitros de uma mistura de água isopropanol. Deixe a mistura mexendo no ar em condições básicas por 12 a 48 horas.

O procedimento de oxidação stepwise é muito crítico. Os controles de reação são tomados em todas as três etapas de oxidação para garantir a formação rica em dissulfetos individuais. A terceira oxidação é a mais crucial porque a desufiide pode ocorrer quando o tempo ideal de reação é excedido.

Agora realize a segunda oxidação. Dissolva 15 miligramas do peptídeo congelado em 105 mililitros de uma água isopropanol, uma mistura de ácido clorídrico molar. Adicione 158 microliters de uma solução de iodo molar 0.1 em metanol à solução.

Mexa a reação à temperatura ambiente até que a oxidação esteja completa. Em seguida, pare a reação adicionando 79 microliters de um molar ácido ascórbico na água. Finalmente realize a terceira oxidação.

Dissolva 15 miligramas do peptídeo congelado em 5,5 mililitros de TFA contendo uma mistura de catadores. Precipitar o peptídeo em tubos contendo éter dietil frio em um mililitro de solução de reação por oito a dez mililitros de éter dietil. Para realizar a purificação do peptídeo a 15 miligramas do produto bruto liofilizado a um tubo de 15 mililitros.

Dissolva o produto bruto no volume do laço de amostra HPLC usando uma mistura de 0,1% TFA e um a um Acetonitrilo na água. Após o vórtice até a dissolução completa, centrifugar a solução de um minuto a 3400 vezes G.Desenhe a mistura de 3,6 mililitros em uma seringa de 5 mililitros e injete a amostra sem bolhas de ar no laço de injeção. Inicie a injeção no sistema HPLC.

Purifique a mistura de peptídeos usando um gradiente de zero a 50% Eluent B ao longo de 120 minutos a uma vazão de 10 mililitros por minuto. Colete as frações em tubos individuais à medida que aparecem. Após a execução ser concluída, prepare frações selecionadas para análise de MS e HPLC conforme descrito no texto.

Congele todas as frações e armazene-as a menos 20 graus Celsius. Para realizar hplc analítico, transfira amostras das frações de peptídeo ou controles de reação em um frasco HPLC e dissolva-o na mistura de 0,1% TFA em um a um Acetonitrilo para a água. Coloque o frasco HPLC no amostrador automático da fase reversa analítica do CONJUNTO HPLC para injetar 250 microliters de cada amostra.

Use um sistema de eluição de gradiente de 0,1% TFA na água como Eluente A em Acetonitrilo como Eluent B.Analise o peptídeo usando um gradiente de 10% a 40% Eluent B ao longo de 30 minutos a uma vazão de 1,0 mililitro por minuto. Para realizar a análise de aminoácidos, transfira 100 microgramas do peptídeo puro para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e dissolva o pó em 200 microlitrais de seis HCL molares. Depois de transferir a solução para uma ampola de vidro, feche a ampola aquecendo o pescoço com uma chama de bico de bunsen.

Em seguida, coloque um tubo de vidro segurando a ampola em um bloco de aquecimento por 24 horas a 110 graus Celsius para hidrólise. Após 24 horas, abra a ampola e transfira a solução para um tubo microcentrífugo de dois mililitros. Centrifugar a solução por seis horas a sessenta graus Celsius e 210 vezes G em um concentrador de vácuo rotacional.

Em seguida, dissolva o produto hidrolisado em 192 microliters do tampão de diluição amostrado e transfira a solução para um filtro micro centrífugo. Depois de centrifugar a amostra por um minuto a 2300 vezes G, transfira 100 microliters do filtrado para um tubo amostrador de análise de aminoácidos. Coloque o tubo no analisador de aminoácidos e inicie a análise.

Durante este protocolo de redução passado, é crucial tomar vários controles de reação a fim de obter duas ou quatro vezes kappa mido metilated espécies que são indispensáveis para análise subsequente de dissulfeto através de espectrometria de massa. Primeiro dissolva 600 microgramas do peptídeo puro em 1,2 mililitros de 0,05 tampão citrato molar contendo TCEP. Incubar a mistura à temperatura ambiente, levando várias amostras de controle de reação de 100 microliter que variam de zero a 30 minutos.

Misture as amostras em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro com 300 microliters de tampão de alquilação para parar a reação e realizar a metilação carbonil dos grupos de tiool livre. Pare a reação após cinco minutos adicionando 100 microlitadores de 10% TFA e água e armazene as amostras em gelo seco. Agora execute o HPLC nas amostras conforme detalhado no protocolo de texto.

Transfira uma pequena quantidade de cada fração coletada para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro para análise de MS/MS das formas oxidadas. Dissolva o peptídeo restante em 0,1% TFA na água e adicione um volume apropriado sobre uma solução DE 100 milimões de TCEP para obter uma concentração final de TCEP de 10 mililitros. Neste ponto, a alquilação da cisteína seletiva pode ser verificada através de sequenciamento de peptídeos.

Com os dois peptídeos no meio, uma determinação do padrão da ponte de dissulfeto é possível. A análise de RMN dos diferentes isômeros é realizada para revelar as estruturas de peptídeos individuais. As 20 estruturas com as energias mais baixas, bem como a conectividade de dissulfeto dos diferentes isômeros são mostradas.

Notavelmente, uma combinação de fragmentação de MS/MS de fase invertida e análise de RMM é necessária para identificação inequívoca da conectividade dissulfeto. A comparação do valor médio de desvio quadrado esclareceu que um peptídeo rígido leva principalmente a uma estrutura NMR melhor resolvida. Este vídeo deve lhe dar um exemplo de como sintetizar seletivamente peptídeos com um padrão de ligação de dissulfeto desejado.

Também mostra a possibilidade de verificar a conectividade correta do dissulfeto através de espectrometria de massa macia e obter uma estrutura tridimensional via espectroscopia NMR. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da síntese de peptídeos explorarem a importância dos padrões de ligação de dissulfeto para a estrutura tridimensional e, consequentemente, a atividade de tais isômeros de peptídeos. Após esse procedimento, outros métodos como a atividade ASAS podem ser realizados a fim de obter uma visão das relações de atividade da estrutura de diferentes isômeros de peptídeos no alvo biológico específico.

Embora este método possa fornecer uma visão da síntese e análise de conotoxinas, ele também pode ser aplicado a outros peptídeos de ponte de dissulfeto e proteínas como os fenzens, toxinas animais ricas em dissulfetos e outras múltiplas cisteínas contendo moléculas.